Uso de ultra-alta MRI campo em pequeno roedor modelos de doença renal policística para<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipagem and Drug Monitoring

Resumo

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Resumo

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Introdução

Polycystic Kidney Disease (PKD) inclui um grupo de doenças monogénicas caracterizadas pelo desenvolvimento de quistos renais. Entre eles estão autossômica dominante doença renal policística (ADPKD) e doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR), que representam os tipos mais comuns ^1,2. ADPKD, a forma mais frequente de doenças císticas renais hereditárias, é originada por mutações nos genes PKD1 ou PKD2. É caracterizada por tardia, quistos múltiplos renais bilaterais, acompanhada por cistos extra-renais variáveis, bem como anormalidades cardiovasculares e músculo esquelético. ARPKD, mais comumente afetam recém-nascidos e crianças pequenas, é causada por mutações no PKHD1 e é caracterizada por rins ecogênicos ampliadas e fibrose hepática congênita ^3.

Importante, ADPKD é caracterizada por heterogeneidade, tanto no gene de (génica) e os níveis de mutação (alélica), o que resulta em substancial pvariabilidade henotypic. Mutações no gene PKD1 estão associados com apresentação clínica grave (inúmeros cistos, o diagnóstico precoce, hipertensão e hematúria), bem como a rápida progressão para fase final da doença renal (20 anos antes do que os pacientes com mutações PKD2) ^4. A doença grave do fígado policístico (PLD) e anormalidades vasculares pode ser associada com mutações em ambos PKD1 e PKD2 ^5. A maioria das complicações renais de ADPKD surgem principalmente como conseqüência da expansão cisto junto com inflamação e fibrose associada. Desenvolvimento cisto começa no útero e continua até o tempo de vida do paciente. Rins geralmente manter a sua forma reniforme embora pudessem chegar a mais de 20 vezes o volume normal do rim. Na maioria das pacientes apresentam distribuição bilateral de cistos renais, mas em alguns casos incomuns, cisto pode desenvolver-se em um padrão unilateral ou assimétrica.

Um grande challenge para nefrologistas seguinte pacientes com ADPKD ou implementação de terapias é a história natural da doença. Durante a maior parte do seu curso, a função renal normal e continua pelo tempo que a função renal começa a diminuir, a maior parte dos rins foram substituídos por cistos. Quando terapias são implementadas em fases posteriores, é menos provável que seja bem sucedida, uma vez que o paciente já pode ter atingido um ponto de não retorno na doença renal crônica. Em contraste, quando as terapias são iniciadas nos estádios iniciais, é difícil identificar uma resposta baseada unicamente na taxa de filtração glomerular. Como resultado, a noção de volume renal como um marcador de progressão da doença ganhou atenção.

O Consórcio de Estudos de imagem radiológica da doença renal policística estudo (CRISP) mostrou que em pacientes com ADPKD o aumento dos volumes renais e cisto se correlaciona diretamente com a deterioração da função renal, ressaltando o potencial de volume renal Total (TKV) quantourrogate marcador de progressão da doença ^6,7. Consequentemente, TKV é usado atualmente como objectivo primário ou secundário em vários ensaios clínicos para ADPKD ^2,8,9.

Vários modelos de murino incluindo mutações espontâneas e geneticamente modificadas lançaram luz sobre a patogênese da PKD ^10,11. Modelos Pkd1 ou PKD2 (mutações em um ou outro Pkd1 ou PKD2) tornaram-se os mais populares, como eles doenças humanas perfeitamente imitar. Além disso, os modelos de roedores com mutações em outros de genes PKD1 ou PKD2 genes têm sido utilizados como uma plataforma experimental para elucidar as vias de sinalização relacionados com a doença. Além disso, vários destes modelos foram utilizados para testar terapias potenciais. No entanto, um factor limitante em muitos estudos com roedores para PKD é frequentemente a falta de métodos não-invasivos eficientes para analisar sequencialmente as alterações anatómicas e funcionais no rim.

Magnetic rimaging esonance (RM) é a técnica de imagem atual padrão ouro para acompanhar os pacientes DPRAD, proporcionando excelente contraste dos tecidos moles e detalhes anatômicos, e permitindo medições TKV. Ainda que a RM é bem estabelecido para imagiologia anatómica em animais e seres humanos de imagem maiores, pequenos roedores in vivo implica desafios técnicos adicionais, onde a capacidade de adquirir imagens de alta resolução podem limitar a sua utilidade. Com a introdução de ultra-alto campo (UHF) RM (7-16,4 t) e o desenvolvimento de gradientes mais fortes, é agora possível alcançar um maior sinal para relações de ruído e resolução espacial das imagens de ressonância magnética com uma qualidade de diagnóstico semelhante à que obtido em humanos. Consequentemente, a utilização de UHF MRI para a imagem in vivo de modelos de roedores pequenos para PKD tornou-se uma ferramenta poderosa para os pesquisadores.

Protocolo

Antes de iniciar quaisquer procedimentos com animais vivos, protocolos experimentais deve ser aprovado pelo cuidado dos animais e uso comitê institucional (IACUC).

1. Configuração do Scanner

1. Antes de começar, certifique-se o aquecedor está na posição OFF.
2. Selecione o gradiente de imagens de mini e 38 milímetros bobina RF e titular de imagem mini.
3. No furo central do titular instale o conjunto de temperatura variável.

2. Preparação de animais

1. Para experiências de ressonância magnética, conseguir anestesia ideais usando isoflurano vaporizado. Para a indução da anestesia, colocar animal numa câmara de indução forrado com um tecido absorvente. Ajuste o medidor de fluxo do vaporizador isoflurano para 2,0-2,5 L / min, e o isoflurano a 3% em oxigénio.
2. Remova qualquer tag de metal ou outro objeto metálico nesta fase. Aplicar veterinário pomada nos olhos de animais para prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia.
3. Uma vez que o animalatingiu o plano cirúrgico de anestesia (isto é, perda de retirada reflexo para toe pitada), colocar o animal em um suporte com seu nariz inserido em um cone do nariz. Definir o fluxo de ar a anestesia na sonda para 2,0-2,5 ml / min e a concentração de isoflurano para 1,5-2,0% em oxigénio. Anestesia serão entregues através do cone do nariz durante o procedimento. Ajustar periodicamente concentração de isoflurano dependendo da idade e peso do animal para manter uma taxa de respiração de ~ 40 bpm.
4. Use os detentores de animais para proteger o animal no lugar e impedir o movimento durante o experimento de ressonância magnética. Variar o tipo de suporte de animais, dependendo da região do corpo a ser digitalizada.
   Nota: os titulares personalizadas de plásticos de laboratório (polipropileno, Teflon, poliestireno, policarbonato) podem ser feitas para acomodar experiência específica e para se ajustar ao tamanho do animal (de rato recém-nascido para 160 g de rato).
5. Inserir o termómetro rectal no animal para monitorar a temperatura corporal do animal. Durante o experiment, manter o animal a 35-37 ° C, utilizando uma corrente de ar quente. Ajustar a temperatura do ar (30-38 ° C) e do fluxo (1,200-2,000 L / h) com base na realimentação de temperatura do corpo do animal.
6. Anexar um sensor de pressão respiratória balão para abdômen do animal para monitorar a taxa de respiração.
7. Fixar o animal no centro da bobina RF e colocar cuidadosamente a bobina RF em animais com scanner de IRM.

3. RM Experiment

1. Ajustar e corresponder à bobina RF, antes de começar as experiências para minimizar a potência de RF e utilizados para maximizar a relação sinal-para-ruído. Para iniciar a correspondência / tuning:
   1. Abra a ferramenta de controle de espectrômetro clicando no ícone de ferramentas.
   2. Na ferramenta de controle espectrômetro clique Aquisição → Wobble. Uma janela Acq / Reco será aberta exibindo a curva de oscilação.
   3. Alternativamente ajustar a sintonia e harmonização capacitores (usando a sintonia e harmonização varetas) em pequenos passos até que a energia refletida RFé minimizado. O objectivo é o de ver uma curva com um mínimo no eixo vertical posicionado em zero no eixo horizontal.
   4. Quando a calibração da bobina foi alcançado com sucesso, aperte o botão Parar na janela de Acq / Reco.
2. Adquirir imagens de escoteiros nos três planos ortogonais para criar imagens axiais, coronal e sagital. Use uma seqüência de imagens rápido, como Intra Portão rápido ângulo tiro Low (IG-FLASH) para adquirir as imagens de escoteiros ^12. Use as imagens de escoteiros para definir a geometria adequada para a imagem real.
3. Dependendo dos objectivos específicos de investigação, selecione seqüência de imagens adequada e os parâmetros e iniciar a digitalização com um semáforo. Isto irá calibrar canal RF, calce o ímã, frequência portadora definir on-ressonância para a água e ajustar o ganho do receptor, tudo automaticamente.
   1. Para os estudos anatômicos e T2 imagens ponderadas, adquirir em modo multi slice 2D ou 3D. Para encurtar o tempo de experiência para uma determinada resolução espacial, manter o campo-de-view (FOV) tão pequeno quanto possível, mas grande o suficiente para evitar artefatos wrap-around (2,56-3,2 cm).
4. Manter o ciclo de sequência seleccionada ligeiramente mais curto do que o ciclo de respiração animal por selecção adequada do tempo de repetição (TR) e / ou o número de fatias. Isso garante que os dados são coletados durante período de silêncio dos animais.
   1. Por exemplo, para imagens abdominais, mantenha a freqüência respiratória do animal em ~ 30 bpm; que é de cerca de 2.000 ms por respiração. Use um Turbo rápida aquisição com relaxamento Enhancement sequência (raro) e adquirir 11-19 cortes coronais, com TR / TE 1500/9 ms, fator RARE 8 e (matriz 256 x 256, FOV 2,56 x 2,56 centímetros, espessura de corte 0,75 milímetros) .
      Nota: Ao ajustar a TR para 1.500 ms, e mantendo a freqüência respiratória do animal ~ 30 bpm (2.000 ms por respiração), podemos garantir que os dados são coletados durante período de silêncio dos animais.
5. Afinal de aquisição de imagem tenha sido concluída, coloque o animal digitalizadana almofada aquecida e monitorar até ambulatorial. Depois da recuperação, o regresso dos animais da gaiola e monitorizada pelo menos durante 1 hora antes de retornar para a instalação dos animais.

Resultados

Neste manuscrito, pretendemos mostrar a utilidade de UHF MRI como uma ferramenta para caracterização fenotípica in vivo ou monitoramento de drogas em modelos de roedores para PKD e outras doenças renais. Todas as experiências foram parte de protocolos experimentais foram aprovados pelo IACUC.

In vivo fenotipagem de modelos de roedores pequenos para PKD usando UHF RM:

Todos os exames de imagem foram realizados em animais vivos sob anestesia iso...

Discussão

Este manuscrito mostra a viabilidade do uso de UHF MRI como uma ferramenta para caracterização fenotípica in vivo ou monitoramento de drogas em modelos de roedores para PKD.

Nós descrevemos experimentos feitos em 16,4 T com uma grande furo alta resolução Avance III espectrómetro NMR equipado com micro e mini-acessórios de imagem. O espectrômetro foi impulsionado pela aquisição e processamento do software TopSpin2.0PV controlada por Paravision 5,1 software de imagem. Como ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller