Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Zusammenfassung

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Zusammenfassung

Die Grenzen der optischen Auflösung und der Herausforderung der Identifizierung von spezifischen Proteinpopulationen in der Transmissionselektronenmikroskopie wurden Hindernisse in der Zellbiologie. Viele Phänomene können durch in vitro-Analyse, ein vereinfachtes System erläutert und benötigen zusätzliche Strukturinformationen in situ, insbesondere im Bereich zwischen 1 nm und 0,1 & mgr; m, um vollständig zu verstehen. Hier Elektronen spektroskopische Bildgebung, eine Transmissions-Elektronenmikroskopie-Technik, die gleichzeitige Abbildung der Verteilung der Proteine ​​und Nukleinsäuren ermöglicht, und ein Ausdruck tag, miniSOG, kombiniert werden, um die Struktur und Organisation der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Foci studieren.

Einleitung

Trotz der erheblichen Fortschritte in der Lichtmikroskopie in den letzten Jahren ^1, Zellbiologen leiden immer noch unter einer Lücke in Auflösung. Dies begrenzt Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen in grundlegenden zellulären Prozesse, die eine koordinierte Zusammenspiel von makromolekularen Komplexen beinhalten (zB in Chromatin-Remodeling, DNA-Reparatur, die RNA-Transkription und DNA-Replikation). Obwohl Transmissions-Elektronenmikroskopen (TEM) s die erforderliche Auflösung, es schwierig war, diese Prozesse strukturell wegen der Unfähigkeit zu definieren, um bestimmte Proteine ​​zu markieren gleichzeitig in der Lage, die biochemische Zusammensetzung der visualisierten Strukturen zu bestimmen. In Abwesenheit von internen Membranen zur Unterscheidung der Kernstrukturen wurde der Kern eine besonders anspruchsvolle Aufgabe. Elektronenspektroskopie-Bildgebung (ESI) löst einige dieser Beschränkungen, indem sie den gleichzeitigen Nachweis und die Differenzierung von DNA, RNA und protein-basierten Kernstrukturen ^2-5.

Electron spektroskopischen Bildgebung:

Um elementaren Verteilungen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung im Elektronenmikroskop abzubilden, kann man ein Bildgebungsspektrometer, die Elektronen, die unelastisch durch Wechselwirkungen mit Innenschale Elektronen eines Elements in ^der Probe 6 wurde zerstreut wählt verwenden. Weil elementspezifischen Energiemengen als Folge der Ionisation von Atomen in der Probe verloren geht, können diese Elektronen getrennt und visualisiert unter Verwendung eines Spektrometers, das Elektronenmikroskop befestigt werden. Somit Analyse des Spektrums der Elektronen, die mit der Probe in Wechselwirkung getreten zeigt die qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung der ^Probe 7. Elektronen, die keine Energie verlieren, wenn die durch die Probe werden in der "Null-Verlust-Spitze" des Elektronen-Energieverlust gefundenSpektrum. Die Fülle dieser Elektronen zu der Masse, Dichte und Dicke der Probe bezogen ist und der Elektronen, die durch die Probe passieren, ohne mit der Probe oder Energie beim Durchgang durch die Probe zu verlieren besteht. Diese Information kann für die absolute Quantifizierung der Anzahl von Atomen eines bestimmten Elements in der vorliegenden ^Probe 8 ist.

Da biologische Proben bestehen hauptsächlich von Lichtelementen, die schlecht in den einfallenden Strahl der TEM lenken die Elektronen, Färbeverfahren unter Verwendung von Schwermetallsalzen werden müssen, um den Kontrast in der Probe zu erzeugen, aufgebracht werden. Die mangelnde Spezifität der meisten dieser Kontrastmittel und die Unfähigkeit, mehr als ein Fleck, wo Spezifität möglich visualisieren hat den Wert der herkömmlichen Elektronenmikroskopie bei der Untersuchung des Kerns beschränkt. ESI hat signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen TEM, insbesondere für die Untersuchung von Strukturen des Zellkerns.Es ist möglich, die phosphorreichen Natur der DNA- und RNA-enthaltenden makromolekularen Komplexen auszunutzen Nucleoprotein-Komplexe aus Protein-Komplexe zu unterscheiden und verschiedene Nucleoproteinkomplexen ihre Dichte von Nukleinsäuren zu lösen. Der verbleibende biologische Material kann auf der Grundlage seiner Fülle von Stickstoff abgebildet werden. Mapping nur diese beiden Elemente und Analyse von deren Verteilung und relative Häufigkeit innerhalb der verschiedenen anatomischen Strukturen bietet uns eine Vielzahl von Informationen über den Zellkern. Zum Beispiel ist es einfach, Chromatin und den Ribosomen in der Karte darstellt Phosphor Fluss identifizieren. Die interchromatin Raum Kernporenkomplexe und Kernkörper, andererseits leicht in der Stickstoffkartenbild detektiert werden.

Mini Singulett-Sauerstoff-Generator-System (miniSOG)

Während ESI stellt eine leistungsfähige Technik, um in situ Chromatinstruktur zu studieren, weil es,s Vorteil der charakteristischen Verhältnisse in elementare Zusammensetzung von Phosphor und Stickstoff, kann die Elementzusammensetzung in der Regel nicht verwendet werden, um zwischen den verschiedenen Populationen von Protein-Komplexen zu unterscheiden. Antikörper mit kleinen Goldpartikel im Nanometerbereich markiert wurden allgemein verwendet, um die Lage der einzelnen Moleküle abzubilden. Da die Goldpartikel in der Regel zu einem sekundären Antikörper gebunden ist, wird es in einem Umkreis von etwa 20 nm auf der durch den primären Antikörper nachgewiesen Epitop angezeigt. In Posteinbettungsproben können Antikörper nur die Epitope, die an der Oberfläche der Abschnitte freiliegen detektieren. Während es möglich ist, die Anwesenheit eines Antigens nachzuweisen und in Beziehung zu einer bestimmten anatomischen Struktur der Zelle, die Information, die erhalten wird, nicht vollständig ist, da die meisten der Epitope durch Harz verdeckt. Pre-Einbettungstechniken, die ähnliche Protokolle zu denen für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet verwenden, erlauben den Zugriff auf Antigene in ganzdie gesamte Tiefe der Probe, aber die Permeabilisierung Schritte, die erforderlich sind, damit der Antikörper an die Zelle eindringen erfordern typischerweise die Entfernung von Lipidmembranen und Komponenten, die nicht durch Aldehyde fixiert werden können, zu entfernen. Darüber hinaus ist die bevorzugte Aldehyd Fixiermittel für Ultra Konservierung, Glutaraldehyd, üblicherweise zerstört Epitopen und folglich wird Paraformaldehyd in der Regel erforderlich. Dies ist weniger effektiv bei der Protein-Protein-Vernetzung. Ein weiterer Nachteil von Antikörpern, die mit einer Gold-Nanoteilchen bezeichnet werden, ist, daß Gold ein sehr elektronendichtes Material, das einen starken Kontrast, die interessante strukturelle Details der Probe, die schwächeren Kontrast hat verschleiern kann erzeugt.

Die Entstehung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) als ein exprimiertes Protein-Tag hat die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Fragen in der Zellbiologie Antwort umgewandelt. Tagging ein Protein mit einem kleinen Leuchtstoff Domäne ermöglicht Abbildung von seiner Verteilung in vivo ohne Permeabilisierung Verfahren, die die Struktur verändern können. Um die elegante Prinzip der Verwendung von Protein-Tags, um die Proteinverteilungen Karte in einer Zelle Elektronenmikroskopie zu übersetzen, wurde ein System benötigt, das in der Lage ist, ein Signal in der Nähe der Struktur von Interesse produzieren und erzeugen Kontrast in der TEM ist. Polymerisierten Diaminobenzidin ist ein Flecken, die oft in der Histologie verwendet wird, um Antikörper nachzuweisen verbindlich. Diese Färbung wird üblicherweise unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP) an einen sekundären Antikörper konjugiert abgeschieden. Obwohl die Reaktion ein zuverlässiges Ergebnis ist HRP nicht in das Cytosol der Zellen ⁹ katalytisch aktiv. Die Reaktionsprodukte von HRP kann auch diffundieren weg von der Stelle der Erzeugung, so dass ihre Auflösung ist schlechter als der Nanogold-Verfahren ^10. Um diese Probleme zu umgehen, wurde der Flash / ReAsH ^System 11 entwickelt. Es besteht von rekombinanten Fusionsproteinen, die ein Tetracysteinmotiv Motiv besitzen. Dieses Motiv ermöglicht die Bindung vona biarsenic Fluorophor. Wenn sie erregt werden, wird das gebundene Flash oder ReAsH Lage, den hochreaktiven Singulett-Sauerstoffs und somit photoconvert Diaminobenzidin (DAB) in einem Polymer, das unmittelbar am Ort der markierten Proteine ​​Ausscheidungen zu erzeugen. Der DAB-Polymer kann mit Osmiumtetroxid, die Elektronendichte ist, und kann somit verwendet werden, um die Verteilung des rekombinanten Fusionsproteins in der TEM abzubilden gefärbt werden.

Im Jahr 2011 Shu et al. ¹⁰ präsentiert den miniSOG System, das aus einem kleinen 106 Aminosäuren Fusion-Tag aus einem Flavoprotein von Arabidopsis, die Leuchtstoff und in der Lage, viele Singulett-Sauerstoff-Radikale, wenn sie mit 448 nm blaues Licht angeregt zu erstellen ist abgeleitet aus. Jene Singulettsauerstoff Reste können photo oxidize Diaminobenzidin verwendet werden, um Polymere an und nahe der Oberfläche der markierte Protein, das wesentlich näher als Immunogold markierten Antikörpern ¹¹ bilden. Während der Blitz / ReAsH System erfordert womit sich die FluorChrom und das Diaminobenzidin in die Zellen, bevor Sie die Photokonversion, die miniSOG System benötigt nur Diaminobenzidin und leicht und außerdem ist etwa so effektiv zweimal bei Polymerisation von Diaminobenzidin. Hier wird miniSOG in Kombination mit ESI, um die Ultrastruktur von DNA-Reparatur-Foci Karte eingesetzt.

DNA-Reparatur-Foci (DRF)

Nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüche stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Zelle, da sie für die Umsiedlung und den Verlust der genetischen Information zu führen. Wiederum kann dies Seneszenz, Krebs und Zelltod führen. Viele Proteine, die an DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur beteiligt sind, sammeln sich Schwerpunkte, die um einen DNA-Doppelstrang zusammenzubauen brechen ^12-14. Obwohl ihre Funktion nicht bekannt ist, stellen sie die Website in den Zellkern, die die DNA-Doppelstrangbruch enthält, und ist der Ort von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur.

DNA-Reparatur foci (DRF) wurden durch Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert worden, und sie als Biomarker für DNA-Schäden ^12,15 dienen. Sie sind massiv in Bezug auf die Größe des Doppelstrangbruch und wurden als relativ homogen bis in die jüngste superauflösende Mikroskopie Studien zeigten einige Anzeichen von Unter Abschottung der Moleküle innerhalb jedes konzentrieren ^16. Um zu verstehen, wie diese Seiten organisiert sind, ist es notwendig, alle der zugrunde liegenden biologischen Strukturen relativ zueinander zu visualisieren. Dies kann nicht durch Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht werden, ist jedoch durch Elektronenmikroskopie ^17,18 möglich. Hier wird ein Verfahren beschrieben, das Elektronen-spektroskopischen Bildgebung kombiniert mit der miniSOG Methode, um das Potenzial dieses kombinierten Ansatzes zu illustrieren, um die Ultrastruktur von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur zu erkunden.

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Protokoll

1. Erzeugung von miniSOG Zelllinien

1. Wachsen U2OS (menschliche Osteosarkom-Zellen) in einer 35 mm-Schale, enthaltend 2 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit _5% CO 2 ergänzt wird, Atmosphäre.
2. Transfektion der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz durch Lipofektion mit gereinigtem Transfektion Qualität (A269 / 280-Verhältnis 1,8-2,0) Plasmid-Konstrukte, welche die Sequenzen für miniSOG und mCherry tagged Reparaturproteine ​​gemß dem Protokoll des Herstellers des Transfektionsreagenz ^19. Die miniSOG Expressionsplasmide können vom Tsien-Lab bestellt werden: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. Sortieren der Zellen, die das rekombinante Protein mit der miniSOG und mCherry tag exprimiert durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zwei Tage nach der Transfektion. Sammeln Zellenmit Zwischenfluoreszenzintensität, um die Zellen, die überexprimiert werden ²⁰ zu vermeiden.
4. Kultur die positiven Zellen auf einer 10 cm-Schale in 10 ml DMEM-Medium, das mit 10% FBS und 0,6 ug / ml des Selektionsmittel G418 (Geneticin) ergänzt wird.
5. Nach sichtbare Kolonien auf den Platten entstanden, Bildschirm mCherry positiven Kolonien mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop und ziehen Kreise um sie herum (auf der Unterseite der Platte) mit einem Permanentmarker. Verwenden Sie ein geringer Vergrößerung Luft Objektiv (zB 10-fach) und Pick-Klonen unter Verwendung einer sterilen Technik durch vorsichtiges Kratzen die Kolonien aus und langsam saugen sie in eine sterile 1,000 ul Pipettenspitze.
6. Erweitern Sie die ausgewählten Kolonien und frieren Teile davon nach unten unter Verwendung des in Schritt 1.1 mit 10% Dimethylsulfoxid ergänzt beschriebene Wachstumsmedium. Testen Sie die Zellen für die DRF-Bildung durch den Anbau von ihnen auf sterile 18 x 18 mm ² Deckgläsern und bei denen sie2 Gy von Strahlung. Die bestrahlten Zellen stabil exprimiert eine miniSOG mCherry getaggt Reparaturprotein muss die typische Brennmuster charakteristisch DSBs, wenn sie mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von zum Abbilden mCherry ein Filter-Set sichtbar zu zeigen.

2. Zellkultur

1. Kultur U2OS-Zellen, die die miniSOG und mCherry tagged Reparaturproteine ​​unter den in Stufe 1.1 angegebenen Bedingungen. Wachsen Zellen auf 80% Konfluenz in einer 35 mm Durchmesser Glasbodenschale mit 2 ml DMEM. Stellen Sie sicher, dass der Leim, der das Deckglas auf den Kunststoff und die verwendeten Kunststoffisst ist beständig gegen wässrigen und alkoholischen Lösungen und beständig gegen das verwendete Harz!
2. Vor der Durchführung des Experiments, umreißen eine kleine Fläche von etwa ¹ mm 2, die Zellen, die die ektopische Proteine ​​durch Kratzen mit einem sterilen Diamantfeder mit einem Fluoreszenzmikroskop, um den Bereich von Interesse zu identifizieren enthält. Alternativ verwenden Sie eine Bodenschale Glas tKappe enthält eine Deckglas mit einer vorgeätzten Gittersystem in das Deckglas aufgebaut.
   HINWEIS: Bei Verwendung von hochwertigen korrelative Mikroskopie kombiniert ESI und fluoreszenzmikroskopische Bilder ^21, stellen Sie sicher, dass die Dicke des Deckglases mit Ölimmersionsobjektiven kompatibel ist. Es sollte die Dicke No. 1,5 (0,16 bis 0,18 mm). Wählen Sie einen Bereich in der Nähe der Mitte der Schale für die Region im TEM, um untersucht, um Probleme mit der Polymerisation des Harzes, das in der Nähe der Kanten auftreten können, zu vermeiden (siehe Punkt 4,10-4,13).

3. DNA Damage Induction

1. Bestrahlen der Zellen mit Gamma-Strahlung, mit einem radiomime Arzneimittel oder induzieren die Schäden, die durch die Lasermikro Bestrahlung auf einem konfokalen Mikroskop (zB wie in ^18,22 bzw. ²³ beschrieben).
2. In diesem Beispiel Bestrahlung der Zellen mit 2 und 6 Gy Gammastrahlung in einer Cäsium-137-Strahlungsquelle oder Laser microirradiate wird bei 405 nm solid Laser aus einem konfokalen Mikroskop nach Sensibilisierung der Zellen für 20 min mit 0,5 & mgr; g / ml Hoechst.

4. Probenvorbereitung

1. Befestigen Sie die Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M VORSICHT Natriumcacodylatpuffer oder in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, für 30 min bei RT im Dunkeln.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd und Natriumcacodylat sind giftig! Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend.
2. Mit 4 ml 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer, pH 7,4 oder Phosphatpuffer, pH 7,4, die Zellen werden zweimal.
3. Behandeln Sie die fixierten Zellen mit 2 ml 50 mM Glycin, 5 mM Aminotriazol und 10 mM Kaliumcyanid VORSICHT in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer oder 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) (überprüfen Sie den pH-Wert!) Für 30 Minuten, um zu blockieren nicht umgesetzte Aldehyd-Gruppen und die vom Häm-Gruppen erzeugt reaktive Sauerstoffspezies zu unterdrücken, die den Hintergrund erhöhen können.
   ACHTUNG: Kaliumcyanid ist extrem giftig! WOhr Handschuhe, arbeiten unter einer Haube und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend. Die Reaktion ist sehr empfindlich gegenüber pH so ist es wichtig, dass der pH-Wert überprüft und genau.
4. Nehmen Sie den Bereich, der in Schritt 2.2 in 2D oder 3D auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ausgewählt wurde, wenn die korrelative Mikroskopie gewünscht wird.
5. Bereiten Sie eine 1 mg / ml Diaminobenzidin-Hydrochlorid VORSICHT Lösung, indem ein 10 mg Diaminobenzidin Hydrochlorid-Tabletten in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Add 980 ul destilliertem H _{2 O} und 20 & mgr; l konzentrierte Salzsäure (11,65 M) zugegeben und gemischt, bis die Lösung hellbraun und transparent. Verdünnen dieser Lösung in 0,1 M Phosphat oder 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml, während der pH mit Natriumhydroxid auf einen pH-Wert zwischen 7,0 und 7,6 (pH-Wert 7,4 wird empfohlen).
   ACHTUNG: Diaminobenzidin ist giftig! Tragen Sie Handschuhe und entsorgen Sie die giftigen Substanzen ausreichend.
6. Für Photooxidation, replace der Puffer mit 2 ml einer 1 mg / ml Diaminobenzidin Hydrochlorid-Lösung in 0,1 M Natriumkakodylat oder Phosphatpuffer. Schützen Sie diese Lösung vor Licht und abkühlen lassen auf Eis bis 4 ^{° C,} um die Löslichkeit von Sauerstoff zu erhöhen. Sättigt die Lösung mit Sauerstoff durch Einblasen von Sauerstoff durch die Lösung (mit einem Schlauch, der in die Lösung eingelegt und mit einer Sauerstoffflasche angeschlossen). Überprüfen Sie den pH-Wert wieder, gegebenenfalls einstellen.
   Hinweis: Es ist wichtig für die Photooxidationsreaktion, dass der pH zwischen pH 7,0 und pH 7,6.
7. Montieren Sie den Teller mit den fixierten Zellen vorsichtig auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einem 40x Ölimmersionsobjektiv Objektiv ausgestattet und verschieben Sie sie in den Bereich von Interesse. Erregen die miniSOG Tag mit blauem Licht durch die Verwendung von Filterwürfel für GFP oder GFP. MiniSOG weist ein Anregungsmaximum bei 448 nm mit einer Schulter bei 473 nm ^10.
8. Fahren Sie mit der Beleuchtung auch nach der grünen Fluoreszenz miniSOG haist völlig verschwunden, und bis die braune Photooxidationsprodukt des polymerisiert Diaminobenzidin tritt in dem übertragenen Lichtkanal. Wenn das Oxidationsprodukt ist in den meisten der Zellen sichtbar ist, schalten Sie die Fluoreszenzbeleuchtung, um die Photooxidation zu stoppen.
   HINWEIS: Die Photooxidation kann bis zu mehreren Minuten, abhängig von der Objektivlinse, Filter Übertragungswellenlängen und die Effizienz und der Beleuchtungsquelle zu nehmen.
9. Postfix die Zellen mit 1 ml von 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4 oder Phosphatpuffer pH 7.4 für 30 min.
10. Fixierung der Membranen der Zellen mit 0,1% -0,5% Osmiumtetroxid 20 min in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer, pH 7,4 oder in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine möglichst geringe Konzentration von Osmiumtetroxid erforderlich, um die Membranen zu stabilisieren, zu verwenden. Da die polymerisierten DAB Ausscheidungen haben eine hohe Dichte von Stickstoff, die durch ESI, einer starken direkt nachgewiesen werden kannOsmium Färbung ist nicht notwendig, die miniSOG-markierte Protein zu identifizieren und möglicherweise schädlich für die ESI sein. Osmiumtetroxid ist sehr giftig! Arbeiten Sie in einem Abzug und entsorgen Sie die giftigen Abfälle angemessen.
11. Dehydratisieren, die Zellen durch eine Ethanolreihe unter Verwendung von 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% Ethanol Schritten (jeweils 5 min). Anschließend Inkubation der Zellen in einem 1: 1-Mischung aus 100% Ethanol und Acrylharz (LR weiß) und die Schüssel auf einem Schüttler für 4 Stunden, um die Infiltration in die Zellen vor der Inkubation der Zellen für mindestens einen weiteren 4 h in 100 zu erleichtern % Acrylharz (LR weiß).
12. Um das Harz zu polymerisieren, schneiden Sie den Deckel eines markierten 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rasierklinge und Mantel die Felge mit Acrylharz-Beschleuniger. Sicherzustellen, dass der Beschleuniger nur den Rand und nicht in das Rohr fließen. Anschließend vorsichtig den Schlauch zu füllen etwa zwei Drittel mit LR Weiß Harz mit einer Pasteurpipette. Darauf achten, dass das Harz nicht in Kontakt zu bekommen with der Beschleuniger auf den Rand!
13. Entfernen Sie das Harz, das die Zellen in der Schale unterwandert und die Schale auf den Kopf auf die aufrecht stehenden Mikrozentrifugenröhrchen, so dass die Breite des Rohres nahezu vollständig füllt das Glas abgedeckt Beobachtungsfenster der Schale.
14. Warten 1-2 min für das Gaspedal, um das Rohr und das Deckglas zu versiegeln, wird das Röhrchen, so dass das Harz in dem Röhrchen umfasst nun die Zellen.
15. Die Schale mit dem Rohr in einem Ofen bei 60 ° C und heilen 12 Stunden.
16. Wenn der Block ausgehärtet ist, entfernen Sie die Schale mit dem beigefügten harzgefüllten Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Ofen und trennen die Mikrozentrifugenröhrchen aus der Schale. Erleichtern die Trennung durch Auftauen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff und heißem Wasser.
17. Entsorgen Sie die Bodenschale Glas und schneiden Sie vorsichtig öffnen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rasierklinge, um den Block zu entfernen.
18. Beschriften Sie den Block mit einem Permanentmarker.
19. Verwenden einer Rasierklinge bis dreim die Block, so dass nur das ¹ mm 2 Region, die zuvor mit dem Diamant oder Wolfram Stift markiert Bereich enthält (oder enthält die Fläche mit den Zellen von Interesse) bleibt.
20. Montieren Sie den Block in einem Ultramikrotom, schneiden Sie den Block mit einem Schneidmesser und Schnittultradünnschnitten von ca. 50 nm mit einem Diamantmesser.
21. Pick-up die Abschnitte über die High-Getriebe 300 Maschengitter. Diese Gitter haben sehr kleine Gitterstäbe und decken damit weniger Zellen im Bereich von Interesse.
22. Beschichten der Abschnitte über die Netze mit etwa 0,2-0,4 nm aus Kohlenstoff mit einer Kohlenstoffbeschichtung auf die Stabilisierung sie unter dem Elektronenstrahl des TEM.

5. Elektronenmikroskopie

1. Laden Sie die Gitter in eine TEM, die mit einem Energiefilter ausgestattet ist. Nach Einstellen des Mikroskops und der Energiefilter nach den Anweisungen des Herstellers, kontrollieren die Zellen an den Abschnitten in geringen Vergrößerungsmodus (Normalübertragung) und vergleichensie Daten Fluoreszenz, wenn entsprechende (im Schritt 4.4) erhaltenen.
2. Einmal im Zellkern mit interessanten Features (DNA-Schaden verfolgen oder DNA-Reparatur-Foci) gefunden wird, wechseln Sie zu dem Energiefilterung-Modus und nehmen eine Dicke Karte.
   Hinweis: Dieses Verfahren beinhaltet die Eintragung einer Null-Verlust und ein ungefiltertes Bild. Dicken bis zu 0,3 mittlere freie Weglänge (30% der Elektronen des einfallenden Strahls wird von der Probe gestreut) sind dünn genug, um gute Elementar Karten zu erzeugen.
3. Rekordquote Karten der Elemente Phosphor und Stickstoff mit der Software, die die Energiefilter des Mikroskops verwendet, steuert. Notieren Sie die Phosphor-Karte Postkantenbilder bei 175 eV Energieverlust mit einer Schlitzbreite von 20 eV und Pre-Kantenbilder bei 120 eV Energieverlust, auch mit einer Schlitzbreite von 20 eV. Für die Stickstoff Karten, Rekord Beitrag Kantenbilder bei 447 eV mit einer Schlitzbreite von 35 eV und Pre-Kantenbilder bei 358 eV, auch mit einer Schlitzbreite von 35 eV.
   Hinweis: Da der Inhalt der abgebildeten Elemente (phosphOrus und Stickstoff) ist relativ niedrig (ca. 1%), wählen Sie "Ratio-Bild" (qualitative Elementar Karte) über die "3-Fenster-Methode" (quantitativ zu elementarem Karte), um Bilder mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen.

6. Bildverarbeitung

1. Öffnen Sie die Elementverhältnis Karten in einer Bildverarbeitungssoftware, die das Dateiformat der erworbenen Bilder (zB Digital Micrograph) verarbeiten kann. Kopieren Sie die Stickstoff-Karte in den roten Kanal und dem Phosphor-Karte in den grünen Kanal eines RGB-Bildes, so zu überlagern und die Karten auszurichten.
2. Exportieren Sie das zusammengesetzte Bild als Tagged Image File Format (TIFF) Datei. Öffnen Sie das Bild in einem Bildbearbeitungssoftware, die Schichten verwenden können (zB Photoshop).
3. Die Dynamikbereich jedes Kanals durch Neuskalierung der minimalen und maximalen Werte in dem Bild, um eine 8-Bit-Datensatzes (0 bis 255).
4. Subtrahieren Sie die Phosphorgehalt aus dem Stickstoff Karte (mit demFenster "Layers"), um eine Karte oder die die Verteilung von Protein zeigt generieren.
5. Konvertieren Sie die Karten der Nukleinsäure (Phosphor) und des Proteins (Stickstoff) im vorherigen Schritt in die "Indexfarben" erstellt und eine gelbe Lookup-Tabelle im CMYK-Farbraum für die Karte, die die Nukleinsäure Verteilung und eine Cyan-Lookup-Tabelle zu erstellen um die nicht-Nukleoprotein Karte anzuzeigen. Die Farben werden gewählt, um maximalen Kontrast zwischen den beiden elementaren Karten zu erzeugen.
6. Erstellen Sie ein neues Bild, und importieren Sie die Karten, die die Verteilungen von Phosphor und Protein als verschiedene Schichten. Verwenden Sie die "Bildschirm" Transparenz-Modus, um die beiden Schichten übereinander zu sehen.
7. Öffnen Sie die Zero-Loss-Bild in Schritt 5.2 erworben. Diese Abbildung stellt ein Bild des aufgezeichneten Bereichs, der wie eine herkömmliche Bild TEM sieht, enthält jedoch nur die Elektronen, die durch die Probe ohne Kollision mit der Probe durchlaufen haben. ExportDieses Bild als TIFF-Bild.
8. Öffnen Sie die exportierte Bildnullverlust in einem Foto-Editor und kopieren Sie sie in der obersten Schicht des Bildes, das die elementaren Karte. Richten Sie das Bild mit der "screen" Transparenz-Modus.
9. Optional Schwelle der Nullverlust Bild zu segmentieren das Signal, das von der miniSOG stammt. Als separate Schicht In das resultierende Bild, wie oben beschrieben.

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Ergebnisse

ESI

Vergleichen der ESI Bilder des Kerns (1) mit den üblichen TEM-Bilder (zB Bild 7-1) zeigt eine dramatische Zunahme der anatomischen Strukturen, die leicht unterschieden werden können. Die Chromatin Rücken erscheinen gelb und es ist ganz einfach, die Chromozentren in Mauszellen zu identifizieren. Kernkörperchen leicht von Chromatin durch ihre runde Struktur und unterschiedliche Farbe unterschieden werden, da die vormontierte R...

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Diskussion

ESI kann als ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Prüfung verschiedener Zustände des Chromatins und Ribonukleoproteine ​​im Kern, weil es in der Lage, speziell map Bereiche, die reich an Phosphor sind, ist zu dienen. Erhöht es grundlegend die Menge an Details, die mittels eines Elektronenmikroskops erhalten werden kann, und ist nicht abhängig von unspezifischen Kontrastverfahren. Ein Nachteil ist, dass es ESI dünneren Abschnitten als herkömmliche TEM gleichzeitig Beschleunigungsspannung erfordert. Dies kann d...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208 carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	Life Technologies	16000-044
G418	Life Technologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan