تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

وكانت حدود لقرار بصري وتحدي تحديد السكان بروتين معين في المجهر الإلكتروني انتقال العقبات في علم الأحياء الخلوي. العديد من الظواهر لا يمكن تفسيره في المختبر تحليل نظم مبسطة وتحتاج المعلومات الهيكلية إضافية في الموقع، وخاصة في نطاق بين 1 نانومتر و 0.1 ميكرون، من أجل أن تكون مفهومة تماما. هنا، والتصوير الطيفي الإلكترون، وهي تقنية المجهر الإلكتروني النافذ الذي يسمح رسم الخرائط في وقت واحد لتوزيع البروتينات والأحماض النووية، وعلامة التعبير، miniSOG، يتم الجمع بين لدراسة بنية وتنظيم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر البؤر.

Introduction

وعلى الرغم من التقدم الكبير في المجهر الضوئي خلال السنوات الأخيرة ^1، خلية علماء الأحياء لا تزال تعاني من فجوة في القرار. هذا يحد من فهم العلاقات هيكل الوظائف في العمليات الخلوية الأساسية التي تنطوي على تفاعل منسق بين المجمعات الجزيئات (على سبيل المثال، في إعادة لونين، وإصلاح DNA، RNA النسخ والتكرار DNA). على الرغم من المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEM) ق تقديم القرار المطلوب، فقد كان تحديا لتعريف هذه العمليات من الناحية الهيكلية بسبب عدم القدرة على تسمية بروتينات معينة في حين يجري أيضا قادرة على تحديد التركيب الكيميائي الحيوي للهياكل تصور. في غياب الأغشية الداخلية للمساعدة في التفريق الهياكل النووية، كانت نواة تحديا من نوع خاص. الإلكترون الطيفية التصوير (ESI) يحل بعض هذه القيود من خلال السماح للكشف في وقت واحد والتفريق بين DNA، RNA، والبروتوكول الاضافيهياكل النووية ^2-5 عين المستندة إلى

الإلكترون التصوير الطيفي:

من أجل خريطة توزيعات عنصري في حساسية عالية ودقة في المجهر الإلكتروني، يمكن للمرء استخدام مطياف التصوير التي يختار الإلكترونات التي تشتتت inelastically من خلال التفاعل مع الإلكترونات قذيفة الداخلية عنصر في العينة ^6. بسبب فقدان كميات عنصر معين من الطاقة نتيجة للتأين الذرات في العينة، وهذه الإلكترونات يمكن فصلها وتصور باستخدام مطياف التي يتم تركيبها على المجهر الالكتروني. وهكذا، تحليل الطيف من الإلكترونات التي تفاعلت مع العينة يكشف عن معلومات نوعية وكمية عن التركيب العنصري للعينة ^7. تم العثور على الإلكترونات التي لا تفقد الطاقة عندما تمر العينة في "عدم الخسارة الذروة" من فقدان الطاقة الإلكترونالطيف. يرتبط وفرة من هذه الإلكترونات إلى الكتلة والكثافة وسمك العينة، وتتألف من الإلكترونات التي تمر من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة أو فقدان الطاقة أثناء مرورها من خلال العينة. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة لتقدير المطلق للأعداد ذرات عنصر معين موجود في العينة ^8.

منذ العينات البيولوجية تتكون في معظمها من العناصر الخفيفة التي تحرف سيئة الإلكترونات في شعاع حادثة TEM، وأساليب تلطيخ باستخدام أملاح المعادن الثقيلة يجب أن تطبق من أجل توليد التباين في العينة. عدم وجود خصوصية لمعظم هذه العوامل المتناقضة وعدم القدرة على تصور وصمة عار أكثر من حيث خصوصية ممكنة قد حد من قيمة المجهر الإلكتروني التقليدية في دراسة النواة. ESI له مزايا هامة على TEM التقليدية، وخاصة لدراسة هياكل نواة الخلية.فمن الممكن لاستغلال الطبيعة الفسفور الغني DNA- والمجمعات الجزيئات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للتمييز مجمعات البروتين النووي من المجمعات البروتين ولحل مجمعات البروتين النووي مختلفة على أساس كثافتها من الأحماض النووية. ولا يمكن تصوير المواد البيولوجية المتبقية على أساس وفرة من النيتروجين. رسم الخرائط فقط هذين العنصرين وتحليل توزيعها والوفرة النسبية داخل هياكل تشريحية مختلفة توفر لنا الكثير من المعلومات حول النواة. على سبيل المثال، فإنه من السهل تحديد لونين وريبوسوم في الخريطة تمثل وفرة الفوسفور. مساحة interchromatin والمجمعات المسام النووية، والهيئات النووية، من ناحية أخرى، يمكن أن يتم الكشف بسهولة في الخريطة النيتروجين الصورة.

مصغرة النظام مولد الاوكسجين القميص (miniSOG)

في حين ESI يمثل تقنية قوية لدراسة الموقع هيكل لونين في ليستغرقالصورة الاستفادة من نسب مميزة في التركيب العنصري بين الفوسفور والنيتروجين وتكوين عنصر لا يمكن في العادة يستخدم للتمييز بين مجموعات مختلفة من المجمعات البروتين. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب الصغيرة في نطاق نانومتر وقد استخدمت على نطاق واسع لرسم خريطة للموقع الجزيئات الفردية. منذ عادة يتم إرفاق الجسيمات الذهب إلى الضد الثانوية، وسوف تظهر ضمن محيط من حوالي 20 نانومتر حول حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة الأولية. في عينات بعد التضمين، يمكن أن الأجسام المضادة كشف فقط الحواتم التي يتم كشفها على سطح الأجزاء. في حين أنه من الممكن أن يثبت وجود مستضد وربطها بنية تشريحية معينة من الخلايا، فإن المعلومات التي يتم الحصول عليها غير كاملة، حيث يتم حجب معظم الحواتم التي كتبها الراتنج. التقنيات التي تستخدم بروتوكولات مماثلة لتلك المستخدمة في مضان المجهري قبل التضمين، تسمح بالوصول إلى المستضدات في جميع أنحاءعمق الكامل للعينة لكن الخطوات permeabilization المطلوبة للسماح للأجسام المضادة لاختراق الخلية عادة ما تتطلب إزالة الأغشية الدهنية وإزالة المكونات التي لا يمكن إصلاحها من خلال الألدهيدات. وعلاوة على ذلك، تثبيتي ألدهيد المفضل للحفاظ التركيب الدقيق، غلوتارالدهيد، ويدمر عادة الحواتم، وبالتالي مطلوب امتصاص العرق عادة. هذا هو أقل فعالية في البروتين البروتين يشابك. عيب آخر من الأجسام المضادة التي وصفت مع جسيمات متناهية الصغر الذهب أن الذهب هو مادة الإلكترون كثيفة جدا أن يخلق تناقضا واضحا أن يمكن أن يحجب تفاصيل الهيكلية مثيرة للاهتمام من العينة، والتي على النقيض أضعف.

ظهور البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كما علامة البروتين أعرب حولت استخدام المجهر مضان الإجابة على الأسئلة في علم الأحياء الخلوي. علامات بروتين مع مجال الفلورسنت صغير يسمح رسم خرائط لتوزيعه في الجسم الحي دون الحاجة إلى إجراءات permeabilization التي يمكن أن تغير هيكل. من أجل ترجمة مبدأ أنيقة من استخدام علامات البروتين لخريطة توزيع البروتين في خلية لالمجهر الإلكتروني، وبحاجة إلى نظام قادر على إنتاج وثيقة إشارة إلى بنية الفائدة وتوليد التباين في TEM. diaminobenzidine بلمرة وصمة التي كثيرا ما تستخدم في الأنسجة للكشف عن الأجسام المضادة ملزمة. وعادة ما يتم إيداع هذه وصمة عار باستخدام البيروكسيديز الفجل (HRP) مترافق إلى الضد الثانوية. على الرغم من أن رد فعل ينتج نتيجة موثوق بها، HRP غير نشطة تحفيزيا في العصارة الخلوية للخلايا ^9. هذه المنتجات يمكن أن رد فعل HRP أيضا منتشر بعيدا من موقع جيل بحيث حلها هو أسوأ من طريقة nanogold ^10. من أجل تجاوز هذه المشاكل، تم تطوير نظام فلاش / ReAsH ^11. وهو يتألف من البروتينات الانصهار المؤتلف التي تمتلك عزر tetracysteine. هذا عزر يسمح ملزمة للوfluorophore biarsenic. عندما متحمس، ومضة المربوطة أو ReAsH قادر على توليد الأكسجين القميص شديدة التفاعل وdiaminobenzidine بالتالي photoconvert (DAB) إلى البوليمر الذي يترسب على الفور في موقع البروتينات الموسومة. يمكن أن تكون ملطخة البوليمر DAB مع رباعي أكسيد الأوزميوم، وهي كثيفة الإلكترون وبالتالي يمكن استخدامها لخريطة توزيع انصهار بروتين المؤتلف في TEM.

في عام 2011، شو وآخرون ¹⁰ قدم نظام miniSOG، والذي يتألف من 106 الأمينية الصغيرة علامة الأحماض الانصهار مشتقة من بروتين فلافيني من نبات الأرابيدوبسيس هذا هو فلوري وقادرة على خلق العديد من المتطرفين الأكسجين القميص عندما متحمس مع 448 الضوء الأزرق نانومتر. تلك الجذور الأكسجين القميص يمكن أن تستخدم لالصور أكسدة diaminobenzidine لتشكيل البوليمرات في وبالقرب من سطح البروتين الموسومة، والتي هي أقرب بكثير من الأجسام المضادة المسمى immunogold ^11. في حين أن نظام فلاش / ReAsH يتطلب يصل الفلوريةالكروم وdiaminobenzidine إلى خلايا قبل القيام photoconversion، ونظام miniSOG يتطلب سوى diaminobenzidine والضوء وبالإضافة إلى ذلك حوالي الفعال مرتين كما في البلمرة diaminobenzidine. هنا، يعمل miniSOG في تركيبة مع ESI من أجل رسم خريطة التركيب الدقيق للإصلاح الحمض النووي البؤر.

إصلاح الحمض النووي بؤر (DRF)

DNA دون اصلاح فواصل حبلا مزدوجة تشكل تهديدا خطيرا للخلية لأنها يمكن أن تؤدي إلى نقل المواقع وفقدان المعلومات الوراثية. وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى الشيخوخة، والسرطان، وموت الخلايا. العديد من البروتينات التي تشارك في الحمض النووي المزدوج إصلاح كسر حبلا تتراكم في البؤر التي تجمع حول حبلا مزدوج DNA كسر ^12-14. على الرغم من وظيفتها غير معروف، إلا أنها تمثل الموقع في النواة التي تحتوي على الحمض النووي المزدوج كسر حبلا وغير موقع من الحمض النووي حبلا مزدوجة إصلاح كسر.

إصلاح الحمض النووي لجنة مسؤولي المنتدىوقد اتسمت ط (DRF) بواسطة المجهر مضان وأنها بمثابة المؤشرات الحيوية للتلف الحمض النووي ^12،15. فهي نسبية كبيرة لحجم كسر مزدوج الجديلة واعتبرت متجانسة نسبيا حتى كشفت الدراسات الحديثة المجهر فائقة الدقة بعض الأدلة على التقسيم الفرعي للجزيئات في كل تركيز ^16. من أجل فهم كيفية تنظيم هذه المواقع، لا بد من تصور كل من الهياكل البيولوجية الأساسية بالنسبة لبعضها البعض. لا يمكن أن يتحقق ذلك عن طريق الفحص المجهري مضان ولكن من الممكن من خلال المجهر الإلكتروني ^17،18. هنا، يتم وصف أسلوب يجمع بين الإلكترون التصوير الطيفي مع أسلوب miniSOG لتوضيح إمكانات هذا النهج جنبا إلى جنب لاستكشاف التركيب الدقيق للDNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر.

Protocol

1. جيل من miniSOG الخلوي خطوط

1. تنمو U2OS (عظمية البشري) خلايا في طبق 35 ملم يحتوي على 2 مل من انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) التي تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
2. Transfect الخلايا عندما تكون 80٪ متموجة قبل lipofection مع نوعية ترنسفكأيشن النقاء (A269 / 280 نسبة 1،8-2،0) يبني البلازميد التي تحتوي على تسلسل لminiSOG وmCherry الموسومة البروتينات إصلاحها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن ^19. ويمكن طلب البلازميدات التعبير miniSOG من تسين مختبر: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. نوع الخلايا التعبير عن بروتين المؤتلف مع العلامة miniSOG وmCherry مضان خلية تنشيط فرز يومين آخر ترنسفكأيشن. جمع الخلايامع كثافة مضان المتوسطة من أجل تجنب الخلايا التي يتم overexpressing ^20.
4. ثقافة الخلايا إيجابية على طبق 10 سم في 10 مل من DMEM المتوسطة التي تستكمل مع 10٪ FBS و 0.6 ميكروغرام / مل من وكيل اختيار G418 (Geneticin).
5. بعد أن ظهرت مستعمرات واضحة على لوحات، وشاشة لمستعمرات إيجابية mCherry باستخدام المجهر مضان مقلوب ورسم الدوائر حولهم (على الجزء السفلي من لوحة) مع علامة دائمة. استخدام المنخفض الجوي التكبير عدسة الهدف (على سبيل المثال، 10X) واختيار الحيوانات المستنسخة باستخدام تقنية معقمة بواسطة الخدش بعناية المستعمرات وإيقاف ببطء مص لهم في العقيمة 1000 ميكرولتر ماصة.
6. توسيع المستعمرات المختارة وتجميد أجزاء منها لأسفل باستخدام متوسط ​​النمو هو موضح في الخطوة 1.1 تستكمل مع 10٪ ثنائي ميثيل sulphoxide. اختبار الخلايا لتشكيل DRF التي تنمو بها على معقمة 18 × 18 مم ² زلات غطاء وتعريضهم ل2 غراي من الإشعاع. الخلايا المشع التعبير عن ثابت وminiSOG mCherry الموسومة البروتين إصلاح يجب أن تظهر نموذجية التنسيق سمة نمط DSBs عندما تصور مع المجهر مضان باستخدام مجموعة مرشح للتصوير mCherry.

2. خلية ثقافة

1. ثقافة الخلايا U2OS يعبرون عن مستقر للminiSOG وmCherry الموسومة البروتينات إصلاح في ظل الظروف المذكورة في الخطوة 1.1. زراعة خلايا إلى 80٪ confluency في 35 ملم الزجاج صحن قطره السفلي يحتوي على 2 مل من DMEM. تأكد من أن الصمغ الذي تولى تغطية زلة لالبلاستيك والبلاستيكية المستخدمة مقاومة للالمحاليل المائية والكحولية ومقاومة للالراتنج المستخدم!
2. قبل إجراء التجربة، الخطوط العريضة لمنطقة صغيرة من حوالي 1 ملم ² يحتوي على الخلايا معربا عن البروتينات خارج الرحم بواسطة الخدش بالقلم الماس عقيمة باستخدام المجهر مضان لتحديد المنطقة ذات الاهتمام. وبدلا من استخدام ر الطبق أسفل الزجاجيحتوي على قبعة ساترة مع نظام الشبكة قبل محفورا في صلب ساترة.
   ملاحظة: في حالة استخدام عالية الجودة المجهر مترابط يجمع بين ESI ومضان الصور المجهرية ^21، تأكد من أن سمك ساترة متوافق مع أهداف الغمر النفط. يجب أن يكون سمك رقم 1.5 (0،16-0،18 مم). اختيار منطقة قريبة من وسط الطبق في المنطقة لفحصها في TEM من أجل تجنب المشاكل مع البلمرة من الراتنج التي قد تحدث بالقرب من حواف (انظر النقطة 4،10-4،13).

3. DNA الأضرار التعريفي

1. أشرق الخلايا مع أشعة غاما، واستخدام المخدرات محاك للإشعاع، أو حث الأضرار التي أشعة الليزر الجزئي على المجهر متحد البؤر (على سبيل المثال، كما هو موضح في ^18،22 أو ^23).
2. في هذا المثال، أشرق الخلايا مع 2 و 6 جراى من أشعة جاما في microirradiate 137 السيزيوم مصدر الإشعاع أو ليزر باستخدام سول 405 نانومترليزر الحالة معرف المجهر متحد البؤر بعد توعية الخلايا لمدة 20 دقيقة مع 0.5 ميكروغرام / مل هويشت.

4. إعداد نموذج

1. إصلاح الخلايا مع 1 مل من 4٪ لامتصاص العرق تنبيه في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
   تنبيه: لامتصاص العرق وكاكوديلات الصوديوم سامة! ارتداء القفازات والتخلص من المواد السامة بشكل كاف.
2. غسل الخلايا مرتين مع 4 مل من 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة أو العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4.
3. علاج الخلايا الثابتة مع 2 مل 50 ملي الجلايسين، 5 ملي aminotriazole و 10 ملي سيانيد البوتاسيوم تنبيه في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو 0.1 M العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة) (فحص درجة الحموضة!) لمدة 30 دقيقة من أجل منع المتفاعل مجموعة ألدهيد وقمع أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن مجموعة الهيم، والتي يمكن أن تزيد من الخلفية.
   تنبيه: سيانيد البوتاسيوم السامة للغاية! Wقفازات الأذن، تعمل تحت غطاء والتخلص من المواد السامة بشكل كاف. رد فعل حساس جدا لدرجة الحموضة لذلك من المهم أن الرقم الهيدروجيني التحقق منها ودقيقة.
4. تسجيل المنطقة التي تم تحديدها في الخطوة 2.2 في 2D أو 3D على مجهر مضان مقلوب، إذا كان المطلوب المجهري مترابط.
5. إعداد 1 ملغ / مل diaminobenzidine حل هيدروكلوريد تنبيه عن طريق وضع 10 ملغ قرص diaminobenzidine هيدروكلوريد في أنبوب microcentrifuge 2 مل. إضافة 980 ميكرولتر من H _{2 O} المقطر و 20 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز (11.65 م) وتخلط حتى الحل هو البني الفاتح وشفافة. تمييع هذا الحل في 0.1 M الفوسفات أو 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في حين ضبط درجة الحموضة وهيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة بين 7.0 و 7.6 (يوصى 7.4 درجة الحموضة).
   تنبيه: Diaminobenzidine سامة! ارتداء القفازات والتخلص من المواد السامة بشكل كاف.
6. لphotooxidation، صeplace العازلة مع 2 مل من 1 ملغ / مل حل هيدروكلوريد diaminobenzidine في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو العازلة الفوسفات. حماية هذا الحل بعيدا عن الضوء وتبريده على الجليد إلى 4 ^{درجة مئوية} وذلك لزيادة قابلية ذوبان الأوكسجين. تشبع حل مع الأوكسجين من قبل محتدما الأكسجين من خلال حل (استخدام خرطوم التي يتم إدراجها في الحل ومتصلة زجاجة الأكسجين). تحقق من درجة الحموضة مرة أخرى وضبط إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: من المهم جدا للتفاعل photooxidation أن الرقم الهيدروجيني ما بين 7.0 درجة الحموضة ودرجة الحموضة 7.6.
7. تركيب الطبق مع الخلايا الثابتة بعناية على مجهر مضان مقلوب مجهزة 40X الغمر النفط عدسة موضوعية ونقلها إلى مجال الاهتمام. تثير علامة miniSOG مع الضوء الأزرق باستخدام مكعبات تصفية GFP أو الحراجية. MiniSOG لديه الحد الأقصى الإثارة في 448 نانومتر مع الكتف في 473 نانومتر ^10.
8. تواصل مع الإضاءة حتى بعد الأخضر miniSOG مضان هكتارق اختفى تماما وحتى البني المنتج التأكسد الضوئي للdiaminobenzidine بلمرة يظهر في القناة الخفيفة المرسلة. عندما يكون المنتج أكسدة مرئيا في معظم الخلايا، وإيقاف الإضاءة مضان لوقف التأكسد الضوئي.
   ملاحظة: صور للأكسدة يمكن أن تصل إلى عدة دقائق اعتمادا على العدسة الشيئية، موجات الإرسال مرشح والكفاءة، ومصدر الإضاءة.
9. بوستفيكس الخلايا مع 1 مل من 2٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M الصوديوم كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة عازلة أو الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة.
10. إصلاح أغشية الخلايا مع 0.1٪ -0.5٪ رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 20 دقيقة في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات درجة الحموضة 7.4 أو 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.4.
    ملاحظة: من المستحسن استخدام أقل تركيز ممكن من رباعي أكسيد الأوزميوم اللازمة لتحقيق الاستقرار في الأغشية. منذ رواسب DAB بلمرة لديها كثافة عالية من النيتروجين، والتي يمكن الكشف عنها مباشرة من قبل ESI، قويةالأوسيميوم تلطيخ ليس من الضروري التعرف على البروتين miniSOG الموسومة، وربما تكون ضارة للESI. رباعي أكسيد الأوزميوم هي سامة جدا! العمل في غطاء الدخان والتخلص من النفايات السامة بشكل كاف.
11. يذوى، الخلايا من خلال سلسلة الإيثانول باستخدام 30٪، 50٪، 70٪، 90٪، 98٪ 100٪ خطوات الإيثانول (كل 5 دقائق). وفي وقت لاحق، واحتضان الخلايا في 1: مزيج 1 من الإيثانول بنسبة 100٪ وراتنج الأكريليك (LR الأبيض) ووضع طبق على شاكر لمدة 4 ساعات لتسهيل تسلل إلى الخلايا قبل احتضان الخلايا على الأقل ساعة 4 أخرى في 100 راتنج الأكريليك٪ (LR الأبيض).
12. من أجل بلمرة الراتنج، وقطع غطاء من المسمى 2 مل أنبوب microcentrifuge بشفرة حلاقة ومعطف حافة مع الاكريليك الراتنج دواسة البنزين. تأكد من أن مسرع لا يغطي سوى حافة ولا تتدفق في أنبوب. وفي وقت لاحق، وملء بعناية أنبوب حوالي ثلثي مع الراتنج LR الأبيض باستخدام ماصة باستور. الحرص على أن الراتنج لا تحصل على اتصال خفة دمح المسرع على حافة!
13. إزالة الراتنج التي تسلل الخلايا في الطبق ووضع الطبق رأسا على عقب على تستقيم أنبوب microcentrifuge دائمة بحيث عرض أنبوب يملأ تماما تقريبا حتى الزجاج مغطى نافذة مراقبة الطبق.
14. الانتظار 1-2 دقائق للمعجل لختم الأنبوب وساترة، ثم عكس الأنبوب بحيث الراتنج في أنبوب يغطي الآن الخلايا.
15. وضع الطبق مع الأنبوب في فرن عند 60 ° C وعلاجه لمدة 12 ساعة.
16. عندما يتم الشفاء كتلة، وإزالة الطبق مع المرفقة مليئة الراتنج أنبوب microcentrifuge من الفرن وفصل أنبوب microcentrifuge من الطبق. تسهيل الفاصل تجميد أذاب دورات في النيتروجين السائل والماء الساخن.
17. تجاهل الطبق أسفل الزجاج وقطع بعناية فتح أنبوب microcentrifuge بشفرة حلاقة لإزالة كتلة.
18. تسمية كتلة مع علامة دائمة.
19. استخدام شفرة حلاقة لتريم كتلة بحيث لا شيء ولكن المنطقة 1 مم ² الذي يحتوي على منطقة تميزت سابقا مع الماس أو التنغستن القلم (أو يحتوي على منطقة مع خلايا الفائدة) لا يزال قائما.
20. جبل كتلة في مشراح مستدق، وتقليم كتلة بسكين وتقليم وقطع الأجزاء رقيقة جدا من حوالي 50 نانومتر باستخدام سكين الماس.
21. التقاط المقاطع على عالية لنقل 300 شبكات سلكية. هذه الشبكات لها الحانات شبكة صغيرة جدا، وبالتالي تغطي أقل من الخلايا في مجال الاهتمام.
22. معطف المقاطع على شبكات مع حوالي 0،2-0،4 نانومتر من الكربون يستخدم المغطي الكربون للمساعدة في استقرار منهم تحت شعاع الالكترون من TEM.

5. المجهر الإلكتروني

1. تحميل الشبكات إلى TEM التي تم تجهيز مع مرشح الطاقة. بعد ضبط المجهر ومرشح الطاقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وفحص الخلايا على المقاطع في وضع التكبير المنخفض (انتقال طبيعي) وقارنلهم مضان البيانات عند الاقتضاء (حصلت عليه في الخطوة 4.4).
2. مرة واحدة في النواة مع ميزات مثيرة للاهتمام (DNA الضرر المسار أو إصلاح الحمض النووي البؤر) وجدت، والتحول إلى وضع الترشيح الطاقة وتسجيل خريطة سمك.
   ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء تسجيل صفر الخسارة وصورة غير المرشحة. سمك يصل إلى 0.3 تعني المسار الحر (30٪ من الإلكترونات من شعاع حادث يحصل متفرقة عن طريق العينة) هي رقيقة بما يكفي لتوليد خرائط عنصري جيدة.
3. نسبة قياسية خرائط الفوسفور والنيتروجين العناصر باستخدام البرمجيات التي تسيطر على مرشح الطاقة من الاداة المستخدمة. تسجيل الخريطة الفوسفور الصور آخر الحافة على 175 فولت فقدان الطاقة مع عرض الشق من 20 فولت وقبل حافة الصور عند 120 فولت فقدان الطاقة، وأيضا مع عرض الشق من 20 فولت. لخرائط النيتروجين، وسجل آخر حافة الصور في 447 فولت مع عرض الشق من 35 فولت وقبل حافة الصور في 358 فولت، وأيضا مع عرض الشق من 35 فولت.
   ملاحظة: بما أن محتوى العناصر المصورة (phosphorus والنيتروجين) منخفضة نسبيا (حوالي 1٪)، اختر "صورة نسبة" (خريطة عنصري النوعية) على "طريقة 3 النافذة" (quantitate خريطة عنصري) من أجل توليد الصور مع إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء.

تجهيز 6. صورة

1. فتح الخرائط نسبة عنصري في برامج معالجة الصور التي يمكن التعامل مع تنسيق ملف الصور المنقولة (على سبيل المثال، صورة مجهرية رقمية). نسخ خريطة النيتروجين في القناة الحمراء وخريطة الفوسفور في القناة الخضراء صورة RGB، ثم ركب ومحاذاة الخرائط.
2. تصدير صورة مركبة باعتباره الموسومة شكل ملف صورة (TIFF) ملف. فتح الصورة في صورة برامج معالجة التي يمكن استخدام طبقات (على سبيل المثال، فوتوشوب).
3. ضبط مجموعة ديناميكية من كل قناة من خلال إعادة قياس الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم في الصورة إلى مجموعة البيانات 8 بت (0-255).
4. طرح محتوى الفوسفور من الخريطة النيتروجين (باستخدام"الطبقات" نافذة) من أجل توليد خريطة النوعية التي تبين توزيع البروتين.
5. تحويل الخرائط من الحمض النووي (الفوسفور) والبروتين (النتروجين) التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة إلى "اللون المفهرس" وإنشاء جدول بحث الأصفر في الفضاء لون CMYK لخريطة تبين توزيع الحمض النووي وطاولة السماوي بحث لعرض خريطة غير البروتين النووي. ويتم اختيار الألوان لتوليد أقصى قدر من التناقض بين اثنين من خرائط عنصري.
6. خلق صورة جديدة واستيراد الخرائط التي تبين توزيع الفوسفور وبروتين كما طبقات مختلفة. استخدام "شاشة" وضع الشفافية من أجل أن نرى كل من طبقات متراكبة على بعضها البعض.
7. فتح الصورة صفر فقدان المكتسبة في الخطوة 5.2. هذه الصورة تمثل صورة من المنطقة المسجلة والتي تبدو وكأنها صورة TEM التقليدية ولكن يحتوي فقط على الإلكترونات التي مرت من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة. تصديرهذه الصورة كصورة TIFF.
8. فتح تصدير صورة الخسارة صفر في محرر الصور ونسخها في الطبقة العليا من الصورة التي تظهر الخريطة عنصري. محاذاة الصورة باستخدام "الشاشة" واسطة الشفافية.
9. العتبة اختياريا صفر الخسارة الصورة لشريحة إشارة إلى أن تنبع من miniSOG. إضافة الصورة الناتجة كطبقة منفصلة كما هو موضح أعلاه.

النتائج

ESI

وبمقارنة الصور ESI للنواة (الشكل 1) مع الصور TEM التقليدية (على سبيل المثال، الشكل 7-1) يكشف عن زيادة كبيرة في البنى التشريحية التي يمكن تمييزها بسهولة. تظهر التلال لونين الأصفر وأنه من السهل جدا ...

Discussion

ESI يمكن أن تكون بمثابة أداة ممتازة لفحص حالات مختلفة من لونين وribonucleoproteins في النواة لأنه قادر على خريطة المناطق التي هي غنية في الفوسفور على وجه التحديد. وهو يعزز بشكل كبير من كمية التفاصيل التي يمكن الحصول عليها عن طريق المجهر الالكتروني وليس اعتمادا على الأساليب الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208 carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	Life Technologies	16000-044
G418	Life Technologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan