대한 다낭성 신장 질환의 작은 설치류 모델에서 매우 높은 필드 MRI의 사용<em&gt; 생체</em&gt; 표현형 의약품 모니터링

요약

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

초록

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

서문

다낭성 신장 질환 (PKD)는 신장 낭의 발달을 특징으로 단일 유전자 질환의 군을 포함한다. 그 중 상 염색체 우성 다낭성 신장 질환 (ADPKD)과 염색체 - 열성 다낭성 신장 질환의 가장 일반적인 유형 ^{1, 2를} 나타냅니다 (ARPKD)이다. ADPKD, 유전성 신장 낭종 성 질환의 가장 흔한 형태는 PKD1 또는 PKD2 유전자의 돌연변이에 의해 유래. 그것은 후기 발병, 여러 양측 신장 낭종, 변수 여분 신장 낭종을 동반뿐만 아니라 심장 혈관과 근육 골격의 이상을 특징으로한다. ARPKD, 가장 일반적으로 영향을 미치는 신생아 및 어린 아이들, PKHD1 돌연변이에 의해 발생 및 확대 에코 신장과 선천성 간 섬유증 ^3을 특징으로한다.

중요한 것은, ADPKD 모두 상당한 P 결과 유전자 (제닉)과 변이 (대립 유전자) 수준에서 이질성이 특징입니다henotypic 변화. PKD1 유전자의 돌연변이는 심한 임상 양상 (다수의 낭종, 조기 진단, 고혈압, 및 혈뇨),뿐만 아니라 (PKD2 돌연변이를 가진 환자는 20 년 전) 신장 질환 단계를 종료하는 빠른 진행과 관련된 ^4. 심한 다낭성 간 질환 (PLD)과 혈관 이상은 PKD1과 PKD2 ⁵ 모두에 돌연변이와 연관 될 수 있습니다. ADPKD의 신장 합병증의 대부분은 연관된 염증 및 섬유증과 함께 낭종 팽창의 결과로 주로 발생한다. 낭종 개발은 자궁에서 시작하여 환자의 일생을 통해 계속됩니다. 신장은 보통 20 개 이상의 배 정상 신장 볼륨에 도달 할 수에도 불구하고 자신의 콩팥 모양의 모양을 유지한다. 신장 낭종의 환자 현재 양측 분포의 대부분은, 그러나 어떤 특별한 경우에, 낭종은 일방적 또는 비대칭 패턴으로 개발할 수 있습니다.

주요 challen신장 내과는 ADPKD 환자를 다음 또는 치료를 구현하기위한 GE는 질병의 자연 경과입니다. 그 과정의 대부분 동안, 신장 기능은 정상 유지 및 신장 기능이 감소하기 시작하는 시간, 신장의 대부분은 낭종에 의해 대체되었습니다. 치료법은 나중 단계에서 구현 될 때, 이는 환자가 이미 만성 신장 질환의 귀환 포인트에 도달 할 수 있기 때문에 성공하기 어렵다. 치료는 초기 단계에서 시작되는 경우 반대로, 그것은 전적으로 사구체 여과율에 기초한 응답을 식별하는 것이 곤란하다. 그 결과, 질병 진행의 마커로서 신장 용적의 개념은 주목을 받았다.

ADPKD 환자에서 신장 낭종 볼륨의 증가는 직접 한 총 신장 볼륨 (TKV)의 잠재력을 강조, 신장 기능 저하와 관련이 있음을 다낭성 신장 질환 (선명한) 연구의 방사선 영상 연구 컨소시엄을 보여 주었다질병 진행의 ^6,7에 대한 urrogate 마커. 따라서, TKV 현재 ADPKD ^2,8,9에 대한 여러 임상 시험에서 기본 또는 보조 엔드 포인트로 사용됩니다.

여러 쥐 모델을 포함 자발적인 돌연변이와 유전자 조작은 PKD ^{10, 11의} 발병 기전을 밝혀왔다. Pkd1 또는 Pkd2 모델 (Pkd1 또는 Pkd2 중 하나에 돌연변이), 그들이 완벽하게 모방 인간의 질병에서 가장 인기있는 사람이되었다. 또한 Pkd1 또는 Pkd2 유전자 이외의 유전자 돌연변이 쥐 모델 질환과 관련된 신호 전달 경로 해명 실험 플랫폼으로 사용되어왔다. 또한, 이들 모델의 몇몇 잠재적 인 치료법을 테스트하는 데 사용되어왔다. 그러나, PKD 많은 설치류 연구에 제한 요소를 순차적으로 신장 해부학 적 및 기능적 변화를 분석하는 효율적인 비 침습적 방법은 종종 부족하다.

자기 Resonance 이미징 (MRI)이 우수한 부드러운 티슈 콘트라스트 및 해부학 상세를 제공하고 있으나 TKV 측정을 허용 ADPKD 환자를 따르는 전류 금 표준 영상 법이다. MRI가 아니라 생체 내에서 더 큰 동물과 인간, 촬상 작은 설치류에서 해부학 촬상 수립 되더라도 높은 해상도의 이미지를 획득 할 수있는 능력이 그 유용성을 제한 할 수있는 추가의 기술적 도전을 수반한다. 초고 필드 (UHF) MRI (7-16.4 T)과 강한 구배 현상의 도입으로, 이것은 유사한 잡음비 및 진단 품질 MRI 화상의 공간 해상도 신호 - 더 달성하는 것이 가능하다 인간에서 얻어진. 따라서, PKD에 대한 작은 설치류 모델의 생체 내 이미징을위한 UHF MRI의 사용은 연구를위한 강력한 도구가되고있다.

프로토콜

살아있는 동물과 어떤 절차를 시작하기 전에 실험 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아야한다.

1. 스캐너 구성

1. 시작하기 전에, 히터가 OFF 위치에 있는지 확인하십시오.
2. 미니 이미징 그라데이션과 38mm의 RF 코​​일과 미니 영상 홀더를 선택합니다.
3. 홀더의 중심 보어 가변 온도 어셈블리를 설치한다.

2. 동물 준비

1. 자기 공명 영상 실험을 위해, 증발 이소 플루 란을 사용하여 최적의 마취를 얻을 수 있습니다. 마취의 유도, 흡수 조직 늘어서 유도 챔버에서 동물을 배치합니다. 2.0-2.5 L / 분, 산소의 3 %에 이소 플루 란에 이소 플루 란 기화기의 유량계를 조정합니다.
2. 이 단계에서 금속 태그 또는 다른 금속 물체를 제거합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
3. 동물 일단마취의 수술 비행기에 도달했습니다 (즉, 발가락 핀치에 철수 반사 손실)은, 코 콘에 삽입 코와 홀더에 동물을 배치합니다. 2.0-2.5 ml / 분에 프로브 마취 공기 흐름과 산소의 1.5-2.0 %로 이소 플루 란 농도를 설정합니다. 마취 절차를 수행하는 동안 코 콘을 통해 전달됩니다. 주기적 ~ 40 BPM의 호흡 속도를 유지하기 위해 동물의 연령 및 체중에 따라 이소 플루 란 농도를 조정한다.
4. 대신에, 동물을 고정하고 MRI 실험 동안 움직임을 방지하기 위해 동물 홀더를 사용. 바디 영역에 따라 동물 홀더 유형이 스캔 할 다양하다.
   주 : 실험실 플라스틱 (폴리 프로필렌, 테플론, 폴리스티렌, 폴리 카보네이트)로부터 받아서 홀더 특정 실험을 수용하고 (160g 래트 신생아로부터 마우스) 동물의 크기에 맞게 만들어 질 수있다.
5. 동물의 신체 온도를 모니터링하기 위해 동물의 직장 온도계를 놓습니다. 특급시eriment 따뜻한 공기의 스트림을 사용하여, 35-37 ℃에서 동물 유지. 공기 온도 (30-38 ° C의)과 동물의 체온 피드백을 기반으로 흐름 (1,200-2,000 리터 / h)를 조정합니다.
6. 호흡 속도를 모니터링하는 동물의 복부에 풍선 호흡 압력 센서를 부착합니다.
7. RF 코일의 중심에서, 동물을 고정하고 신중 MRI 스캐너로 동물 RF 코​​일을 배치했다.

3. 자기 공명 영상 실험

1. 조정이 실험은 RF 전력 사용을 최소화하고, 신호 대 잡음비를 최대화하기 시작하기 전에 RF 코​​일 일치. 일치 / 튜닝을 시작하려면 :
   1. 도구 아이콘을 클릭하여 분광계 제어 도구를 엽니 다.
   2. 분광계 제어 도구에서 수집 → 워블을 클릭합니다. ACQ / 레코 창 워블 곡선을 표시 열립니다.
   3. 선택적 반사 RF 전력까지 작은 단계로 조정 및 정합 커패시터 (튜닝 봉을 사용하고 매칭)을 조정할최소화된다. 목표는 횡축 제로에 위치 수직축에서 최소 곡선을 볼 수있다.
   4. 코일의 교정이 성공적으로 달성되면, ACQ / 레코 창에서 정지 버튼을 누르십시오.
2. , 축 관상 및 시상 이미지를 만드는 세 직교면에서 스카우트 이미지를 획득. 스카우트 이미지 ^(12)를 취득하는 등 내부 게이트 빠른 낮은 각도 샷 (IG-FLASH)와 같은 빠른 이미지 시퀀스를 사용합니다. 실제 영상에 대한 적절한 형상을 설정하기 위해 스카우트 이미지를 사용합니다.
3. 특정 연구 목적에 따라 적절한 이미지 시퀀스 및 매개 변수를 선택하고 신호등과 스캔을 시작합니다. 이것은 모든 자동, RF 채널을 교정 물에 공명 자석, 설정된 반송파 주파수를 심은 및 수신기 이득을 조정한다.
   1. 해부학 적 연구 및 T2 강조 영상의 경우, 2D 멀티 슬라이스 또는 3D 모드로 취득. 필드의 유지, 주어진 공간 해상도 실험 시간을 단축의 클로 뷰 (FOV) 가능하지만 랩 어라운드 유물 (2.56-3.2 CM)을 방지하기에 충분히 큰만큼 작은.
4. 반복 시간 (TR) 및 / 또는 조각의 수의 적절한 선택에 의해 동물의 호흡주기보다 약간 짧은 선택한 시퀀스의주기를 유지합니다. 이 데이터는 동물의 조용한 기간 동안 수집되는 것을 보장한다.
   1. 예를 들어, 복부 이미지, ~ 30 BPM에서 동물의 호흡을 유지; 그 숨 당 약 2,000 밀리 초입니다. TR로, 휴식 향상 (RARE) 순서로 터보 빠른 취득을 사용하여 11-19 관상 조각을 취득 / TE 9분의 1,500 밀리 초 희귀 인자 8 (매트릭스 256 X 256, FOV 2.56 X 2.56 cm, 슬라이스 두께 0.75 ㎜) .
      참고 : 1,500 밀리 초에 TR을 조정하고, ~ 30 BPM을 (숨 2,000 밀리 초) 동물의 호흡 속도를 유지함으로써, 우리는 데이터가 동물의 조용한 기간 동안 수집되어 있는지 확인합니다.
5. 모든 화상 취득이 완료되면, 주사 동물을 배치가열 패드에 외래 때까지 모니터링 할 수 있습니다. 복구 후 케이지에 동물을 반환하고, 동물 시설로 돌아 가기 전에 1 시간 동안 적어도 모니터링.

결과

이 논문에서 우리는 PKD 및 기타 신장 질환에 대한 설치류 모델에서 생체 표현형 특성 또는 약물 모니터링을위한 도구로 UHF 자기 공명 영상의 유용성을 표시하는 것을 목표로하고 있습니다. 모든 실험은 IACUC 승인 실험 프로토콜의 일부였다.

PKD는 UHF MRI를 사용하기위한 작은 설치류 모델의 생체 표현형에서 :

모든 영상 검사는 브루 커 AVANCEIII-7...

토론

이 원고는 생체 표현형 특성 또는 PKD에 대한 설치류 모델에서 약물 모니터링을위한 도구로 UHF 자기 공명 영상 사용의 가능성을 보여줍니다.

우리는 넓은 구멍 마이크로 미니 이미징 액세서리를 갖춘 이동이다 III 고해상도 NMR 분광계와 16.4 T에서 수행 실험을 설명합니다. 분광계는 Paravision 5.1 이미징 소프트웨어에 의해 제어 TopSpin2.0PV 취득 및 처리 소프트웨어에 의해 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller