전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

요약

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

초록

광학 해상도 및 투과 전자 현미경에서 특정 단백질 집단을 식별 도전 제한은 세포 생물학에서 장애물왔다. 많은 현상 시스템의 단순화 된 시험 관내 분석에 의해 설명과 완전하게 이해되기 위하여, 특히 1 nm 내지 0.1 ㎛의 범위 사이에, 반응계 내에서 추가 구성 정보를 필요로 할 수 없다. 여기서, 전자 분광 이미징, 단백질 및 핵산의 분포의 동시 맵핑을 허용 투과 전자 현미경 기법 및 식 태그 miniSOG은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리 병소의 구조 및 조직을 연구하기 위해 결합된다.

서문

최근 몇 년 동안 ¹ 이상의 광학 현미경에서 상당한 발전에도 불구하고, 세포 생물 학자들은 여전히 해상도의 차이로 고통. 이 고분자 복합체 간의 상호 조정을 수반 기본적인 세포 과정의 구조 - 기능 관계의 이해를 제한 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링, DNA 수리, RNA의 전사 및 DNA 복제에). 투과형 전자 현미경 (TEM)이 필요한 해상도를 제공이야 있지만, 또한 시각 구조 생화학 적 조성물을 판별 할 수있는 동안 특정 단백질 라벨을 구조적으로 인해 무능력 이러한 프로세스를 정의하는 도전되었다. 핵 구조를 차별화하기 위해, 내부의 막 부재에있어서, 핵은 특히 도전왔다. 전자 분광 영상 (ESI)는 DNA, RNA, 및 PROT의 동시 검출 및 분화를 허용함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결핵 구조 ^2-5 EIN 기반.

전자 분광 영상 :

전자 현미경에서의 높은 감도 및 해상도의 원소 분포를 맵핑하기 위하여, 하나는 비탄 성적 시편 ⁽⁶⁾ 소자의 내부 쉘 전자와의 상호 작용을 통해 산란 된 전자를 선택 촬상 분광계를 사용할 수있다. 에너지의 원소가 특정 량의 시료 원자의 이온화의 결과로 소실되기 때문에,이 전자를 분리하고, 전자 현미경에 부착 된 분광계를 이용하여 가시화 될 수있다. 따라서, 검체와 상호 작용 한 전자 스펙트럼의 분석 시료 ^7의 원소 조성에 대한 정량적 정보를 보여준다. 시료를 통과 할 때의 에너지를 잃지 않는 전자는 전자 에너지 손실 "제로 손실의 피크"에서 발견스펙트럼. 이러한 전자 풍부 시험편의 질량, 밀도 및 두께에 관련되고, 시료에 충돌 또는 시험편을 통과하는 동안 에너지를 손실하지 않고 시료를 통과하는 전자가 구성된다. 이 정보는 시료 ^8의 특정 원소 존재의 원자 수의 절대 정량에 유용 할 수있다.

생물학적 시료는 중금속을 사용하는 대부분의 저조한 TEM 입사 빔 내의 전자를 편향 광 소자, 염색 방법으로 구성되어 있기 때문에 염 샘플 콘트라스트를 생성하기 위해 적용되어야한다. 이들 조영제 및 무능력 대부분 특이성이 가능 하나 이상의 얼룩을 시각화하는 특이성의 결여는 핵의 연구에서, 종래의 전자 현미경의 값을 한정 하였다. ESI 특히 세포 핵의 구조 연구를 위해, 종래의 TEM에 비해 상당한 장점을 갖는다.이는 단백질 복합체로부터 핵 단백질 복합체를 구별하는 핵산들의 밀도에 기초하여 다른 핵 단백질 복합체를 해결하기 위해 DNA- 및 RNA 함유 고분자 복합체 인 풍부한 자연을 활용하는 것이 가능하다. 나머지 생체 물질을 질소의 그 풍부한 기반으로 묘화 될 수있다. 다른 해부학 적 구조 내에서의 분포와 상대 풍요의 매핑 바로이 두 요소와 분석은 핵에 대한 많은 정보를 우리에게 제공한다. 예를 들어, 염색질 및 인을 풍부하게 표현하는 맵 리보솜을 쉽게 식별 할 수있다. interchromatin 공간 핵공 복합체와 핵 체는, 다른 한편으로는, 쉽게 질소 맵 이미지에서 검출 될 수있다.

미니 중항 산소 발생기 시스템 (miniSOG)

ESI는 강력한 기술을 나타낸다는 가지고 있기 때문에 현장 크로 마틴 구조에서 공부하기인 및 질소 원소 사이의 조성 비율의 특성의 장점은, 원소 조성은 일반적으로 단백질 복합체의 여러 집단 구별하는데 사용될 수 없다. 나노 미터 범위의 작은 금 입자로 표지 된 항체는 널리 개별 분자의 위치를​​ 매핑하는데 사용되어왔다. 금 입자는 일반적으로 이차 항체에 부착되어 있기 때문에, 차 항체에 의해 검출 에피토프 주위 약 20nm의 원주 내에 표시한다. 매립 후 샘플에서, 항체는 단 부분의 표면에 노출 된 에피토프를 검출 할 수있다. 그것은, 얻어진 정보를 항원의 존재를 입증하고 셀의 특정 해부학 적 구조에 관련시키는 것이 가능하지만 에피토프의 대부분이 수지에 의해 가려 때문에, 불완전하다. 걸쳐 항원에 대한 액세스를 허용, 형광 현미경에 사용되는 것과 유사한 프로토콜을 사용하는 기술을 미리 매립시료의 전체 깊이 있지만, 일반적 지질막의 제거를 요구하고 알데하이드에 의해 고정 될 수없는 요소를 제거 항체가 세포에 침투하도록 허용해야 투과성으로 단계. 또한, 미세 구조 보존, 글루 타르 알데히드에 대한 선호 알데히드 정착액은, 일반적으로 그 결과, 파라 포름 알데히드는 일반적으로 필요하며, 항원을 파괴하고. 이 단백질 - 단백질 가교에 덜 효과​​적이다. 금 나노 입자와 함께 표시되어 항체의 또 다른 단점은 금이 약한 콘트라스트가 샘플, 흥미로운 세부 구조를 모호 할 수있는 강한 대비를 생성하는 매우 전자 밀도가 높은 물질 것입니다.

발현 된 단백질 태그와 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 출현은 세포 생물학의 질문에 대답하기 위해 형광 현미경의 사용을 변형시켰다. 작은 형광 도메인과 단백질에 태그를 지정하면 생체 내에서 유통의 매핑을 할 수 있습니다 의 구조를 변경할 수 투과성으로 절차 없이도. 현미경 일렉트론 세포 단백질 분포를 매핑하는 단백질 태그 사용의 우아한 원리를 번역하기 위해, 시스템은 관심 구조 신호 확대를 제조하고 TEM에 콘트라스트를 생성 할 수 있다는 것을 필요로 하였다. 중합 미노 종종 결합 항체를 검출하기 위해 사용된다 조직학 얼룩이다. 이 얼룩은 일반적으로 이차 항체에 접합 된 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 사용하여 증착된다. 반응이 안정적인 결과를 생성하지만, HRP는 셀 ^(9)의 세포질에 촉매 활성이 아니다. 그들의 해상도 nanogold 방법 ^10보다 더되도록 HRP의 반응 생성물도 생성 부위에서 멀리 확산 될 수있다. 이러한 문제를 우회하기 위해, 플래시 / ReAsH 시스템 ^(11)을 개발 하였다. 그것은 tetracysteine​​ 모티브를 가지고 재조합 융합 단백질로 구성되어 있습니다. 이 모티브의 결합을 할 수 있습니다biarsenic 형광. 여기 된 때, 결합 또는 플래시 ReAsH는 태그 단백질의 부위에서 즉시 침전 합체에 고도로 반응성 일 중항 산소 따라서 photoconvert 디아 미노 벤지딘 (DAB)를 생성 할 수있다. DAB 중합체는 전자 밀도가되므로 TEM에서 재조합 융합 단백질의 분포를 매핑하는 데 사용할 수있는 산화 오스뮴으로 염색 할 수있다.

2011 년, 슈 등. ^(10)는 형광 및 448 nm의 푸른 빛으로 흥분 할 때 많은 중항 산소 라디칼을 생성 할 수있는 애기 장대의 flavoprotein에서 파생 된 작은 106 아미노산 융합 태그로 구성 miniSOG 시스템을 발표했다. 그 중항 산소 라디칼에 immunogold 및 표지 항체 ^(11)보다 상당히 더 가까운 태그 단백질의 표면 근처의 중합체를 형성하기 위해 광을 디아 미노 벤지딘이 산화하는데 사용될 수있다. 플래시 / ReAsH 시스템은 플루오로 데리고가 필요하지만크롬 광을하기 전에 세포에 디아 미노 벤지딘, miniSOG 시스템은 미노와 빛을 필요로하고 추가로 미노를 중합에서 약 두 배의 효과가있다. 여기서, miniSOG는 DNA 복구 병소의 미세 구조를 매핑하기 위해 ESI와 조합하여 사용된다.

DNA 수리 초점 (DRF)

그들은 전좌 및 유전 정보의 손실을 초래할 수 있기 때문에 복구되지 않은 DNA 이중 가닥 나누기는 세포에 심각한 위협을 제기. 차례로,이 노화, 암, 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리에 관여하는 많은 단백질은 ^{12 ~ 14을} 깰 DNA 이중 가닥 주위에 조립 초점에 축적. 그 기능이 알려져 있지 않지만, 그들은 DNA 이중 가닥 나누기를 포함하고 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 사이트입니다 핵의 위치를​​ 나타냅니다.

DNA 수리 FOCI (DRF)는 형광 현미경에 의해 특성화되었다 그들은 DNA 손상 ^12,15위한 바이오 마커로서 작용한다. 그들은 이중 가닥 브레이크의 크기에 대규모 상대적 최근 슈퍼 해상도 현미경 연구는 각각 ¹⁶ 초점 내 분자의 서브 구획화의 증거를 공개 할 때까지 상대적으로 균일 한 고려되었다. 이러한 사이트가 구성되는 방법을 이해하기 위해서는, 서로에 기초 생물학적 구조의 모든 상대적인 시각화하는 것이 필요하다. 이것은 형광 현미경에 의해 달성되지만 전자 현미경 ^{(17, 18)를} 통해 가능하다 할 수 없다. 여기서, 방법은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 미세 구조를 조사하기 위해,이 접근 방식의 조합의 가능성을 설명하기 miniSOG 방법으로 전자 분광 이미징을 결합한 것이 기재되어있다.

프로토콜

miniSOG 셀 라인의 1 세대

1. 5 % CO _2의 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된다 저 글루코스 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 2 ㎖를 함유하는 35mm 접시에 U2OS (인간 골육종) 세포 성장 분위기입니다.
2. 그들은 miniSOG 및 mCherry위한 서열을 포함하는 플라스미드 작 제물이 형질 감염 시약 ^(19)의 제조자의 프로토콜에 따라 복구 단백질 태그 정제 형질 품질 (A269 / 280 비율 1.8 ~ 2.0)와 리포 펙션에 의해 80 % 컨 플루 언트가 될 때 세포를 형질 감염. miniSOG 발현 플라스미드는 첸 - 연구소에서 주문할 수 있습니다 : http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. 이틀 후 형질을 정렬 형광 활성화 셀 miniSOG과 mCherry 태그 재조합 단백질을 발현 정렬 세포. 세포를 수집^{20 과발현되는} 셀을 방지하기 위해 중간 형광 강도.
4. 배양 10 % FBS 및 G418 선택 에이전트 (네티) 0.6 μg의 / ㎖로 보충 된 DMEM 배지 10ml에 10cm 접시에 양성 세포.
5. 눈에 보이는 식민지 판에 등장 한 후, mCherry 긍정적 인 식민지를위한 화면이 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 영구 마커 (접시의 바닥에) 그들 주위에 원을 그립니다. 낮은 배율 공기 대물 렌즈 (예를 들어, 10 배)를 사용하여 조심스럽게 무균 1,000 μL 피펫 팁으로 그들을 빨아 천천히 떨어져 식민지를 긁적에 의해 멸균 기술을 사용하여 클론을 선택합니다.
6. 선택된 콜로니를 확장 및 10 % 디메틸 설폭 사이드와 보충 단계 1.1에 기재된 성장 배지를 사용하여 이들 부품을 동결. 멸균 18 X 18mm ² 커버 슬립에 그들을 성장에 노출시킴으로써 DRF 형성 세포를 테스트방사선의 2 Gy를. 안정적 miniSOG mCherry 발현 조사 세포 mCherry을 이미징 필터 세트하여 형광 현미경으로 가시화 될 때 복구 단백질 DSBs의 전형적인 패턴 초점 특성을 보여야 태그.

2. 세포 배양

1. 문화 U2OS 세포를 안정적으로 miniSOG을 표현하고 mCherry 단계 1.1에 설명 된 조건에서 수리 단백질 태그. DMEM 2 ㎖를 함유하는 35mm 직경의 유리 바닥 접시에서 80 % 컨 플루 언시에 셀을 성장한다. 플라스틱 및 사용 된 플라스틱으로 커버 슬립을 부착 접착제가 사용되는 수지 수성 알코올 용액에 대한 내성과 내성이 있는지 확인하십시오!
2. 실험을 수행하기 전에, 관심 지역을 식별하기 위해 형광 현미경을 이용하여 무균 다이아몬드 펜으로 긁어서 이소성 단백질을 발현하는 세포가 포함 약 1mm ^(2)의 작은 영역을 설명합니다. 또한 유리 바닥 접시 (T)를 사용모자는 커버 슬립에 내장 된 사전 에칭 그리드 시스템과 coverslip에 포함되어 있습니다.
   참고 : ESI과 형광 현미경 사진 ^(21)을 결합 고품질의 상호 현미경을 사용하는 경우, 커버 슬립의 두께가 기름 침지 목표와 호환되는지 확인하십시오. 그것은 두께 제 1.5 (0.16-0.18 mm)를 가져야한다. 영역이 에지 근처에서 발생할 수있는 수지의 중합 문제를 방지하기 위해 TEM에서 검사하기 위해 접시의 중앙 부근의 영역을 선택 (점 4.10에서 4.13 사이를 참조).

3. DNA 손상 유도

1. 감마 방사선을 조사 세포 radiomimetic 약물을 사용하거나, ^{(18, 22} 또는 ^23에 기재된 바와 같이, 예) 공 초점 레이저 현미경에 마이크로 조사에 의한 손상을 유도한다.
2. 이 예에서, 405 nm의 졸을 사용하여 세슘 -137 방사선 소스 또는 레이저 microirradiate에서 감마선 조사의 2 Gy를 6으로 셀을 조사0.5 μg의 / ㎖ 훽스트 (Hoechst)와 20 분 동안 세포를 감작 후 공 초점 현미경의 ID 상태 레이저.

4. 샘플 준비

1. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 또는 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 4 % 파라 포름 알데히드주의 1 ㎖로 세포를 고정한다.
   주의 : 파라 포름 알데히드 나트륨 cacodylate는 독성이! 장갑을 착용하고 적절하게 독성 물질을 폐기하십시오.
2. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4 인산염 완충액 pH 7.4의 4 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
3. 2 ㎖의 50 mM의 글리신과 고정 세포를 치료, 5mM의 aminotriazole 30 분 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.4)에 10 mM의 시안화 칼륨주의 (pH를 체크!) 미 차단하기 위해서 알데히드기 및 백그라운드를 증가시킬 수있는, 헴 그룹에 의해 생성 된 활성 산소 종을 억제.
   주의 : 칼륨 시아 나이드는 매우 독성이! W귀 장갑, 후드에서 작동하고 적절하게 독성 물질을 폐기하십시오. 그 pH를 확인하고 정확한 것이 중요하므로, 반응의 pH는 매우 민감하다.
4. 상호 현미경이 필요한 경우, 반전 된 형광 현미경에 2D 또는 3D 단계 2.2에서 선택한 영역을 기록한다.
5. 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 10 mg의 디아 미노 벤지딘 염산염 태블릿을 배치하여 1 ㎎ / ㎖ 디아 미노 벤지딘 염산염주의 용액을 제조 하였다. 증류수 진한 염산 (11.65 M)의 ₂ O 20 μL의 980 μL를 추가하고 솔루션은 밝은 갈색 반투명 때까지 섞는다. 7.0와 7.6 사이의 pH를 수산화 나트륨으로 pH를 조정하는 동안 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도 0.1 M 인산 나트륨, 0.1 M cacodylate 버퍼에서이 용액을 희석 (PH 7.4이 권장된다).
   주의 : 미노는 독성이! 장갑을 착용하고 적절하게 독성 물질을 폐기하십시오.
6. 광산화, R 용eplace 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 또는 인산염 버퍼에 1 ㎎ / ㎖ 디아 미노 벤지딘 염산염 용액 2 ㎖와 버퍼. 빛이 용액을 보호하고, 산소의 용해도를 증가시키기 위해 4 ^O를 C로 얼음에서 식힌. (용액 내에 삽입하고 산소 병에 연결된 호스를 사용) 용액을 통해 산소를 버블 링함으로써 산소를 포화 용액. 다시 pH를 확인하고 필요한 경우 조정합니다.
   참고 : pH가 7.0, pH가 7.6 사이에있는 광산화 반응에 매우 중요합니다.
7. 조심스럽게 40 배 오일 침수 대물 렌즈가 장착 거꾸로 형광 현미경에 고정 된 세포와 접시를 탑재하고 관심 영역으로 이동합니다. GFP 또는 CFP에 대한 필터 큐브를 사용하여 푸른 빛 miniSOG 태그를 자극. MiniSOG는 473 nm의 ^10에서 어깨와 448 nm에서 여기 최대 있습니다.
8. 심지어 녹색 miniSOG 형광 하 후 조명 계속완전히 사라지고 중합 디아 미노 벤지딘의 갈색 광산화 제품 투과광 채널에서 나올 때까지이야. 산화 생성물은 세포의 대부분에서 볼 때, 광산화 정지 형광 조명을 끄.
   참고 : 사진 산화 대물 렌즈, 필터 전송 파장과 효율성 및 조명 소스에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
9. 후위 0.1 M 나트륨 cacodylate의 pH가 2 % 글루 타르 알데히드 1 ml의 7.4 버퍼 또는 30 분 동안 인산염 완충액 pH 7.4와 세포.
10. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4에서 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 20 분 동안 0.1 % -0.5 %의 산화 오스뮴과 세포의 세포막을 고정한다.
    주 : 세포막을 안정화하는 데 필요한 산화 오스뮴의 가장 낮은 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 중합 DAB 석출물 ESI, 강한 의해 직접 검출 될 수 질소의 높은 밀도를 갖기 때문에오스뮴 염색 miniSOG - 태그 단백질을 확인하고 ESI에 유해 할 수 필요가 없습니다. 산화 오스뮴은 매우 독성이! 흄 후드에서 작업하고 적절하게 유독성 폐기물을 폐기하십시오.
11. 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 98 % 100 % 에탄올 단계 (각 5 분)를 이용하여 에탄올 시리즈를 통해 탈수 세포. 계속해서, (1)에 세포를 배양한다 : 100 % 에탄올 및 아크릴 수지 (LR 화이트)의 1 믹스 100에서 적어도 다른 4 시간 동안 세포를 배양하기 전에 세포 내로 침투를 용이하게하기 위해 4 시간 동안 진탕 기 상에 요리를 넣어 % 아크릴 수지 (LR 화이트).
12. 수지를 중합하기 위하여, 면도날 및 아크릴 수지 코트 가속기 림으로 표지 된 2 ml의 마이크로 원심 튜브의 뚜껑을 잘라. 가속기는 림을 커버 튜브로 유입되지 않도록하십시오. 그 후, 조심스럽게 약 LR 화이트 수지는 파스퇴르 피펫을 사용하여와 3 분의 2를 튜브를 입력합니다. 수지가 접촉 재치로하지 않는주의H 림에 가속!
13. 접시에 세포를 침투 수지를 제거하고 튜브의 폭이 거의 완전히 접시의 유리 덮여 관찰 창을 채우도록 똑바로 서 microcentrifuge 관에 거꾸로 접시를 놓습니다.
14. 이어서, 튜브 및 커버 슬립을 밀봉 된 튜브에서 수지 이제 셀을 커버하도록 튜브를 반전 가속기 1 분에 2를 기다려.
15. 60 ° C의 오븐에 튜브 접시를 배치하고 12 시간 동안 그것을 경화.
16. 블록이 경화 될 때, 오븐에서 부착 수지 채워진 마이크로 원심 튜브 접시를 제거하고 접시로부터 마이크로 원심 분리 튜브. 액체 질소와 뜨거운 물에 동결 해동 사이클에 의해 분리를 용이하게합니다.
17. 유리 접시 바닥을 조심스럽게 폐기 블록을 제거하기 위해 면도날 microcentrifuge 관을 오픈.
18. 영구 마커 블록 레이블.
19. 트라이 위해 면도날을 사용하여이전 다이아몬드 또는 텅스텐 펜으로 표시 영역을 포함 (또는 관심있는 셀 영역을 포함) 1mm ² 영역은 아무것도 남아 있지 않도록 블록 m.
20. ,을 Ultramicrotome에서 블록을 탑재 트리밍 칼 블록을 잘라 내고 다이아몬드 칼을 사용하여 약 50 나노 미터의 매우 얇은 부분을 잘라.
21. 높은 전송 300 메쉬 그리드에 섹션을 선택합니다. 이 그리드는 매우 작은 격자 바 있고, 따라서 관심의 영역에서 적은 수의 세포를 커버한다.
22. 탄소 코팅의 약 0.2 ~ 0.4 nm의 TEM의 전자 비임하에 그들을 안정화하기 위해 탄소 코터와 격자에 섹션.

5. 전자 현미경

1. 에너지 필터가 장착되어 TEM에 그리드를 넣습니다. 현미경 및 제조자의 지시에 따라 에너지 필터를 조정 한 후, 저배율 모드 부분에 세포 검사 (통상 송신) 및 비교(단계 4.4에서 얻은) 적절한 때 그 데이터를 형광합니다.
2. 흥미로운 기능 (DNA 손상 트랙 또는 DNA 수선 병소)와 일단 핵 에너지 필터링 모드로 전환하는 결과와 두께 맵을 기록한다.
   주 :이 절차는 제로 손실과 필터링되지 않은 이미지의 기록을 포함한다. 0.3 최대 두께는 자유 경로 (입사 빔의 전자의 30 %가 시료에 의해 산란 얻는다) 좋은 원소 맵을 생성하기에 충분히 얇다을 의미한다.
3. 사용되는 현미경의 에너지 필터를 제어하는​​ 소프트웨어를 이용하여 요소의 인 및 질소의 레코드 비율 맵. 20 EV의 슬릿 폭 또한, 120 eV의 에너지 손실을 20 eV의 사전 가장자리 이미지의 슬릿 폭과 175 eV의 에너지 손실의 인지도 포스트 에지 영상을 기록한다. 또한 35 EV의 슬릿 폭과 358 eV의 35 eV의 사전 가장자리 이미지의 슬릿 폭과 447 eV의에서 질소지도, 기록 후 에지 이미지하십시오.
   주 : 촬상 소자의 콘텐츠 이후 (phosphorus 및 질소) (약. 1 %), 잡음비 신호가 더 나은 이미지를 생성하기 위해 "3 윈도우 법"을 통해 "비 이미지"(질적 원소 맵) (원소 맵을 정량)을 선택 비교적 낮다.

6. 이미지 처리

1. (예를 들어, 디지털 현미경 사진)의 획득 된 이미지 파일 형식을 처리 할 수있는 화상 처리 소프트웨어 원소 비율 맵을 연다. 빨강 채널과 RGB 이미지의 녹색 채널에 인지도에 질소 맵을 복사 한 다음 중첩 및지도를 맞 춥니 다.
2. 태그가 지정된 이미지 파일 형식 (TIFF) 파일로 합성 이미지를 내 보냅니다. 레이어를 사용하여, 화상 처리 소프트웨어 (예, 포토샵)에 화상을 연다.
3. 8 비트 데이터 세트 (0 ~ 255)로 이미지의 최소 및 최대 값을 재조정하여 각 채널의 동적 범위를 조정한다.
4. 질소를 이용하여 맵에서 인 함량을 (빼기단백질의 분포를 도시 질적 맵을 생성하기 위해 "레이어"윈도우).
5. "인덱스 컬러"에 이전 단계에서 생성 된 핵산 (인)와 단백질 (질소)의 맵을 변환하여 핵산 분포 및 시안 룩업 테이블을 도시 맵 CMYK 색 공간에서 노란색 룩업 테이블을 만들 비 핵 단백질지도를 표시합니다. 색상은 두 원소지도 사이의 최대 대비를 생성하기 위해 선택된다.
6. 다른 레이어로 인 단백질의 분포를 보여주는지도를 새로운 이미지를 만들고 가져옵니다. 서로 중첩 양 층을보기 위해 "화면"투명도 모드를 사용한다.
7. 단계 5.2에서 획득 한 제로 손실 이미지를 엽니 다. 이 이미지는 기존의 TEM 이미지처럼 보이는 기록 영역의 이미지를 나타내는하지만 시편과 충돌하지 않고 시료를 통과 한 전자를 포함하고 있습니다. 수출TIFF 이미지로이 이미지.
8. 사진 편집기에서 내 보낸 제로 손실 이미지를 열고 원소지도를 보여주는 이미지의 최상층에 복사합니다. "화면"투명도 모드를 사용하여 이미지를 맞 춥니 다.
9. 선택적으로 임계 값 세그먼트 제로 손실 이미지 miniSOG에서 유래 신호. 상술 한 바와 같이 별도의 레이어로 생성 된 이미지를 추가합니다.

결과

ESI

종래의 TEM 이미지로 핵 (도 1)의 ESI 이미지를 비교 (예를 들어,도 7-1)은 쉽게 구별 될 수 해부학 적 구조에서 극적인 증가를 보여준다. 염색질 능선은 노란색으로 표시하고 마우스 세포에서 chromocenters를 확인하는 것은 매우 쉽습니다. 사전 조립 리보솜 이미 인이 풍부 RNA에 더하여, 질소 풍부 단백질의 다량을 함유 보낸 핵...

토론

ESI는 특별히 인이 풍부 영역을 매핑 할 수 있기 때문에 핵에서 염색질 및 리보의 여러 가지 상태를 조사하기위한 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 이는 근본적으로 전자 현미경에 의해 얻어진 비특이적 대조 방법에 의존하지 수 상세히의 양을 증대시킨다. ESI 하나의 단점은 동일한 가속 전압에서 TEM 종래보다 얇은 부분을 필요로한다는 것이다. 이것은 직렬 섹션 작업 또는 단층 ^{(28)의 방법...}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208 carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	Life Technologies	16000-044
G418	Life Technologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan