のための多発性嚢胞腎疾患の小齧歯類モデルにおける超高磁場MRIの使用<em&gt;インビボ</em&gt;表現型と薬物モニタリング

要約

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

要約

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

概要

多発性嚢胞腎（PKD）は、腎嚢胞の発生を特徴単一遺伝子疾患のグループが含まれています。これらの中でも最も一般的なタイプ^1,2を表す常染色体優性多発性嚢胞腎疾患（ADPKD）および常染色体劣性多発性嚢胞腎（ARPKD）が、あります。 ADPKD、遺伝性腎嚢胞性疾患の最も頻繁な形態は、PKD1またはPKD2遺伝子の変異によって発信されます。これは、遅発性、複数の両側腎嚢胞、可変超腎嚢胞を伴うだけでなく、心血管および筋骨格異常によって特徴付けられます。 ARPKDは、最も一般的に新生児や幼児に影響を与え、PKHD1の突然変異によって引き起こされ、拡大されたエコー源性腎臓および先天性肝線維症³によって特徴づけられます。

重要なことは、ADPKDは、両方の実質的なPをもたらす遺伝子（ジェニック）および変異（対立遺伝子）レベルで、不均一性によって特徴付けられますhenotypic変動。 PKD1遺伝子の変異は重篤な臨床プレゼンテーション（多数の嚢胞、早期診断、高血圧、および血尿）、ならびに（PKD2変異を有する患者よりも20年前に）腎疾患段階を終了する急速な進行と関連している^4。重度の多嚢胞肝疾患（PLD）と血管異常PKD1とPKD2 ⁵の両方で突然変異と関連することができます。 ADPKDの腎臓合併症の大部分は、関連する炎症および線維症に伴う嚢胞の拡大の結果として主に生じます。嚢胞の開発は子宮内で開始し、患者の生涯を通じて継続します。腎臓は通常、彼らが20回以上正常な腎臓のボリュームに達する可能性があるにもかかわらず、自分の腎臓形の形状を維持します。腎嚢胞の患者本二国間分布のほとんどが、いくつかのまれなケースでは、嚢胞は、一方的または非対称パターンで発症することがあります。

主要なチャレンジVol。腎臓専門医がADPKDの患者を次または療法を実施するためのGEは、疾患の自然史です。そのコースの大部分の間、腎機能が正常なままであり、腎機能が低下し始める時点で、腎臓のほとんどは、嚢胞に置き換えられています。治療は、後の段階で実装されている場合には、患者は既に慢性腎疾患におけるノーリターンのポイントに達している可能性があるので成功しにくいです。治療を早期に開始されたときにこれとは対照的に、それは単に、糸球体濾過率に基づいて応答を識別することは困難です。その結果、疾患進行のマーカーとして腎体積の概念が注目を集め。

多発性嚢胞腎疾患（CRISP）研究の放射線学的イメージング研究コンソーシアムは、ADPKD患者で腎臓や嚢胞体積の増加が直接的に総腎容積（TKV）の可能性を強調し、腎機能の低下と相関することが示されています病気の進行のために^6,7 urrogateマーカー。したがって、TKV現在ADPKD ^2,8,9のための複数の臨床試験において、一次または二次エンドポイントとして使用されます。

複数のマウスモデルなどの自然突然変異と遺伝的に操作がPKD ^10,11の病因に光を当てるしています。 PKD1またはPKD2モデル（PKD1またはPKD2のいずれかにおける突然変異）は、それらの完全に模倣ヒト疾患として、最も人気のあるものとなっています。また、PKD1またはPKD2の遺伝子以外の遺伝子に突然変異を有するげっ歯類モデルは、疾患に関連するシグナル伝達経路を解明するための実験プラットフォームとして使用されてきました。さらに、これらのモデルのいくつかは、潜在的な治療法を試験するために使用されてきました。しかし、PKDのための多くのげっ歯類の研究における制限因子は、多くの場合、順次腎臓における解剖学的および機能的変化を分析するための効率的な非侵襲的な方法がないことです。

磁気Resonanceイメージング（MRI）は、ADPKD患者に追従するために、現在の金標準的な画像化技術である、優れた軟部組織コントラストと解剖学的詳細を提供し、TKVの測定を可能にします。 MRIがよく、インビボでより大きな動物およびヒト、イメージング小げっ歯類において解剖学的撮像のために確立されても高解像度の画像を取得する能力は、その有用性を制限することができる追加の技術的課題を伴います。超高磁場の導入（UHF）MRI（7から16.4 T）と強い勾配の開発と、それはそれと同じような診断品質と高い信号対雑音比およびMRI画像の空間分解能を達成することが可能になりましたヒトにおいて得られました。したがって、PKDのための小さな齧歯類モデルの in vivoイメージングのためのUHF MRIの使用は、研究者のための強力なツールとなっています。

プロトコル

生きた動物との任意の手順を開始する前に、実験プロトコルは、制度の動物の管理と使用委員会（IACUC）によって承認されなければなりません。

1.スキャナ設定

1. 開始する前に、ヒーターをOFFの位置にあることを確認してください。
2. ミニイメージング勾配と38ミリメートルのRFコイルとミニイメージングホルダーを選択します。
3. ホルダーの中央の穴に温度可変アセンブリをインストールします。

2.動物の準備

1. MRI実験のために、気化イソフルランを使用して、最適な麻酔を達成。麻酔の誘導のために、吸収性の組織が並んで誘導チャンバ内に動物を配置します。 2.0〜2.5 L / minとし、酸素中3％イソフルランにイソフルラン気化器の流量計を調整します。
2. この段階では金属製のタグまたは他の金属のオブジェクトを削除します。麻酔下ながら乾燥を防止するために、動物の目に獣医軟膏を適用します。
3. 動物一度麻酔の外科的平面に到達した（ すなわち、つま先のピンチに引っ込め反射の損失）は、ノーズコーンに挿入し、その鼻とホルダに動物を配置します。酸素中の1.5から2.0パーセントに2.0〜2.5ミリリットル/分であり、イソフルラン濃度にプローブに麻酔の空気の流れを設定します。麻酔はプロシージャの間、ノーズコーンを介して配信されます。定期的に〜40 BPMの呼吸速度を維持するために、動物の年齢および体重に応じて、イソフルラン濃度を調整します。
4. 代わりに動物を確保し、MRI実験中の動きを防止するために、動物の所有者を使用します。スキャンするボディ領域に応じて、動物ホルダーの種類を変え。
   注：実験室のプラスチック（ポリプロピレン、テフロン、ポリスチレン、ポリカーボネート）からカスタマイズされたホルダー（新生マウス〜160グラムのラットに）特定の実験に対応して、動物のサイズに合わせて作ることができます。
5. 動物の体温を監視するために、動物に直腸温度計を配置します。 EXPの間erimentは、暖かい空気の流れを使用して、35〜37℃で動物を維持します。動物の体の温度フィードバックに基づいて、空気の温度（30〜38℃）で、フロー（1,200-2,000 L /時間）を調整します。
6. 呼吸速度を監視するために、動物の腹部にバルーン呼吸圧力センサを取り付けます。
7. RFコイルの中心に動物を固定し、慎重にMRIスキャナに動物とRFコイルを配置します。

3. MRI実験

1. 使用されるRF電力を最小化し、信号対雑音比を最大にするために、実験を開始する前に、RFコイルとチューニングと一致します。マッチング/チューニングを開始するには：
   1. ツールアイコンをクリックして、分光器制御ツールを開きます。
   2. 分光器制御ツールで取得→揺れをクリックします。 ACQ /レコウィンドウがウォブル曲線を表示する開きます。
   3. あるいは、反射されたRFパワーまで小さなステップでチューニングとマッチングコンデンサ（チューニングを使用し、ロッドにマッチする）を調整最小化されます。目標は、横軸にゼロに位置する垂直軸で最小の曲線を確認することです。
   4. コイルのキャリブレーションが正常に達成されたときは、ACQ /レコウィンドウで[停止]ボタンを押してください。
2. 、軸方向コロナル及びサジタル画像を作成するために、3つの直交面にスカウト画像を取得します。スカウト画像^12を取得するために、このようなイントラゲートファーストローアングルショット（IG-FLASH）として、高速画像シーケンスを使用してください。実際の撮影のために適切なジオメトリを設定するためにスカウト画像を使用してください。
3. 特定の研究目的に応じて、適切な画像シーケンスとパラメータを選択し、トラフィックの光でスキャンを開始します。これは、RFチャネルを校正磁石をシム、水のために共鳴キャリア周波数を設定し、すべて自動的に受信機の利得を調整します。
   1. 解剖学的研究およびT2強調画像では、2Dマルチスライスまたは3Dモードで取得します。所与の空間解像度のための実験時間を短縮するために、フィールドを維持します-ofビュー（FOV）可能ですが、ラップアラウンドの成果物（2.56〜3.2センチメートル）を回避するのに十分な大きさと小さいです。
4. 繰り返し時間（TR）、および/またはスライスの数を適切に選択することによって、動物の呼吸周期より若干短い選択された配列の周期にしてください。これは、データが動物の沈黙期間中に収集されることを保証します。
   1. 例えば、腹部の画像について、〜30 BPMでの動物の呼吸速度を維持します。それは息当たり約2,000ミリ秒です。 TRで、リラクゼーション強化（RARE）シーケンスでターボ迅速な取得を使用して、11-19冠状スライスを取得/ TE 9分の1500ミリ秒、RARE因子8と（マトリクス256×256、FOV 2.56 X 2.56センチメートル、スライス厚0.75ミリメートル） 。
      注：1,500ミリ秒にTRを調整し、〜30 BPM（ブレス2,000ミリ秒）動物の呼吸速度を維持することによって、我々はデータが動物の沈黙期間中に収集されていることを確認してください。
5. すべての画像の取得が完了した後、スキャンされた動物を置き加熱したパッドの上に歩行するまで監視します。回復後、ケージに動物を返し、動物施設に戻す前に1時間以上で監視。

結果

本稿では、我々はPKDおよびその他の腎疾患のげっ歯類モデルにおいてin vivoでの表現型の特徴付けや薬物モニタリングのためのツールとしてUHF MRIの有用性を示すことを目指しています。全ての実験は、IACUCにより承認実験プロトコルの一部でした。

UHF MRIを使用してPKDのための小さな齧歯類モデルの in vivoでの表現型の場合 ：

...

ディスカッション

この原稿は、PKDのための齧歯類モデルにおける in vivo表現型の特徴付けや薬物モニタリングのためのツールとしてUHF MRIを使用することの実現可能性を示しています。

我々は、マイクロ、ミニイメージングアクセサリーを装備した大口径アヴァンセIII高分解能NMR分光計で16.4 Tで行った実験について説明します。分光計はParavision 5.1イメージングソフトウェアに...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller