L&#39;uso di ultra-alto campo MRI in piccolo roditore modelli di malattia del rene policistico per<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipizzazione and Drug Monitoring

Riepilogo

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Abstract

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Introduzione

La malattia del rene policistico (PKD) comprende un gruppo di malattie monogeniche caratterizzate dallo sviluppo di cisti renali. Tra loro ci sono autosomica dominante rene policistico (ADPKD) e autosomica recessiva rene policistico (ARPKD), che rappresentano i più comuni tipi ^1,2. ADPKD, la forma più frequente di malattie ereditarie cistiche renali, si origina da mutazioni nei geni PKD1 o PKD2. Essa è caratterizzata da esordio tardivo, più cisti renali bilaterali, accompagnato da cisti extra-renale variabile, così come anomalie scheletriche cardiovascolari e muscolari. ARPKD, la maggior parte dei neonati che generalmente influenzano e bambini piccoli, è causata da mutazioni in PKHD1 ed è caratterizzata da reni ecogene dilatati e fibrosi epatica congenita ^3.

È importante sottolineare che, ADPKD è caratterizzata da eterogeneità, sia al gene (genica) e la mutazione (allelica) livelli, che si traduce in notevoli pla variabilità henotypic. Mutazioni nel gene PKD1 sono associati con grave quadro clinico (numerose cisti, la diagnosi precoce, l'ipertensione, e ematuria), così come la progressione rapida stadio terminale della malattia renale (20 anni prima rispetto ai pazienti con mutazioni PKD2) ^4. Malattia grave del fegato policistico (PLD) e anomalie vascolari possono essere associati a mutazioni in entrambi PKD1 e PKD2 ^5. La maggior parte delle complicanze renali di ADPKD ottengono prevalentemente in conseguenza dell'espansione cisti con infiammazione e fibrosi associata. Sviluppo Cisti inizia in utero e continua attraverso il ciclo di vita del paziente. I reni normalmente mantengono la loro forma reniforme, anche se potevano raggiungere più di 20 volte il volume renale normale. La maggior parte dei pazienti presente distribuzione bilaterale di cisti renali, ma in alcuni casi particolari, cisti possono sviluppare in un modello unilaterale o asimmetrica.

Un importante Challenge per nefrologi seguito i pazienti con ADPKD o terapie attuazione è la storia naturale della malattia. Durante la maggior parte del suo corso, la funzione renale rimane normale e quando la funzione renale inizia a diminuire, la maggior parte dei reni sono stati sostituiti da cisti. Quando le terapie sono implementati in fasi successive, è meno probabile che sia successo in quanto il paziente potrebbe aver già raggiunto un punto di non ritorno nella malattia renale cronica. Al contrario, quando le terapie vengono avviati nelle fasi iniziali, è difficile identificare una risposta basata esclusivamente sulla velocità di filtrazione glomerulare. Di conseguenza, il concetto di volume di rene come marker di progressione della malattia guadagnato l'attenzione.

Il Consorzio per Radiologic Imaging Studi di rene policistico Malattia (CRISP) studio ha dimostrato che nei pazienti affetti da ADPKD l'incremento dei volumi di rene e cisti correla direttamente con deterioramento della funzione renale, sottolineando il potenziale di Volume totale del rene (TKV) come comemarcatore urrogate per la progressione della malattia ^6,7. Di conseguenza, TKV è attualmente utilizzato come endpoint primario o secondario in più studi clinici per ADPKD ^2,8,9.

Più modelli murini comprese mutazioni spontanee e tecniche di ingegneria genetica hanno fatto luce sulla patogenesi di PKD ^10,11. Modelli PKD1 o PKD2 (mutazioni in entrambe le PKD1 o PKD2) sono diventati più popolari, in quanto la malattia umana perfettamente imitare. Inoltre, i modelli di roditori con mutazioni in geni diversi geni PKD1 o PKD2 sono stati utilizzati come una piattaforma sperimentale di chiarire vie di segnalazione correlati alla malattia. Inoltre, molti di questi modelli sono stati utilizzati per testare potenziali terapie. Tuttavia, un fattore limitante in molti studi sui roditori per PKD è spesso la mancanza di metodi non invasivi efficienti per analizzare sequenzialmente i cambiamenti anatomici e funzionali nel rene.

R magneticaesonance (MRI) è la tecnica di imaging attuale gold standard per seguire i pazienti ADPKD, fornire un eccellente contrasto dei tessuti molli e il dettaglio anatomico, e consentendo misure TKV. Anche se la risonanza magnetica è ben definito per l'imaging anatomiche negli animali e nell'uomo più grandi, di imaging piccoli roditori in vivo comporta sfide tecniche supplementari, dove la capacità di acquisire immagini ad alta risoluzione può limitarne l'utilità. Con l'introduzione di ultra-alto campo (UHF) MRI (7-16,4 T) e lo sviluppo di forti pendenze, è ora possibile ottenere una maggiore segnale-rumore rapporti e risoluzione spaziale di immagini MRI con una qualità diagnostica simile a quella ottenute negli uomini. Di conseguenza, l'uso di UHF risonanza magnetica per imaging in vivo di piccoli modelli di roditori per PKD è diventato un potente strumento per i ricercatori.

Protocollo

Prima di avviare qualsiasi procedura con gli animali vivi, protocolli sperimentali dovranno essere approvati dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale (IACUC).

1. Configurazione Scanner

1. Prima di iniziare, assicurarsi che il riscaldatore si trova in posizione OFF.
2. Selezionare il mini gradiente di imaging e 38 millimetri bobina RF e mini supporto imaging.
3. Nel foro centrale del supporto installare il gruppo a temperatura variabile.

2. Preparazione degli animali

1. Per gli esperimenti di risonanza magnetica, ottenere l'anestesia ottimali utilizzando isoflurano vaporizzato. Per l'induzione dell'anestesia, mettere animale in una camera di induzione foderato con un tessuto assorbente. Regolare il flussometro del vaporizzatore isoflurano a 2,0-2,5 L / min, e la isoflurano al 3% di ossigeno.
2. Rimuovere qualsiasi etichetta di metallo o altro oggetto metallico in questa fase. Applicare una pomata veterinario sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Una volta che l'animaleha raggiunto il piano chirurgico di anestesia (cioè, perdita di recesso reflex a pizzico tep), posizionare l'animale su un supporto con il suo naso inserito in un cono di naso. Impostare il flusso d'aria anestesia nella sonda di 2,0-2,5 ml / min e la concentrazione isoflurano al 1,5-2,0% di ossigeno. Anestesia sarà consegnato attraverso il cono naso durante la procedura. Periodicamente regolare la concentrazione isoflurano a seconda dell'età e del peso dell'animale a mantenere un tasso di respirazione di ~ 40 bpm.
4. Utilizzare i titolari animali per garantire l'animale al suo posto e impedire il movimento durante l'esperimento MRI. Variare il tipo di supporto animale a seconda della regione del corpo da sottoporre a scansione.
   Nota: i titolari di misura dalla plastica di laboratorio (polipropilene, teflon, polistirolo, policarbonato) possono essere fatte per ospitare specifico esperimento e per adattarsi alle dimensioni degli animali (da topo neonato per 160 g di ratto).
5. Posizionare il termometro rettale nell'animale per controllare la temperatura del corpo dell'animale. Durante l'experiment, tenere l'animale a 35-37 ° C, in corrente di aria calda. Regolare la temperatura dell'aria (30-38 ° C) e il flusso (1,200-2,000 l / h) sulla base del feedback della temperatura corporea dell'animale.
6. Collegare un sensore di pressione respiratoria palloncino per addome dell'animale per monitorare la frequenza respiratoria.
7. Fissare l'animale al centro della bobina RF e posizionare accuratamente la bobina RF con l'animale in MRI scanner.

3. MRI Experiment

1. Tune e abbinare bobina RF prima di iniziare gli esperimenti per minimizzare la potenza RF utilizzato e per massimizzare il rapporto segnale-rumore. Per avviare l'incontro / tuning:
   1. Aprire lo strumento di controllo spettrometro facendo clic sull'icona strumenti.
   2. Nello strumento di controllo spettrometro clic Acquisizione → Wobble. Una finestra Acq / Reco aprirà la visualizzazione della curva di oscillazione.
   3. In alternativa, regolare i condensatori di sintonia e corrispondenza (utilizzando la messa a punto e di corrispondenza bacchette) a piccoli passi fino a quando la potenza RF riflessaè ridotto al minimo. L'obiettivo è quello di vedere una curva con un minimo in corrispondenza dell'asse verticale posizionato a zero sull'asse orizzontale.
   4. Quando la calibrazione della batteria è stato raggiunto con successo, premere il pulsante Stop nella finestra Acq / Reco.
2. Acquisire le immagini esploratore nei tre piani ortogonali per creare immagini assiali, coronali e sagittali. Usare una sequenza di immagini veloce come Intra Porta veloce basso angolo di tiro (IG-FLASH) per acquisire le immagini da ricognizione ^12. Utilizzare le immagini da ricognizione per impostare la geometria corretta per imaging effettivo.
3. A seconda degli obiettivi specifici di ricerca, selezionare la corretta sequenza di immagini e parametri e avviare la scansione con un semaforo. Questo calibrare canale RF, shim del magnete, impostato frequenza portante in risonanza per l'acqua e regolare il guadagno del ricevitore, il tutto automaticamente.
   1. Per gli studi anatomici e T2 pesate, acquisire in fetta più 2D o in modalità 3D. Per ridurre il tempo per un dato esperimento risoluzione spaziale, mantenere il campo-di-view (FOV) più piccola possibile, ma abbastanza grande per evitare artefatti avvolgenti (2,56-3,2 cm).
4. Mantenere il ciclo della sequenza selezionata leggermente più corto del ciclo respirazione animale dalla scelta corretta del tempo di ripetizione (TR) e / o il numero di fette. Ciò assicura che i dati vengono raccolti durante il periodo di quiete degli animali.
   1. Ad esempio, per le immagini addominali, mantenere la frequenza respiratoria dell'animale a ~ 30 bpm; che è di circa 2.000 msec per respiro. Utilizzare un Turbo Rapid acquisizione con Enhancement Relax (RARE) Sequenza e acquisire 11-19 fette coronali, con TR / TE 1500/9 msec, fattore RARO 8 e (matrice 256 x 256, FOV 2,56 x 2,56 centimetri, spessore dello strato 0,75 millimetri) .
      Nota: Regolando il TR a 1.500 msec, e mantenendo la frequenza respiratoria dell'animale ~ 30 bpm (2.000 msec per respiro), ci assicuriamo che i dati vengono raccolti durante il periodo di quiete degli animali.
5. Dopo tutto acquisizione dell'immagine è stata completata, posizionare l'animale digitalizzatasul rilievo riscaldata e monitorare fino ambulatoriale. Dopo il recupero, rispedire l'animale verso la gabbia e monitorati per almeno 1 ora prima di tornare alla struttura degli animali.

Risultati

In questo manoscritto, ci proponiamo di mostrare l'utilità di UHF MRI come strumento per la caratterizzazione fenotipica in vivo o il monitoraggio di farmaci in modelli di roditori per PKD e altre malattie renali. Tutti gli esperimenti erano parte di protocolli sperimentali approvati dal IACUC.

In vivo fenotipizzazione di piccoli modelli di roditori per PKD utilizzo UHF MRI:

Tutti gli studi di imaging sono stati eseguiti su animali vivi in ane...

Discussione

Questo manoscritto mostra la possibilità di utilizzare la risonanza magnetica UHF come strumento per la caratterizzazione fenotipica in vivo o il monitoraggio di farmaci in modelli di roditori per PKD.

Descriviamo esperimenti fatti a 16,4 T con una vasta foro Avance III alta risoluzione spettrometro NMR dotata di accessori di imaging micro e mini. Lo spettrometro è stato guidato dal software di acquisizione ed elaborazione TopSpin2.0PV controllato da Paravision 5.1 software di ima...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller