Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

Resumen

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Resumen

Los límites a la resolución óptica y el reto de identificar poblaciones específicas de proteína en microscopía electrónica de transmisión han sido obstáculos en la biología celular. Muchos fenómenos no se pueden explicar mediante análisis in vitro en los sistemas simplificados y necesitan información estructural adicional in situ, en particular en el rango entre 1 nm y 0,1 m, con el fin de ser plenamente comprendido. Aquí, imágenes espectroscópicas de electrones, una técnica de microscopía electrónica de transmisión que permite el mapeo simultáneo de la distribución de las proteínas y ácidos nucleicos, y una etiqueta de expresión, miniSOG, se combinan para estudiar la estructura y organización de ADN de doble hebra focos romper la reparación.

Introducción

A pesar de los importantes avances en microscopía de luz en los últimos años ^1, celulares biólogos todavía sufren de una brecha en la resolución. Esto limita la comprensión de las relaciones estructura-función en los procesos celulares fundamentales que implican la interacción coordinada entre los complejos macromoleculares (por ejemplo, en remodelación de la cromatina, la reparación del ADN, el ARN transcripción y replicación de ADN). Aunque los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) es proporcionar la resolución necesaria, ha sido un reto para definir estos procesos estructuralmente debido a la incapacidad para etiquetar proteínas específicas al mismo tiempo ser capaz de determinar la composición bioquímica de las estructuras visualizadas. En ausencia de membranas internas para ayudar a diferenciar las estructuras nucleares, el núcleo ha sido particularmente difícil. Electron espectroscópica de imágenes (ESI) resuelve algunas de estas limitaciones, permitiendo la detección simultánea y diferenciación de ADN, ARN y protein-basada estructuras nucleares ^2-5.

Electron imágenes espectroscópicas:

Con el fin de mapear las distribuciones elementales a alta sensibilidad y resolución en el microscopio electrónico, se puede usar un espectrómetro de imágenes que selecciona los electrones que han sido dispersos inelásticamente través de interacciones con electrones de la capa interior de un elemento en la muestra ^6. Puesto que las cantidades de elementos específicos de la energía se pierden como consecuencia de la ionización de los átomos en la muestra, estos electrones se pueden separar y se visualizaron usando un espectrómetro que está unido al microscopio electrónico. Por lo tanto, el análisis del espectro de los electrones que han interactuado con el espécimen revela información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición elemental de la muestra ^7. Los electrones que no pierden energía cuando pasa a través de la muestra se encuentran en el "pico de pérdida cero" de la pérdida de energía de electronesespectro. La abundancia de estos electrones se relaciona con la masa, densidad y espesor de la muestra y se compone de electrones que pasan a través de la muestra sin chocar con la muestra o la pérdida de energía durante el paso a través de la muestra. Esta información puede ser útil para la cuantificación absoluta de los números de átomos de un elemento específico presente en la muestra ^8.

Dado que las muestras biológicas consisten principalmente de elementos ligeros que mal desvían los electrones en el haz incidente de la TEM, métodos de tinción usando sales de metal pesado tienen que ser aplicados con el fin de generar contraste en la muestra. La falta de especificidad de la mayoría de estos agentes de contraste y la incapacidad para visualizar más de una mancha donde es posible especificidad ha limitado el valor de la microscopía electrónica convencional en el estudio del núcleo. ESI tiene ventajas significativas sobre TEM convencional, en particular para el estudio de las estructuras del núcleo de la célula.Es posible explotar la naturaleza rica en fósforo de ADN y complejos macromoleculares que contienen ARN para distinguir los complejos de nucleoproteína de complejos de proteínas y para resolver diferentes complejos de nucleoproteína en función de su densidad de ácidos nucleicos. El material biológico restante se pueden obtener imágenes en base a su abundancia de nitrógeno. Asignación de sólo estos dos elementos y el análisis de su distribución y abundancia relativa dentro de las diferentes estructuras anatómicas nos proporciona una gran cantidad de información sobre el núcleo. Por ejemplo, es fácil identificar la cromatina y los ribosomas en el mapa que representan la abundancia de fósforo. El espacio interchromatin, complejos de poro nucleares, y los cuerpos nucleares, por otro lado, pueden detectarse fácilmente en la imagen del mapa de nitrógeno.

Mini sistema generador de oxígeno singlete (miniSOG)

Mientras ESI representa una poderosa técnica para el estudio de la estructura de la cromatina in situ, ya que tomas ventaja de las relaciones característicos en la composición elemental entre el fósforo y el nitrógeno, la composición elemental no puede normalmente ser usada para discriminar entre diferentes poblaciones de complejos de proteínas. Anticuerpos marcados con pequeñas partículas de oro en el rango nanométrico se han utilizado ampliamente para mapear la localización de moléculas individuales. Dado que la partícula de oro generalmente se une a un anticuerpo secundario, aparecerá dentro de una circunferencia de aproximadamente 20 nm alrededor del epítopo detectado por el anticuerpo primario. En las muestras post incrustación, los anticuerpos sólo pueden detectar los epítopos que están expuestos en la superficie de las secciones. Si bien es posible demostrar la presencia de un antígeno y relacionarlo con una cierta estructura anatómica de la célula, la información que se obtiene es incompleta, ya que la mayoría de los epítopos están oscurecidos por la resina. Técnicas, que utilizan protocolos similares a los utilizados para la microscopía de fluorescencia Pre-incrustación, permitir el acceso a los antígenos a lo largotoda la profundidad de la muestra pero los pasos de permeabilización que se requieren para permitir que el anticuerpo para penetrar en la célula típicamente requieren la eliminación de las membranas lipídicas y eliminar componentes que no pueden ser corregidos por aldehídos. Por otra parte, el fijador aldehído preferido para la preservación ultraestructura, glutaraldehído, comúnmente destruye epítopos y, en consecuencia, paraformaldehído se requiere típicamente. Esto es menos efectivo en la reticulación proteína-proteína. Otra desventaja de los anticuerpos que se etiqueta con una nanopartícula de oro es que el oro es un material muy denso en electrones que crea un fuerte contraste que puede oscurecer los detalles estructurales interesantes de la muestra, que tiene más débil contraste.

La aparición de la proteína verde fluorescente (GFP) como una etiqueta proteína expresada ha transformado el uso de microscopía de fluorescencia para responder a preguntas de la biología celular. Etiquetado de una proteína con un pequeño dominio fluorescente permite el mapeo de su distribución in vivo sin la necesidad de procedimientos de permeabilización que pueden alterar la estructura. Con el fin de traducir el principio elegante de la utilización de etiquetas de proteínas para mapear las distribuciones de proteínas en una célula de Microscopía Electrónica, se necesitaba un sistema que es capaz de producir una señal de cerca de la estructura de interés y generar contraste en el TEM. Diaminobencidina polimerizado es una mancha que se utiliza a menudo en la histología para detectar la unión del anticuerpo. Esta mancha se deposita normalmente utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con un anticuerpo secundario. Aunque la reacción produce un resultado fiable, HRP no es catalíticamente activo en el citosol de las células ^9. Los productos de reacción de HRP pueden también difunden lejos del lugar de generación de modo que su resolución es peor que el método Nanogold ^10. Con el fin de evitar estos problemas, el sistema / ReAsH FLASH fue desarrollado ^11. Se compone de proteínas de fusión recombinantes que poseen un motivo tetracisteína. Este motivo permite la unión deun fluoróforo biarsenic. Cuando excitado, el flash consolidado o ReAsH es capaz de generar el oxígeno atómico altamente reactivo y diaminobencidina tanto photoconvert (DAB) en un polímero que precipita inmediatamente en el lugar de las proteínas etiquetadas. El polímero DAB se puede teñir con tetróxido de osmio, que es denso en electrones y por lo tanto se puede utilizar para mapear la distribución de la proteína de fusión recombinante en el TEM.

En 2011, Shu et al. ¹⁰ presentó el sistema miniSOG, que consiste en una pequeña 106 amino ácidos etiqueta de fusión derivada de una flavoproteína de Arabidopsis que es fluorescente y capaz de crear muchos radicales de oxígeno singlete cuando se excita con luz azul 448 nm. Estos radicales de oxígeno singlete se pueden utilizar para diaminobencidina foto-oxidar para formar polímeros en y cerca de la superficie de la proteína etiquetada, que es considerablemente más estrecha que los anticuerpos marcados inmunoelectrónica ^11. Mientras que el sistema de flash / ReAsH requiere llevar el flúorcromo y la diaminobenzidina en las células antes de hacer la fotoconversión, el sistema miniSOG sólo requiere diaminobencidina y la luz y, además, es dos veces más eficaz en la polimerización de diaminobencidina. Aquí, miniSOG se emplea en combinación con ESI con el fin de mapear la ultraestructura de focos de reparación del ADN.

Focos de reparación del ADN (DRF)

ADN no reparado doble filamento se rompe representan una seria amenaza para la célula, ya que pueden dar lugar a translocaciones y pérdida de información genética. A su vez, esto puede conducir a la senescencia, el cáncer y la muerte celular. Muchas proteínas que están implicadas en la reparación de ADN de doble filamento romper acumulan en los focos que reunir en torno a una doble cadena de ADN romper ^12-14. Aunque su función no se conoce, que representan el sitio en el núcleo que contiene el ADN de doble capítulo romper y es el sitio de ADN de doble hebra de romper la reparación.

Foc reparación del ADNi (DRF) se han caracterizado por microscopía de fluorescencia y servir como biomarcadores de daño en el ADN ^12,15. Ellos son enormes en relación con el tamaño de la rotura de doble cadena y se consideraron relativamente homogénea hasta que los estudios de microscopía de super-resolución recientes revelaron algunas pruebas de sub-compartimentación de moléculas en cada enfoque ^16. Con el fin de entender cómo se organizan estos sitios, es necesario para visualizar todas las estructuras biológicos subyacentes respecto a la otra. Esto no se puede lograr mediante microscopía de fluorescencia, pero es posible a través de microscopía electrónica ^17,18. Aquí, se describe un método que combina imágenes espectroscópicas de electrones con el método miniSOG para ilustrar el potencial de este enfoque combinado para explorar la ultraestructura de reparación del ADN de doble filamento romper.

Protocolo

1. Generación de miniSOG líneas celulares

1. Crecer células U2OS (osteosarcoma humano) en una placa de 35 mm que contiene 2 ml de glucosa baja en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO ₂ atmósfera.
2. Transfectar las células cuando son 80% de confluencia mediante lipofección con la calidad de la transfección purificada (A269 / ratio de 280 1.8-2.0) construcciones de plásmidos que contienen las secuencias para miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación de acuerdo con el protocolo del fabricante del reactivo de transfección ^19. Los plásmidos de expresión miniSOG pueden ser solicitados a la Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. Ordenar las células que expresan la proteína recombinante con la etiqueta miniSOG y mCherry por fluorescencia de células activadas por la clasificación dos días después de la transfección. Recoger las célulascon la intensidad de fluorescencia intermedia con el fin de evitar las células que se sobreexpresan ^20.
4. Cultivar las células positivas en un plato de 10 cm en 10 ml de medio DMEM que se complementa con 10% de FBS y 0,6 g / ml del agente de selección G418 (geneticina).
5. Después de colonias visibles han surgido en las placas, de pantalla para colonias mCherry positivas usando un microscopio de fluorescencia invertido y dibujar círculos alrededor de ellos (en la parte inferior de la placa) con un marcador permanente. Use un lente objetivo de aire bajo aumento (por ejemplo, 10 veces) y recoger clones usando una técnica estéril por rascarse cuidadosamente las colonias fuera y lentamente chupar ellos en una punta de pipeta de 1.000 l estéril.
6. Expandir las colonias seleccionadas y congelar partes de ellos hacia abajo usando el medio de crecimiento descrito en el paso 1.1 suplementado con 10% de sulfóxido de dimetilo. Pon a prueba las células para la formación DRF cultivándolas en 18 x 18 mm ² cubreobjetos estériles y exponiéndolos a2 Gy de radiación. Las células irradiadas que expresan establemente un miniSOG mCherry etiquetados proteína de reparación debe mostrar el patrón típico característico focal de DSBs cuando visualizó con un microscopio de fluorescencia utilizando un filtro de set-para obtener imágenes de mCherry.

2. Cultivo Celular

1. Cultura U2OS células que expresan establemente el miniSOG y mCherry etiquetados proteínas de reparación en las condiciones descritas en el paso 1.1. Cultivan las células a 80% de confluencia en una placa de fondo de vidrio de diámetro 35 mm que contiene 2 ml de DMEM. Asegúrese de que el pegamento que une la hoja de la cubierta para el plástico y el plástico utilizado es resistente a las soluciones acuosas y alcohólicas y resistente a la resina utilizada!
2. Antes de realizar el experimento, esbozar una pequeña zona de aproximadamente 1 mm ² que contiene células que expresan las proteínas ectópicos por el rascado con una pluma de diamante estéril usando un microscopio de fluorescencia para identificar la región de interés. Alternativamente, puede utilizar un plato con fondo de cristal tsombrero contiene un cubreobjetos con un sistema de red pre-grabado al agua fuerte incorporado en el cubreobjetos.
   NOTA: Si utiliza la microscopía correlativa de alta calidad que combina ESI y fluorescencia imágenes microscópicas ^21, asegúrese de que el grosor del cubreobjetos es compatible con los objetivos de inmersión en aceite. Debe tener el espesor No. 1,5 (desde 0,16 hasta 0,18 mm). Elija un área cerca del centro del plato para la región a ser examinada en el TEM con el fin de evitar problemas con la polimerización de la resina que puede ocurrir cerca de los bordes (véase el punto 4.10 a 4.13).

3. ADN Inducción Daños

1. Irradiar las células con radiación gamma, utilice un fármaco radio, o inducir el daño por irradiación láser micro en un microscopio confocal (por ejemplo, como se describe en ^18,22 o ^23).
2. En este ejemplo, irradiar las células con 2 y 6 Gy de irradiación gamma en un microirradiate de cesio-137 fuente de radiación o láser usando el sol 405 nmIdentificación del láser de estado de un microscopio confocal después de la sensibilización de las células durante 20 min con 0,5 g / ml Hoechst.

Preparación 4. Muestra

1. Fijar las células con 1 ml de paraformaldehído al 4% en tampón cacodilato PRECAUCIÓN 0,1 M de sodio o en tampón fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 30 min a RT en la oscuridad.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y cacodilato de sodio son tóxicos! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas.
2. Lavar las células dos veces con 4 ml de tampón de cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o tampón fosfato pH 7,4.
3. Tratar las células fijadas con glicina 2 ml de 50 mM, 5 mM aminotriazol y 10 mM cianuro de potasio PRECAUCIÓN en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o un tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (comprobar el pH!) Por 30 min con el fin de bloquear sin reaccionar grupos aldehído y para suprimir la especies reactivas de oxígeno generadas por grupos hemo, que puede aumentar el fondo.
   PRECAUCIÓN: cianuro de potasio es extremadamente tóxico! Wguantes de oído, trabajan bajo una capucha y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas. La reacción es muy sensible a pH por lo que es importante que el pH verificados y precisa.
4. Registre el área que se seleccionó en el paso 2.2 en 2D o 3D en un microscopio de fluorescencia invertida, si se desea microscopía correlativa.
5. Preparar una solución de diaminobencidina 1 mg / ml de clorhidrato PRECAUCIÓN mediante la colocación de un comprimido de 10 mg de clorhidrato de diaminobencidina en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Añadir 980 l de _H2O destilada y 20 l de ácido clorhídrico concentrado (11,65 M) y mezclar hasta que la solución es de color marrón claro y translúcido. Diluir esta solución en 0,1 M de fosfato o tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a una concentración final de 1 mg / ml mientras se ajusta el pH con hidróxido de sodio a un pH entre 7,0 y 7,6 (pH 7,4 se recomienda).
   PRECAUCIÓN: Diaminobencidina es tóxico! Use guantes y disponer adecuadamente las sustancias tóxicas.
6. Para fotooxidación, replace el tampón con 2 ml de una solución de 1 mg / ml de diaminobencidina hidrocloruro en tampón cacodilato 0,1 M de sodio o tampón fosfato. Proteger esta solución de la luz y enfriarlo en hielo para 4 ^{o C} con el fin de aumentar la solubilidad del oxígeno. Saturar la solución con oxígeno burbujeando oxígeno a través de la solución (utilizar una manguera que se inserta en la solución y conectado a una botella de oxígeno). Comprobar el pH de nuevo y ajustar si es necesario.
   NOTA: Es fundamental para la reacción de foto-oxidación que el pH está entre pH 7,0 y pH 7,6.
7. Montar el plato con las células fijadas con cuidado sobre un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una lente de objetivo de 40x de inmersión en aceite y moverlo a la zona de interés. Excite la etiqueta miniSOG con luz azul utilizando cubos de filtro para las buenas prácticas agrarias o PPC. MiniSOG tiene un máximo de excitación a 448 nm con un hombro a 473 nm ^10.
8. Continuar con la iluminación, incluso después de que el verde miniSOG fluorescencia jas desaparecido por completo y hasta que el producto fotooxidación marrón del Diaminobencidina polimerizado emerge en el canal de la luz transmitida. Cuando el producto de oxidación es visible en la mayoría de las células, apagar la iluminación de fluorescencia para detener la foto-oxidación.
   NOTA: La foto-oxidación puede tardar varios minutos, dependiendo de la lente del objetivo, las longitudes de onda de transmisión del filtro y la eficiencia, y la fuente de iluminación.
9. Postfix las células con 1 ml de glutaraldehído al 2% en cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 tampón de pH o tampón de fosfato 7,4 durante 30 min.
10. Fijar las membranas de las células con 0,1% -0,5% de tetróxido de osmio durante 20 min en tampón cacodilato de sodio 0,1 M pH 7,4 o en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4.
    NOTA: Se recomienda el uso de la concentración más baja posible de tetróxido de osmio requerido para estabilizar las membranas. Puesto que los precipitados DAB polimerizados tienen una alta densidad de nitrógeno, que puede ser detectada directamente por ESI, un fuertetinción de osmio no es necesario identificar la proteína marcada con miniSOG y podría ser perjudicial para la ESI. El tetróxido de osmio es muy tóxico! Trabajar en una campana extractora y disponer adecuadamente los residuos tóxicos.
11. Deshidratar, las células a través de una serie de etanol usando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100 pasos de etanol (% cada 5 min). Posteriormente, se incuban las células en una mezcla 1: 1 de etanol al 100% y resina acrílica (LR White) y poner el plato en un agitador durante 4 horas para facilitar la infiltración en las células antes de la incubación de las células durante al menos otros 4 h en 100 resina acrílica% (LR White).
12. Con el fin de polimerizar la resina, cortar la tapa de un tubo de microcentrífuga de 2 ml marcado con un hoja de afeitar y recubrir el borde con acelerador de resina acrílica. Asegúrese de que el acelerador sólo cubre la llanta y no fluye en el tubo. Posteriormente, llenar cuidadosamente el tubo aproximadamente dos tercios con resina LR White usando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado de que la resina no entra en contacto ingenioh el acelerador en la llanta!
13. Retire la resina que se infiltró en las células en el plato y colocar el plato boca abajo sobre el tubo de microcentrífuga de pie en posición vertical para que el ancho del tubo se llena casi por completo la ventana de observación de vidrio cubierto del plato.
14. Espere 1 a 2 min para el acelerador para sellar el tubo y el cubreobjetos, a continuación, invertir el tubo de manera que la resina en el tubo cubre ahora las células.
15. Coloque el plato con el tubo en un horno a 60 ° C y curar durante 12 horas.
16. Cuando se cura el bloque, retire el plato con el tubo de microcentrífuga de llenado de resina adjunta del horno y separar el tubo de microcentrífuga de la antena. Facilitar la separación por ciclos de congelación-descongelación en nitrógeno líquido y agua caliente.
17. Deseche el plato con fondo de cristal y cortar cuidadosamente abrir el tubo de microcentrífuga con una hoja de afeitar con el fin de quitar el bloqueo.
18. Marque el bloque con un marcador permanente.
19. Utilice una hoja de afeitar a trim el bloque de manera que nada más que la región de 1 mm ² que contiene el área marcada previamente con el lápiz de diamante o de tungsteno (o contiene el área con las células de interés) se mantiene.
20. Monte el bloque en un ultramicrotomo, recorte el bloque con un cuchillo de cortar y cortar secciones ultrafinas de aproximadamente 50 nm usando un cuchillo de diamante.
21. Recoge las secciones de alta transmisión de 300 redes de malla. Estas rejillas tienen muy pequeñas barras de la rejilla y por lo tanto cubren menos células en el área de interés.
22. Cubra las secciones sobre las rejillas con aproximadamente 0,2 a 0,4 nm de carbono utilizando un dispositivo de recubrimiento de carbono para ayudar a estabilizar bajo el haz de electrones del TEM.

5. Microscopía Electrónica

1. Cargar las rejillas en un TEM que está equipado con un filtro de energía. Después de sintonizar el microscopio y el filtro de energía de acuerdo con las instrucciones del fabricante, inspeccionar las células en las secciones en el modo de bajo aumento (transmisión normal) y compararellos a la fluorescencia de datos cuando sea apropiado (obtenido en el paso 4.4).
2. Una vez que un núcleo con características interesantes (pista daño en el ADN o ADN focos de reparación) se encuentra, cambie al modo de filtrado de energía y registrar un mapa de espesor.
   NOTA: Este procedimiento incluye la grabación de una pérdida de cero y una imagen sin filtrar. Espesores de hasta 0,3 recorrido libre medio (30% de los electrones del haz incidente se dispersa por la muestra) son lo suficientemente delgada como para generar buenos mapas elementales.
3. Mapas de relación de registro de los elementos fósforo y nitrógeno utilizando el software que controla el filtro de la energía del microscopio usado. Registre el mapa de fósforo imágenes de borde posterior en 175 eV pérdida de energía con una anchura de rendija de 20 eV y pre-borde imágenes a 120 eV pérdida de energía, también con una anchura de rendija de 20 eV. Para los mapas de nitrógeno, grabar imágenes de borde posterior de 447 eV con un ancho de ranura de 35 eV y pre-borde imágenes a 358 eV, también con un ancho de ranura de 35 eV.
   NOTA: Debido a que el contenido de los elementos fotografiados (fosfOrus y nitrógeno) es relativamente baja (aprox. 1%), elija "Relación de Imagen" (mapa elemental cualitativo) sobre el "Método 3 ventana" (cuantificar mapa elemental) con el fin de generar imágenes con una mejor relación señal-ruido.

Procesamiento 6. Imagen

1. Abra los mapas elementales de relación en un software de procesamiento de imágenes que puede manejar el formato de archivo de las imágenes adquiridas (por ejemplo, Micrografía Digital). Copie el mapa de nitrógeno en el canal rojo y el mapa de fósforo en el canal verde de una imagen RGB, a continuación, superponer y alinear los mapas.
2. Exportar la imagen compuesta como un archivo de formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF). Abre la imagen en un software de procesamiento de imágenes que se pueden usar capas (por ejemplo, Photoshop).
3. Ajuste el rango dinámico de cada canal por reescalar los valores máximo y mínimo en la imagen a un conjunto de datos de 8 bits (0 a 255).
4. Restar el contenido de fósforo desde el mapa de nitrógeno (usando el"Capas" ventana) con el fin de generar un mapa cualitativo que muestra la distribución de la proteína.
5. Convertir los mapas del ácido nucleico (fósforo) y la proteína (nitrógeno), creado en el paso anterior en "color indexado" y crear una tabla de búsqueda de color amarillo en el espacio de color CMYK para el mapa que muestra la distribución de ácido nucleico y una tabla de búsqueda cian para mostrar el mapa no nucleoproteína. Los colores se eligen para generar el máximo contraste entre los dos mapas elementales.
6. Crear una nueva imagen e importar los mapas que muestran la distribución de fósforo y proteínas como las diferentes capas. Utilice el modo de transparencia "pantalla" con el fin de ver las dos capas superpuestas unas sobre otras.
7. Abra la imagen-cero pérdida adquirida en el paso 5.2. Esta imagen representa una imagen de la zona grabada que se ve una imagen TEM convencional como pero sólo contiene los electrones que han pasado a través de la muestra sin chocar con la muestra. Exportaciónesta imagen como una imagen TIFF.
8. Abra la imagen cero pérdida exportado en un editor de fotos y copiarlo en la capa superior de la imagen que muestra el mapa elemental. Alinear la imagen usando el modo de transparencia "pantalla".
9. Umbral Opcionalmente la imagen para bajar de cero a segmento de la señal que se origina en el miniSOG. Añadir la imagen resultante como una capa separada como se describe anteriormente.

Resultados

ESI

Comparando las imágenes ESI del núcleo (Figura 1) con las imágenes de TEM convencionales (por ejemplo, la Figura 7-1) revela un aumento dramático en las estructuras anatómicas que pueden ser fácilmente distinguido. Las crestas de la cromatina aparecen en amarillo y es muy fácil de identificar las chromocenters en células de ratón. Nucleolos se puede distinguir fácilmente de la cromatina por su estructura redon...

Discusión

ESI puede servir como una herramienta excelente para examinar diferentes estados de la cromatina y ribonucleoproteínas en el núcleo debido a que es capaz de asignar específicamente a las zonas que son ricos en fósforo. Es profundamente aumenta la cantidad de detalle que se puede obtener por un microscopio electrónico y no depende de los métodos de contraste no específicos. Una desventaja de ESI es que requiere secciones más delgadas que TEM convencional al mismo voltaje de aceleración. Esto se puede superar med...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208 carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	Life Technologies	16000-044
G418	Life Technologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan