استخدام فائقة MRI الميداني في القوارض الصغيرة نماذج من مرض الكلى المتعدد الكيسات ل<em&gt; في فيفو</em&gt; Phenotyping والدواء المراقبة

Summary

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Abstract

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Introduction

مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) يتضمن مجموعة من الاضطرابات أحادية المنشأ تتميز تطوير الكيسات الكلوية. فيما بينها هي من جسمي قاهر مرض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) وراثي متنحي تكيس أمراض الكلى (ARPKD)، والتي تمثل الأنواع الأكثر شيوعا ^1،2. ADPKD، الشكل الأكثر شيوعا من أمراض الكلى الكيسي وراثية، ونشأت عن طفرات في PKD1 أو PKD2 الجينات. ويتميز هذا في وقت متأخر من البداية، متعددة الكيسات الكلوية الثنائية، يرافقه متغير الخراجات خارج الكلى، فضلا عن تشوهات الهيكل العظمي القلب والأوعية الدموية والعضلات. ARPKD، الأكثر شيوعا التي تؤثر على الأطفال حديثي الولادة والأطفال الصغار، والتي تسببها طفرات في PKHD1 ويتميز الكلى مولد للصدى تضخم وتليف كبدي خلقي ^3.

الأهم من ذلك، يتميز ADPKD من قبل التجانس، سواء في الجين (الجيني) وطفرة (أليلية) المستويات، مما يؤدي إلى ص كبيرتقلب henotypic. ترتبط طفرات في الجين PKD1 مع العرض شديد السريري (العديد من الخراجات، والتشخيص المبكر وارتفاع ضغط الدم، وبيلة ​​دموية)، فضلا عن التقدم السريع لإنهاء مرحلة المرض الكلوي (قبل 20 سنة من المرضى الذين يعانون من الطفرات PKD2) ^4. مرض شديد تكيس الكبد (الملعوبة) وتشوهات الأوعية الدموية يمكن أن تترافق مع طفرات في كل من PKD1 وPKD2 ^5. غالبية المضاعفات الكلوية من ADPKD تنشأ أساسا نتيجة للتوسع الكيس جنبا إلى جنب مع التهاب وتليف المرتبطة بها. تبدأ تطوير الكيس داخل الرحم وتستمر خلال فترة حياة المريض. الكلى عادة الحفاظ على شكل كلوي الشكل على الرغم من أنهم يمكن أن تصل إلى أكثر من 20 أضعاف حجم الكلى العادي. معظم المرضى الحالي توزيع الثنائي من الكيسات الكلوية، ولكن في بعض الحالات غير عادية، والكيس قد تتطور في نمط أحادي الجانب أو غير المتماثلة.

يشكل تحديا كبيراشركة جنرال الكتريك لالكلى عقب المرضى الذين يعانون من ADPKD أو تنفيذ العلاجات هو التاريخ الطبيعي للمرض. خلال معظم مجراه، تبقى وظيفة الكلى طبيعية وبحلول الوقت الذي تبدأ وظيفة الكلى في الانخفاض، فإن معظم الكلى قد حلت محلها الخراجات. عندما يتم تنفيذ العلاجات في مراحل لاحقة، فإنه من غير المحتمل أن تكون ناجحة منذ المريض قد بالفعل قد وصلت إلى نقطة اللاعودة في مرض الكلى المزمن. في المقابل، عندما بدأ العلاج في المراحل المبكرة، فإنه من الصعب تحديد استجابة تستند فقط على معدل الترشيح الكبيبي. ونتيجة لذلك، فإن فكرة حجم الكلى كعلامة من تطور المرض اكتسبت اهتمام.

وقد أظهرت التجمع من أجل إشعاعي الدراسات التصوير من مرض الكلى المتعدد الكيسات الدراسة (CRISP) أنه في المرضى الذين يعانون من ADPKD الزيادة في الكلى والكيس كميات يرتبط بشكل مباشر مع الكلوي تدهور وظيفة، مع التشديد على أهمية إجمالى حجم التداول الكلى (TKV) كماعلامة urrogate لتطور المرض ^6،7. ونتيجة لذلك، يتم استخدام TKV حاليا منصب نقطة النهاية الأولية أو الثانوية في تجارب سريرية متعددة لADPKD ^2،8،9.

ألقت نماذج الفئران متعددة بما في ذلك الطفرات العفوية وراثيا الضوء على التسبب في PKD ^10،11. أصبحت PKD1 أو Pkd2 نماذج (الطفرات في أي PKD1 أو Pkd2) الأكثر شعبية، لأنها الأمراض التي تصيب البشر تقليد تماما. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نماذج القوارض مع الطفرات في جينات أخرى من PKD1 أو Pkd2 الجينات باعتباره منصة تجريبية لتوضيح مسارات الإشارات المتعلقة بهذا المرض. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام العديد من هذه النماذج لاختبار العلاجات المحتملة. ومع ذلك، فإن العامل المحدد في العديد من الدراسات القوارض لPKD هو في كثير من الأحيان عدم وجود طرق غير الغازية فعالة لتحليل بالتتابع التغيرات التشريحية والوظيفية في الكلى.

ص المغناطيسيالتصوير esonance (MRI) هو الأسلوب الحالية التصوير معيار الذهب لمتابعة المرضى ADPKD، وتوفير ممتازة النقيض من الأنسجة الرخوة والتفاصيل التشريحية، والسماح للقياسات TKV. على الرغم من أن التصوير بالرنين المغناطيسي هي راسخة للتصوير التشريحية في الحيوانات والبشر أكبر، القوارض الصغيرة التصوير في الجسم الحي تنطوي على تحديات تقنية إضافية، حيث القدرة على الحصول على صور عالية الدقة قد يحد من فائدته. مع إدخال الحقل فائق (UHF) MRI (7-16،4 T) وتطوير التدرجات أقوى، أصبح من الممكن الآن لتحقيق أعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء والتحليل المكاني للصور MRI مع نوعية التشخيص مماثلة لتلك التي التي تم الحصول عليها في البشر. ونتيجة لذلك، أصبح استخدام UHF MRI للتصوير في الجسم الحي من نماذج القوارض الصغيرة لPKD أداة قوية للباحثين.

Protocol

قبل البدء في أي إجراءات مع الحيوانات الحية، يجب أن تتم الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC).

1. تكوين الماسح الضوئي

1. قبل البدء، تأكد من أن سخان هو في موقف OFF.
2. حدد التدرج التصوير صغير و38 ملم لفائف RF وحامل التصوير المصغر.
3. في تجويف المركزي للحامل تثبيت التجميع درجة حرارة متغيرة.

2. إعداد الحيوان

1. للتجارب التصوير بالرنين المغناطيسي، وتحقيق التخدير الأمثل باستخدام الأيزوفلورين المتبخرة. لتحريض التخدير، ووضع الحيوان في غرفة الاستقراء واصطف مع الأنسجة الماصة. ضبط مقياس الجريان من المرذاذ الأيزوفلورين إلى 2،0-2،5 لتر / دقيقة، والأيزوفلورين إلى 3٪ في الأكسجين.
2. إزالة أي علامة معدنية أو جسم معدني آخر في هذه المرحلة. تطبيق البيطري مرهم على عيون الحيوان لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. مرة واحدة الحيوانوصلت الطائرة من التخدير الجراحي (أي فقدان الانسحاب المنعكس إلى أخمص قدميه قرصة)، ووضع الحيوان على حامل مع أنفها إدراجه ضمن مخروط الأنف. ضبط تدفق الهواء التخدير في التحقيق إلى 2،0-2،5 مل / دقيقة وتركيز الأيزوفلورين إلى 1،5-2،0٪ في الأكسجين. وسيتم تسليم التخدير من خلال مخروط الأنف أثناء العملية. دوري ضبط تركيز الأيزوفلورين اعتمادا على عمر الحيوان والوزن للحفاظ على معدل التنفس من ~ 40 نبضة في الدقيقة.
4. استخدام أصحاب الحيوانات لتأمين الحيوانات في مكان ومنع الحركة أثناء التجربة MRI. تختلف نوع من صاحب الحيوان اعتمادا على المنطقة الجسم التي يتم مسحها ضوئيا.
   ملاحظة: يمكن جعل أصحاب مخصص من مختبر البلاستيك (البولي بروبلين، تفلون، البوليسترين، البولي) لاستيعاب تجربة محددة وتتناسب مع حجم الحيوان (من الماوس الجديد إلى 160 غ الفئران).
5. وضع ميزان حرارة المستقيم في الحيوان لمراقبة درجة حرارة الجسم الحيوان. خلال إكسبeriment، والحفاظ على الحيوانات في 35-37 درجة مئوية، وذلك باستخدام تيار من الهواء الدافئ. ضبط درجة حرارة الهواء (30-38 درجة مئوية) وتدفق (1،200-2،000 L / ساعة) على أساس درجة حرارة الجسم ردود فعل الحيوان.
6. إرفاق بالون التنفسي استشعار الضغط على البطن الحيوان لمراقبة معدل التنفس.
7. تأمين الحيوان في وسط لفائف RF ووضع بعناية لفائف RF مع الحيوان إلى التصوير بالرنين المغناطيسي الماسح الضوئي.

3. MRI التجربة

1. لحن، وتتناسب مع لفائف RF قبل بدء التجارب للحد من قوة RF المستخدمة وتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء. لبدء مطابقة / ضبط:
   1. فتح أداة التحكم مطياف بالنقر على أيقونة أدوات.
   2. في أداة التحكم مطياف انقر اقتناء → تمايل. تفتح نافذة ACQ / ريكو عرض منحنى تمايل.
   3. بدلا من ذلك ضبط ضبط ومطابقة المكثفات (باستخدام ضبط ومطابقة قضبان) في خطوات صغيرة حتى السلطة RF تنعكستم تصغير. الهدف هو أن نرى منحنى مع حد أدنى على المحور الرأسي المتمركزة صفر على المحور الأفقي.
   4. عندما تم تحقيقه معايرة من لفائف بنجاح، اضغط على زر الإيقاف في إطار ACQ / ريكو.
2. الحصول على صور الكشفية في طائرات المتعامدة الثلاثة لخلق صور المحوري، الاكليلية والسهمي. استخدام تسلسل الصور السريعة مثل بوابة البينية السريعة انخفاض زاوية اطلاق النار (IG-FLASH) للحصول على الصور الكشفية ^12. استخدام الصور الكشفية لضبط هندسة المناسبة للتصوير الفعلي.
3. تبعا لأهداف بحثية محددة، حدد السليم تسلسل الصور والمعلمات وبدء المسح الضوئي مع ضوء حركة المرور. وهذا معايرة قناة RF، شيم المغناطيس، تعيين تردد الناقل على صدى للمياه وضبط كسب المتلقي، كل تلقائيا.
   1. للدراسات التشريحية والصور T2 المرجحة، والحصول على شريحة متعددة في 2D أو 3D واسطة. لاختصار الوقت تجربة لقرار المكاني معين، والحفاظ على الميدان-of الرؤية (فوف) صغيرة ممكن ولكن كبيرة بما يكفي لتجنب القطع الأثرية التفاف حول (2،56 حتي 3،2 سم).
4. تستمر دائرة تسلسل اختيار أقصر قليلا من دورة تنفس الحيوان عن طريق الانتقاء السليم لوقت التكرار (TR) و / أو عدد شرائح. وهذا يضمن أن البيانات يتم جمعها خلال فترة هدوء الحيوانات.
   1. على سبيل المثال، للصور في البطن، والحفاظ على معدل التنفس الحيوان في ~ 30 نبضة في الدقيقة. هذا هو حوالي 2000 ميللي ثانية في التنفس. استخدام توربو سرعة اقتناء مع تعزيز الاسترخاء (نادر) تسلسل واكتساب 11-19 شرائح الاكليلية، مع TR / TE 1500/9 ميللي ثانية، عامل نادر 8 و (مصفوفة 256 × 256، FOV 2.56 X 2.56 سم، وسمك شريحة 0.75 مم) .
      ملاحظة: من خلال تعديل TR إلى 1500 ميللي ثانية، والحفاظ على معدل التنفس الحيوان ~ 30 نبضة في الدقيقة (2000 ميللي ثانية في التنفس)، ونحن تأكد من أن البيانات التي تم جمعها خلال فترة هدوء الحيوانات.
5. بعد أن تم الانتهاء من جميع الحصول على الصور، ضع الحيوان الممسوحة ضوئياعلى لوحة ساخنة ورصد حتى الإسعافية. بعد الشفاء، والعودة الحيوان إلى القفص ورصد ما لا يقل عن 1 ساعة قبل أن تعود إلى منشأة الحيوان.

النتائج

في هذه المخطوطة، ونحن نهدف لإظهار فائدة UHF MRI كأداة لفي الجسم الحي توصيف phenotypical أو مراقبة المخدرات في نماذج القوارض لPKD وأمراض الكلى الأخرى. وكانت جميع التجارب جزءا من البروتوكولات التجريبية التي وافق عليها IACUC.

في الجسم الحي...

Discussion

وتظهر هذه المخطوطة جدوى استخدام UHF MRI كأداة لفي الجسم الحي توصيف phenotypical أو مراقبة المخدرات في نماذج القوارض لPKD.

وصفنا التجارب القيام به في 16.4 T مع تحمل واسعة سميت بال المقدمة III عالية الدقة NMR مطياف مجهزة مع الملحقات التصوير ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller