Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Zusammenfassung

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Zusammenfassung

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Einleitung

Polyzystische Nierenerkrankung (PKD) eine Gruppe von monogenen Erkrankungen, die durch die Entwicklung von Nierenzysten. Unter ihnen sind autosomal-dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) und autosomal-rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), die die häufigsten Arten ^1,2 darstellen. ADPKD, die häufigste Form der erblichen Nieren zystische Erkrankungen durch Mutationen in den PKD1 oder PKD2 Gene stammen. Es wird von late-onset, mehrere bilaterale Nierenzysten, begleitet von variable extraNierenZysten sowie Herz-Kreislauf- und Muskelskelettanomalien gekennzeichnet. ARPKD, allgemein betreffen die meisten Neugeborenen und kleinen Kindern, wird durch Mutationen im PKHD1 verursacht und wird durch vergrößerte echoreiche Nieren und angeborene Leberfibrose ³ gekennzeichnet.

Wichtig ist, dass durch ADPKD Heterogenität sowohl auf der Gen (gene) und Mutation (Allel) Ebenen, die im wesentlichen p-Ergebnissehenotypic Variabilität. Mutationen im PKD1-Gen werden mit schweren klinischen Präsentation (zahlreiche Zysten, Früherkennung, Bluthochdruck und Hämaturie) sowie schnelle Progression zu End-stage renal disease (20 Jahre früher als Patienten mit Mutationen PKD2) zugeordnet ^4. Schwere polyzystischen Lebererkrankung (PLD) und Gefäßmissbildungen können mit Mutationen in PKD1 und PKD2 sowohl ⁵ zugeordnet werden. Die Mehrzahl von Nierenkomplikationen ADPKD entstehen im Wesentlichen als Folge der Zystenexpansion, den zugehörigen Entzündung und Fibrose. Zyste Entwicklung beginnt in der Gebärmutter und setzt sich über den Patienten Lebenszeit. Nieren Regel behalten ihre reniform Form, auch wenn sie mehr als 20 Mal die normale Nierenvolumen erreichen konnte. Die meisten der Patienten vorhanden bilateralen Verteilung von Nierenzysten, aber in einigen seltenen Fällen, Zyste kann in einer einseitigen oder asymmetrische Muster zu entwickeln.

Ein Haupt Challenge für Nephrologen folgenden Patienten mit ADPKD oder Durchführungstherapien ist die Naturgeschichte der Krankheit. Während der meisten Zeit seines Laufs bleibt die Nierenfunktion normal und durch die Zeit der Nierenfunktion beginnt zu sinken, die meisten der Nieren durch Zysten ersetzt. Wenn Therapien werden in späteren Phasen implementiert, ist es weniger wahrscheinlich, um erfolgreich zu sein, da der Patient kann bereits einen Punkt ohne Wiederkehr bei chronischen Nierenerkrankungen zu erreichen. Wenn im Gegensatz dazu Therapien in frühen Stadien gestartet werden, ist es schwierig, eine Antwort nur auf die glomeruläre Filtrationsrate basierend identifizieren. Als Ergebnis der Begriff Nierenvolumen als Marker der Progression der Erkrankung gewonnen Aufmerksamkeit.

Das Konsortium für Radiologische Imaging Studium der Kidney Disease (CRISP) Studie hat gezeigt, dass bei Patienten mit ADPKD die Zunahme der Nierenzyste und Volumina direkt korreliert mit Nierenfunktionsverschlechterung und unterstreicht das Potenzial der Gesamtnieren Volume (TKV), wie alsurrogate Marker für die Progression der Erkrankung ^6,7. Folglich wird TKV derzeit als primäre oder sekundäre Endpunkt in mehreren klinischen Studien für ADPKD ^2,8,9 verwendet.

Mehrere Mausmodellen einschließlich spontaner Mutationen und gentechnisch verändert wurden, Licht auf die Pathogenese der PKD ^10,11 vergießen. Pkd1 oder PKD2 Modelle (Mutationen entweder Pkd1 oder PKD2) haben sich am meisten verbreitet sind, da sie perfekt imitieren menschliche Krankheit. Darüber hinaus haben Nagetiermodellen mit Mutationen in anderen als Pkd1 oder PKD2 Gene Gene als experimentelle Plattform verwendet, um zu erläutern Signalwege mit der Krankheit. Außerdem können mehrere dieser Modelle wurden verwendet, um mögliche Therapien zu testen. Jedoch ist ein begrenzender Faktor in vielen Studien an Nagetieren für PKD oft der Mangel an effizienten nichtinvasive Methoden zur sequentiellen Analyse der anatomischen und funktionellen Veränderungen in der Niere.

Magnetic resonance Tomographie (MRT) ist der derzeitige Goldstandard bildgebendes Verfahren zur ADPKD Patienten folgen und bietet eine ausgezeichnete Weichteilkontrast und anatomische Detail, und ermöglichen TKV Messungen. Obwohl MRI ist für anatomischen Bildgebung in größeren Tieren und Menschen, Imaging kleine Nagetiere in vivo etabliert bringt zusätzliche technische Herausforderungen, denen die Fähigkeit, hochauflösende Bilder erwerben kann seine Nützlichkeit zu begrenzen. Mit der Einführung von Ultrahochfeld (UHF) MRI (7-16,4 T) und der Entwicklung von stärkeren Gradienten, ist es nun möglich, höhere Signal-zu-Rausch-Verhältnisse und der räumlichen Auflösung von MRI-Bildern mit diagnostischer Qualität ähnlich derjenigen zu erreichen beim Menschen erhalten. Folglich ist die Verwendung von UHF-MRT für die in-vivo-Bildgebung von kleinen Nagetiermodellen für PKD hat sich ein leistungsfähiges Werkzeug für die Forscher.

Protokoll

Vor Beginn der Verfahren mit lebenden Tieren sollten experimentelle Protokolle von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt werden.

1. Scanner Configuration

1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, das Heizgerät in die Position OFF.
2. Wählen Sie das mini Bildgebungsgradienten und 38 mm-HF-Spule und mini-Bildgebung Halter.
3. In der zentralen Bohrung der Halterung installieren Sie die variable Temperatur Montage.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Für MRI Experimente, eine optimale Anästhesie mit Isofluran verdampft. Zur Narkoseeinleitung, legen Tier in einer Induktionskammer mit einem saugfähigen Tuch ausgekleidet. Stellen Sie den Durchflussmesser der Isofluran-Verdampfer auf 2,0 bis 2,5 l / min, und die auf 3% Isofluran in Sauerstoff.
2. Entfernen Sie alle Metallschild oder andere Metallgegenstand in diesem Stadium. Bewerben vet Salbe auf die Augen Tieres bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Sobald das Tierhat die chirurgische Ebene der Narkose erreicht (dh Verlust der Ziehreflex bis Fuß pinch), legen Sie das Tier auf einem Halter mit der Nase in ein Nasenkegel eingesetzt. Eingestellt Anästhesieluftstrom in der Sonde an 2,0-2,5 ml / min und die Isoflurankonzentration 1,5-2,0% in Sauerstoff. Anästhesie wird während des Verfahrens durch den Nasenkegel geliefert werden. Von Zeit zu Zeit anpassen Isofluran-Konzentration je nach Alter Tieres und Gewicht, eine Atemfrequenz von ~ 40 bpm aufrechtzuerhalten.
4. Verwenden Tierhalter, um das Tier zu befestigen und Bewegung während der MRI-Experiment zu verhindern. Variiert die Art des Tierhalters in Abhängigkeit vom Körper abzutastenden Bereich.
   Hinweis: Kundenspezifische Halterungen aus Labor Kunststoffe (Polypropylen, Teflon, Polystyrol, Polycarbonat) werden können, um spezifische Experiment unterzubringen und um das Tier Größe (von neugeborenen Maus, um 160 g Ratte) angepasst werden.
5. Legen Sie die Rektalthermometer im Tierkörpertemperatur Tieres zu überwachen. Während der experiment, halten das Tier bei 35-37 ° C, mit einem warmen Luftstrom. Einzustellen Lufttemperatur (30-38 ° C) und Strömung (1200-2000 l / h) auf der Basis der Körpertemperatur Feedback Tieres.
6. Einen Ballon Atemdrucksensor Bringen Sie den Tierleib, um die Atemfrequenz zu überwachen.
7. Sichern Sie das Tier in der Mitte der HF-Spule und vorsichtig die HF-Spule mit Tier in MRI-Scanner.

3. MRI Experiment

1. Tune und passen Sie die HF-Spule, bevor die Experimente zu minimieren HF-Leistung und zur Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu maximieren. So starten Sie die passenden / Tuning:
   1. Öffnen Sie die Spektrometersteuerung Tool, indem Sie auf das Symbol Tools.
   2. Im Spektrometer Steuerungstool klicken Acquisition → Wobble. Ein Acq / Reco Fenster geöffnet, das Wobble-Kurve.
   3. Alternativ können die Tuning und Anpassungskondensatoren (unter Verwendung der passenden Tuning- und Stäbe) in kleinen Schritten einzustellen, bis der reflektierte HF-Leistungminimiert. Das Ziel ist, eine Kurve mit einem Minimum an der vertikalen Achse bei Null an der horizontalen Achse positioniert sehen.
   4. Wenn die Kalibrierung der Spule hat erfolgreich erreicht wurde, drücken Sie die Stopptaste in der Acq / Reco-Fenster.
2. Erwerben Sie scout Bilder in den drei orthogonalen Ebenen, um eine axiale, koronale und sagittale Bilder zu schaffen. Verwenden Sie eine schnelle Bildfolge, wie Intra-Tor Fast Low Angle Shot (IG-FLASH), um die Erkundungsbilder ¹² zu erwerben. Verwenden Sie die Erkundungsbilder, um die richtige Geometrie für die eigentliche Bildgebung eingestellt.
3. Je nach den spezifischen Forschungsziele, wählen Sie die richtige Bildfolge und Parameter ein und starten die Suche mit einer Ampel. Dies wird HF-Kanal zu kalibrieren, Shim den Magneten, setzen Trägerfrequenz bei Resonanz für Wasser und passen Empfängerverstärkung, die alle automatisch.
   1. Für anatomische Studien und T2-gewichteten Bildern, erwerben in 2D Multi Slice oder 3D-Modus. Um das Experiment für eine gegebene räumliche Auflösung zu verkürzen, halten Sie das Feld-der (FOV) so klein wie möglich, aber groß genug, um Umwickelartefakte (2,56 bis 3,2 cm) zu vermeiden.
4. Halten des Zyklus der gewählten Sequenz geringfügig kürzer als die tierischen Atemzyklus durch geeignete Wahl der Wiederholungszeit (TR) und / oder der Anzahl der Schichten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Daten während der Ruheperiode der Tiere gesammelt.
   1. Zum Beispiel für Bauch Bilder, halten Atemfrequenz Tieres bei ~ 30 bpm; das ist etwa 2000 ms pro Atemzug. Verwenden Sie einen Turbo schnelle Erfassung mit Relaxation Enhancement (RARE) Sequenz und erwerben 11-19 koronalen Scheiben schneiden, mit TR / TE 1500/9 msec, RARE Faktor 8 und (Matrix 256 x 256, FOV 2,56 x 2,56 cm, Schichtdicke 0,75 mm) .
      Hinweis: Durch Einstellen des TR 1500 ms, und halten die Atemfrequenz des Tieres ~ 30 bpm (2,000 ms pro Atemzug), stellen wir sicher, dass die Daten während der Ruhezeit der Tiere gesammelt.
5. Nachdem alle Bildaufnahme abgeschlossen ist, legen Sie das gescannte Tierauf beheizten Unterlage und zu überwachen, bis die ambulante. Nach der Wiederherstellung, bringen Sie das Tier in den Käfig und 1 Stunde lang überwacht zumindest vor der Rückkehr in die Tierhaltung.

Ergebnisse

In dieser Handschrift, streben wir an, den Nutzen der UHF-MRT als Instrument für die in vivo phänotypische Charakterisierung oder Arzneimittelüberwachung in Nagetiermodellen für PKD und anderen Nierenerkrankungen zeigen. Alle Versuche waren Teil der IACUC genehmigt Versuchsprotokollen.

In-vivo-Phänotypisierung von kleinen Nagetiermodellen für PKD mit UHF-MRT:

Alle bildgebenden Untersuchungen wurden auf lebende Tiere unter Isofluran-Narkose du...

Diskussion

Diese Handschrift zeigt die Durchführbarkeit der Verwendung von UHF-MRT als Instrument für die in vivo phänotypische Charakterisierung oder Arzneimittelüberwachung in Nagetiermodellen für PKD.

Wir beschreiben Experimente bei 16,4 T mit einer großen Bohrung Avance III hochauflösende NMR-Spektrometer mit Mikro- und Mini-Imaging-Zubehör ausgestattet wurde. Das Spektrometer wurde durch die Erfassung und Verarbeitung Software TopSpin2.0PV von Paravision 5.1 Imaging-Software geste...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller