הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

הגבולות לרזולוציה אופטית והאתגר של זיהוי אוכלוסיות חלבון ספציפיות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים היו מכשולים בביולוגיה של תא. לא ניתן להסביר תופעות רבות על ידי ניתוח במבחנה במערכות פשוטות וזקוקים למידע מבני נוסף באתר, במיוחד בטווח שבין 1 ננומטר ו 0.1 מיקרומטר, כדי להבין באופן מלא. כאן, הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון, טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים שמאפשרת מיפוי בו זמנית של ההפצה של חלבונים וחומצות גרעין, ותג ביטוי, miniSOG, משולבת כדי לחקור את המבנה וארגון של מוקדי תיקון הפסקה כפולים גדיל DNA.

Introduction

למרות ההתקדמות המשמעותית במיקרוסקופ אור בשנים האחרונות ^1, תא-ביולוגים עדיין סובלים מפער ברזולוציה. זה מגביל את ההבנה של מערכות היחסים מבנה-תפקוד בתהליכים תאיים בסיסיים שכוללים את יחסי גומלין בין מתואמים מתחמי macromolecular (למשל, בשיפוץ הכרומטין, תיקון DNA, שעתוק RNA ושכפול ה- DNA). למרות שמיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) זה לספק את הרזולוציה הנדרשת, זה כבר מאתגר להגדיר תהליכים מבני בגלל חוסר היכולת אלה לתייג חלבונים ספציפיים בעת גם להיות מסוגל לקבוע את ההרכב הביוכימי של המבנים דמיינו. בהעדר הקרום הפנימי כדי לעזור להבדיל מבנים גרעיניים, הגרעין היה מאתגר במיוחד. הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים (ESI) פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי המאפשרים זיהוי ובידול בו זמניים של DNA, RNA, וprotעין מבוססת מבנים גרעיניים ^2-5.

הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים:

כדי למפות הפצות יסודות ברגישות גבוהה ורזולוציה במיקרוסקופ האלקטרונים, אחד יכול להשתמש בספקטרומטר הדמיה שבוחר אלקטרונים שכבר פזורים inelastically דרך אינטראקציות עם אלקטרונים מעטפת פנימיים של אלמנט בדגימה ^6. בגלל כמויות אלמנט ספציפי של אנרגיה הולכות לאיבוד כתוצאה מיינון של האטומים בדגימה, ניתן להפריד אלקטרונים אלה ומדמיינים באמצעות ספקטרומטר המחובר למיקרוסקופ האלקטרונים. לפיכך, ניתוח של הספקטרום של האלקטרונים שתקשרו עם הדגימה חושף מידע איכותי וכמותי על הרכב היסודות של המדגם ^7. אלקטרונים שלא לאבד אנרגיה כאשר עוברים דרך הדגימה נמצאים ב" שיא אפס האובדן "של אובדן אנרגיית האלקטרוןספקטרום. השפע של אלקטרונים אלה קשור למסה, הצפיפות והעובי של הדגימה ומורכבת מאלקטרונים שעוברים דרך הדגימה ללא התנגשות עם הדגימה או לאבד אנרגיה במהלך מעבר בדגימה. מידע זה יכול להיות שימושי לכימות מוחלט של המספרים של אטומים של יסוד מסוים בהווה הדגימה ^8.

מאז דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר של אלמנטי אור שגרוע להסיט את האלקטרונים באלומת האירוע של TEM, שיטות צביעה באמצעות מתכת כבדה מלחים צריכים להיות מיושמים על מנת ליצור ניגוד במדגם. חוסר הספציפי של רוב הסוכנים המנוגדים הללו וחוסר היכולת לחזות כתם אחד או יותר שבו סגוליות הוא אפשרי הגביל את הערך של מיקרוסקופ אלקטרונים הקונבנציונלי במחקר של הגרעין. יש ESI יתרונות משמעותיים על פני TEM הקונבנציונלי, במיוחד לחקר מבנים של גרעין התא.אפשר לנצל את טבע זרחן העשיר של דנ"א ומתחמי macromolecular המכיל RNA להבחין מתחמי nucleoprotein מקומפלקסי חלבונים ולפתור מתחמי nucleoprotein שונים המבוססים על צפיפותם של חומצות גרעין. ניתן הדמיה החומר ביולוגי שנותר מבוסס על השפע של חנקן. מיפוי רק שני אלמנטים אלה וניתוח של ההפצה שלהם ושפע יחסי בתוך מבנים אנטומיים שונים מספק לנו הרבה מידע על הגרעין. לדוגמא, קל לזהות הכרומטין והריבוזומים במפה מייצגים שפע זרחן. חלל interchromatin, מתחמים נקבוביות גרעיניים, וגופים גרעיניים, לעומת זאת, ניתן לאתר בקלות בתמונה מפת החנקן.

מערכת מחולל חמצן גופיית מיני (miniSOG)

בעוד ESI מייצג טכניקה חזקה ללמוד במבנה הכרומטין אתר כי זה ייקחיתרון של של היחסים האופייניים ברכב יסודות בין זרחן וחנקן, הרכב היסודות לא יכול בדרך כלל לשמש להפלות בין אוכלוסיות השונות של קומפלקסי חלבונים. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב קטנים בטווח ננומטר היו בשימוש נרחב כדי למפות את המיקום של מולקולות בודדות. מאז חלקיקי הזהב הוא בדרך כלל מצורף לנוגדנים משני, היא תופיע בהיקף של כ 20 ננומטר סביב epitope זוהה על ידי הנוגדן הראשוני. בדגימות שלאחר ההטבעה, נוגדנים יכולים רק לזהות את אפיטופים שנחשפים על פני השטח של החלקים. למרות שניתן להוכיח את קיומו של אנטיגן ומתייחס זה למבנה האנטומי מסוים של התא, המידע שמתקבל אינם שלם, שכן רוב epitopes הם מוסתרים על ידי שרף. טרום הטבעת טכניקות, המשתמשות בפרוטוקולים דומים לאלה המשמשים למיקרוסקופ פלואורסצנטי, לאפשר גישה לאנטיגנים בכלכל העומק של המדגם אבל צעדי permeabilization הנדרשים על מנת לאפשר את הנוגדן לחדור לתא בדרך כלל דורש הסרת קרומי שומנים ולהסיר רכיבים שלא ניתן לתקן על ידי אלדהידים. יתר על כן, מקבע אלדהיד העדיף לשימור ultrastructure, glutaraldehyde, בדרך כלל הורס epitopes וכתוצאה מכך, נדרש בדרך כלל paraformaldehyde. זה פחות יעיל בcrosslinking חלבונים. חסרון נוסף של נוגדנים שכותרתו עם ננו-חלקיקי זהב הוא שזהב הוא חומר אלקטרון-צפוף מאוד שיוצר ניגוד חזק שיכול לטשטש פרטים מבניים מעניינים של המדגם, שבה יש ניגוד חלש.

ההופעה של חלבון הניאון הירוק (GFP) כתג חלבון הביע הפכה את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לענות על שאלות בביולוגיה של תא. תיוג חלבון עם תחום ניאון קטן מאפשר מיפוי של ההפצה שלה בvivo ללא צורך בהליכי permeabilization שיכול לשנות את המבנה. כדי לתרגם את העיקרון האלגנטי של שימוש בתגי חלבון למפות הפצות חלבון בתא למיקרוסקופי אלקטרונים, הייתה צורך במערכת שהיא מסוגלת לייצר קרובה אות למבנה של עניין וליצור ניגוד בTEM. diaminobenzidine polymerized הוא כתם המשמש לעתים קרובות בהיסטולוגיה כדי לזהות נוגדנים מחייבים. כתם זה הוא בדרך כלל שהופקד באמצעות peroxidase חזרת (HRP) מצומדת לנוגדנים משני. למרות התגובה מייצרת תוצאה אמינה, HRP הוא לא catalytically פעיל בcytosol של תאים ^9. תוצרי התגובה של HRP יכול גם לפזר מהאתר של ייצור, כך שהרזולוציה שלהם היא יותר גרועה מאשר בשיטת nanogold ^10. כדי לעקוף בעיות אלה, המערכת / ReAsH הבזק פותחה ^11. הוא מורכב מחלבוני היתוך רקומביננטי שיש מוטיב tetracysteine. מוטיב זה מאפשר קשירה שלfluorophore biarsenic. כאשר נרגש, פלאש הכבול או ReAsH הוא מסוגל לייצר חמצן תגובתי הגופייה וdiaminobenzidine כך photoconvert (DAB) לפולימר שמשקע באופן מיידי באתר של החלבונים המתויגים. פולימר DAB יכול להיות מוכתם עם tetroxide אוסמיום, אשר הוא אלקטרון צפוף ובכך יכול לשמש כדי למפות את ההפצה של חלבון היתוך רקומביננטי בTEM.

בשינה 2011, שו et al. ¹⁰ הציגו את מערכת miniSOG, אשר מורכבת תג היתוך חומצות אמינו קטן 106 נגזר מflavoprotein של ארבידופסיס שהוא ניאון ומסוגל ליצור רדיקלים רבים גופייה כאשר נרגשים עם אור כחול 448 ננומטר. אלה רדיקלים גופייה יכולים לשמש לdiaminobenzidine צילום חמצן כדי ליצור פולימרים ובסמכו לפני השטח של החלבון מתויג, שהוא במידה ניכרת קרוב יותר מנוגדנים שכותרת immunogold ^11. בעוד מערכת Flash / ReAsH דורשת להביא fluoroכרום וdiaminobenzidine לתוך התאים לפני שאני עושה photoconversion, מערכת miniSOG דורשת רק diaminobenzidine ואור ובנוסף היא פי שניים יעיל בpolymerizing diaminobenzidine. כאן, miniSOG מועסק בשילוב עם ESI כדי למפות את ultrastructure של מוקדי תיקון DNA.

מוקדי תיקון DNA (DRF)

הפסקות גדיל הדנ"א כפולות מתוקן מהוות איום רציני לתא שכן הם יכולים להוביל לטרנסלוקציות ואובדן של מידע גנטי. בתורו, זה יכול להוביל להזדקנות, סרטן, ומוות של תאים. חלבונים רבים שעוסקים בתיקון הפסקת גדיל הדנ"א כפול מצטברים במוקדים שסביב להרכיב גדיל הדנ"א כפול לשבור ^12-14. למרות שתפקידם אינו ידוע, הם מייצגים את האתר בגרעין המכיל את הפסקת גדיל הדנ"א הכפולה, והוא האתר של תיקון הפסקת גדיל הדנ"א כפול.

foc תיקון DNAאני (DRF) מתאפיינים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם משמשים כסמנים ביולוגיים לנזק לדנ"א ^12,15. הם מסיביים יחסית לגודל של הפסקת גדיל פעמיים ונחשבו הומוגנית יחסית עד מחקרי מיקרוסקופ ברזולוציה הסופר האחרונים חשפו כמה עדויות של תת-מידור של מולקולות בתוך כל להתמקד ^16. על מנת להבין כיצד אתרים אלו מאורגנים, יש צורך לדמיין את כל המבנים ביולוגיים הבסיסיים ביחס לזה. זה לא יכול להיות מושגת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אבל אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ^17,18. הנה, שיטה מתוארת המשלבת הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון עם שיטת miniSOG כדי להמחיש את הפוטנציאל של גישה משולבת זו כדי לחקור את ultrastructure של תיקון הפסקה כפול גדיל DNA.

Protocol

1. דור של תא-קווי miniSOG

1. לגדול U2OS (אוסטאוסרקומה האנושית) תאים בצלחת 35 מ"מ המכילה 2 מיליליטר של מדיום גלוקוז הנמוך השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) שהוא השלים עם סרום 10% שור עוברי (FBS) על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם 5% CO ₂ אווירה.
2. Transfect התאים כאשר הם 80% ומחוברות בlipofection עם איכות מטוהרת transfection (1.8-2.0 A269 / 280 יחס) בונה פלסמיד המכילה את הרצפים לminiSOG וmCherry מתויגת חלבוני תיקון על פי הפרוטוקול של היצרן של מגיב transfection ^19. ניתן להזמין מ- Lab Tsien פלסמידים ביטוי miniSOG: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. מיין תאים המבטאים את חלבון רקומביננטי עם תג miniSOG וmCherry על ידי תא מופעל הקרינה מיון לאחר transfection יומיים. איסוף תאיםעם עוצמת הקרינה ביניים על מנת למנוע תאים שביתר ^20.
4. תרבות התאים החיוביים על צלחת 10 סנטימטר 10 מיליליטר של מדיום DMEM שהוא השלים עם 10% FBS ו -0.6 מיקרוגרם / מיליליטר סוכן הבחירה G418 (Geneticin) של.
5. לאחר מושבות גלויות צמחו על הצלחות, מסך למושבות חיוביות mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולצייר עיגולים סביבם (על תחתית הצלחת) עם סמן קבע. השתמש בעדשה אובייקטיבית אוויר בהגדלה נמוך (למשל, 10x) ולבחור שיבוטים באמצעות טכניקה סטרילית על ידי מגרד בזהירות את המושבות ומלאט מוצץ אותם לקצה פיפטה 1,000 μl סטרילי.
6. הרחב את המושבות שנבחרו ולהקפיא חלקים של אותם באמצעות מדיום הגידול מתואר בשלב 1.1 בתוספת 10% sulphoxide דימתיל. בדוק את התאים להיווצרות DRF על ידי גידולם על 18 x 18 מ"מ ² תלושי כיסוי סטרילי וחושף אותם ל2 Gy של קרינה. התאים המוקרנים ביציבות להביע mCherry miniSOG מתויגים חלבון תיקון חייב להראות מאפיין דפוס המוקד הטיפוסי של DSBs כאשר דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן שנקבע להדמית mCherry.

תרבות 2. תא

1. תאי U2OS תרבות להביע ביציבות miniSOG וmCherry מתויג חלבוני תיקון בתנאים המפורטים בשלב 1.1. לגדל תאים לconfluency 80% בצלחת תחתית זכוכית קוטר 35 מ"מ המכילה 2 מיליליטר של DMEM. ודא שהדבק שמתחבר להחליק את המכסה לפלסטיק והפלסטיק המשמש הוא עמיד לתמיסות מימיות ואלכוהול ועמיד לשרף המשמש!
2. לפני ביצוע הניסוי, מתאר שטח קטן של כ 1 מ"מ ² המכיל תאים המבטאים את החלבונים מחוץ לרחם על ידי גירוד עם עט יהלומי סטרילי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזהות את האזור של עניין. לחלופין להשתמש t צלחת תחתית זכוכיתכובע מכיל coverslip עם מערכת רשת מראש חרוטה המובנה בcoverslip.
   הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ הגומל באיכות גבוהה המשלב ESI וקרינת תמונות מיקרוסקופיות ^21, לוודא כי העובי של coverslip תואם את יעדי טבילת שמן. זה צריך להיות בעובי מס '1.5 (.16-0.18 מ"מ). בחר אזור קרוב למרכז הצלחת לאזור להיבחן בTEM כדי להימנע מבעיות עם פילמור של השרף שעלול להתרחש ליד הקצוות (ראה נקודה 4.10-4.13).

אינדוקציה נזק 3. DNA

1. מכשיר את התאים עם קרינת גמא, להשתמש בסמי radiomimetic, או לגרום הנזק על ידי הקרנת מיקרו לייזר במיקרוסקופ confocal (למשל, כפי שתואר ^ב18,22 או ^23).
2. בדוגמא זו, מקרינים את התאים עם 2 ו -6 Gy של קרינת גמא בmicroirradiate צסיום -137 מקור קרינה או לייזר באמצעות סול 405 ננומטרלייזר מזהה מצב של מיקרוסקופ confocal לאחר רגישות התאים במשך 20 דקות עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר Hoechst.

הכנת 4. לדוגמא

1. תקן את התאים עם 1 מיליליטר של 4% זהירות paraformaldehyde במאגר cacodylate 0.1 M נתרן או בחיץ pH 0.1 M פוספט 7.4 למשך 30 דקות ב RT בחושך.
   זהירות: Paraformaldehyde וcacodylate נתרן הם רעילים! ללבוש כפפות ולהשליך חומרים רעילים במידה מספקת.
2. לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של pH 0.1 M נתרן חיץ cacodylate 7.4 או pH חיץ פוספט 7.4.
3. פנק את התאים הקבועים עם גליצין 2 מיליליטר של 50 מ"מ, 5 מ"מ aminotriazole וזהירות 10 מ"מ אשלגן ציאניד במאגר cacodylate 0.1 M נתרן או 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) (לבדוק את ה- pH!) למשך 30 דקות כדי לחסום unreacted קבוצות ואלדהיד לדכא מיני החמצן מגיבים נוצרו על ידי קבוצות heme, אשר יכול להגביר את הרקע.
   זהירות: ציאניד אשלגן הוא רעיל ביותר! Wכפפות אוזן, לעבוד מתחת למכסת מנוע ולהשליך חומרים רעילים במידה מספקת. התגובה היא מאוד רגישה ל- pH ולכן חשוב שpH אומת ומדויק.
4. רשום את האזור שנבחר בשלב 2.2 ב2D או 3D במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, אם מיקרוסקופיה הגומלת היא רצויה.
5. הכן 1 מ"ג / פתרון זהירות hydrochloride diaminobenzidine מיליליטר ידי הצבת לוח hydrochloride diaminobenzidine 10 מ"ג לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר. להוסיף 980 μl של מזוקק H ₂ O ו -20 μl של חומצה הידרוכלורית מרוכזת (11.65 מ ') ולערבב עד הפתרון הוא חום ואור שקוף. לדלל את הפתרון הזה ב 0.1 M פוספט או 0.1 חיץ cacodylate M נתרן לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר תוך התאמת pH עם נתרן הידרוקסידי לpH בין 7.0 ו -7.6 (pH 7.4 מומלץ).
   זהירות: diaminobenzidine הוא רעיל! ללבוש כפפות ולהשליך חומרים רעילים במידה מספקת.
6. לphotooxidation, replace החיץ עם 2 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון hydrochloride diaminobenzidine במאגר cacodylate 0.1 M נתרן או חיץ פוספט. הגן על פתרון זה מהאור ולקרר אותו על קרח עד 4 ^מעלות צלסיוס כדי להגדיל את המסיסות של חמצן. להרוות את הפתרון עם חמצן על ידי מבעבע חמצן דרך הפתרון (תשתמש בצינור שמוכנס לתוך הפתרון ומחובר לבקבוק חמצן). בדוק את ה- pH שוב ולהתאים במידת צורך.
   הערה: זה הוא חיוני לתגובת photooxidation שpH הוא בין pH 7.0 ו- pH 7.6.
7. הר הצלחת עם התאים הקבועים בזהירות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מצוידים בעדשה אובייקטיבית 40X טבילת שמן ולהעביר אותה לאזור של עניין. Excite תג miniSOG עם אור כחול באמצעות קוביות מסנן לGFP או CFP. יש MiniSOG מרבי עירור ב ננומטר 448 עם כתף ב473 ¹⁰ ננומטר.
8. המשך עם התאורה גם לאחר חה הקרינה miniSOG הירוקהזה נעלם לחלוטין ועד למוצר תמונה-חמצון החום של diaminobenzidine polymerized עולה בערוץ האור המועבר. כאשר מוצר החמצון גלוי ברוב התאים, לכבות את תאורת הקרינה לעצור את צילום החמצון.
   הערה: תמונה-חמצון יכול לקחת עד בהתאם לעדשה האובייקטיבית, אורכי גל שידור מסנן ויעילות, ומקור התאורה כמה דקות.
9. Postfix את התאים עם 1 מיליליטר של glutaraldehyde 2% בpH cacodylate 0.1 M נתרן 7.4 חיץ או pH חיץ פוספט 7.4 למשך 30 דקות.
10. תקן את הקרומים של התאים עם 0.1% -0.5% tetroxide אוסמיום עבור 20 דקות בחיץ pH cacodylate 0.1 M נתרן 7.4 או 0.1 M pH חיץ פוספט 7.4.
    הערה: מומלץ להשתמש בריכוז הנמוך ביותר האפשרי של tetroxide אוסמיום הנדרש כדי לייצב את הקרומים. מאז יש לי משקעים DAB polymerized צפיפות גבוהה של חנקן, אשר ניתן לאתרם ישירות על ידי ESI, חזקצביעת אוסמיום אין צורך לזהות את החלבון מתויג miniSOG ועשויה להזיק לESI. tetroxide אוסמיום הוא רעיל מאוד! לעבוד במנדף ולהשליך הפסולת הרעילה במידה מספקת.
11. מייבשים, התאים באמצעות סדרת אתנול באמצעות 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% אתנול צעדים (כל 5 דקות). בהמשך לכך, דגירה התאים ב1: 1 תערובת של 100% אתנול ושרף אקרילי (LR הלבן) ולשים את הצלחת על שייקר במשך 4 שעות כדי להקל על חדירה לתאים לפני דוגרים התאים לפחות עוד 4 שעות ב100 % שרף אקרילי (LR הלבן).
12. כדי פלמר השרף, לחתוך את המכסה של צינור microcentrifuge 2 מיליליטר שכותרתו עם סכין גילוח ומעיל השפה עם מאיץ שרף אקרילי. ודא שהמאיץ מכסה רק את השפה ואינו זורם לתוך הצינור. בהמשך לכך, בזהירות למלא את הצינור כשני שליש עם שרף LR הלבן בעזרת פיפטה פסטר. דואג שהשרף לא להיכנס שנינות קשרh המאיץ על השפה!
13. הסר את השרף שהסתנן לתאים בצלחת ומניח את הצלחת הפוכה על צינור microcentrifuge עומד הזקוף, כך שהרוחב של הצינור מתמלא כמעט לגמרי את חלון תצפית הזכוכית המכוסה של המנה.
14. חכה 1 עד 2 דקות למאיץ לאטום את הצינור וcoverslip, אז להפוך את הצינור כך שהשרף בצינור החברה מכסה את התאים.
15. מניחים את הצלחת עם הצינור לתוך תנור על 60 מעלות צלזיוס ולרפא אותה במשך שעה 12.
16. כאשר הבלוק הוא נרפא, להסיר את הצלחת עם צינור microcentrifuge מלא שרף המצורף מהתנור ולהפריד את צינור microcentrifuge מהצלחת. להקל הפרדה על ידי להקפיא להפשיר מחזורים בחנקן נוזלי ומים חמים.
17. מחק את צלחת תחתית הזכוכית ולחתוך בזהירות לפתוח את צינור microcentrifuge עם סכין גילוח כדי להסיר את החסימה.
18. תווית הבלוק עם סמן קבע.
19. השתמש בסכין גילוח לTRIמ 'הבלוק כך ששום דבר אבל באזור 1 מ"מ ² המכיל את האזור המסומן בעבר עם עט יהלומים או טונגסטן (או מכיל את האזור עם התאים של ריבית) נשאר.
20. הר לחסום בultramicrotome, לקצץ את הבלוק עם סכין חיתוך ולחתוך חלקים דקים של כ -50 ננומטר באמצעות סכין יהלום.
21. להרים את החלקים בשידור גבוה 300 רשתות רשת. יש רשתות אלה ברים רשת קטנים מאוד ובכך לכסות פחות תאים באזור של עניין.
22. מעיל הסעיפים ברשתות עם כ .2-.4 ננומטר של פחמן באמצעות coater פחמן כדי לעזור לייצב אותן מתחת לאלומת האלקטרונים של TEM.

5. מיקרוסקופית אלקטרונים

1. טען את הרשתות לTEM שמצויד במסנן אנרגיה. לאחר כוונון מיקרוסקופ ומסנן האנרגיה על פי הוראות היצרן, לבדוק את התאים בחלקים במצב ההגדלה הנמוך (שידור רגיל) ולהשוותשלהם לקרינת נתונים בעת הצורך (שהושג בשלב 4.4).
2. ברגע שגרעין עם תכונות מעניינות (מסלול נזק לדנ"א או מוקדי תיקון DNA) נמצא, מתג למצב סינון האנרגיה ולהקליט מפת עובי.
   הערה: הליך זה כולל את ההקלטה של ​​אפס אובדן ותמונה לא מסוננת. עוביים עד 0.3 מהלך חופשי ממוצעים (30% מהאלקטרונים של קורה האירוע מקבל מפוזרים על ידי המדגם) הם דקים מספיק כדי ליצור מפות יסודות טובות.
3. מפות רשומות יחס של זרחן וחנקן האלמנטים באמצעות התוכנה ששולטת במסנן האנרגיה של המיקרוסקופ משמש. רשום את התמונות לאחר קצה מפת זרחן ב175 אובדן אנרגיית eV עם רוחב חריץ של 20 תמונות eV ומראש קצה ב 120 אובדן אנרגיית eV, גם עם רוחב חריץ של 20 eV. למפות חנקן, תמונות פוסט קצה שיא ב447 eV עם רוחב חריץ של 35 תמונות eV ומראש קצה ב358 eV, גם עם רוחב חריץ של 35 eV.
   הערה: מאחר שהתוכן של אלמנטי הדמיה (phosphOrus וחנקן) הוא נמוך יחסית (כ. 1%), לבחור "תמונת יחס" (מפת יסודות איכותית) על "3 חלון השיטה" (לכמת מפת יסודות) כדי ליצור תמונות עם אות טובה יותר יחס רעש.

עיבוד תמונה 6.

1. פתח את מפות יחס הבסיסיות בתוכנת עיבוד תמונה שיכול לטפל בפורמט הקובץ של התמונות שנרכשו (לדוגמא, דיגיטלי מיקרוסקופ). העתק את מפת החנקן לתוך הערוץ האדום ומפת זרחן לערוץ הירוק של תמונת RGB, אז להרכיב ולהתאים את המפות.
2. לייצא את התמונה המורכבת כפורמט קובץ תמונה מתויג קובץ (TIFF). פתח את התמונה בתוכנת עיבוד תמונה שיכולה להשתמש בשכבות (למשל, Photoshop).
3. התאם את הטווח הדינמי של כל ערוץ על ידי rescaling ערכי המינימום ומקסימום בתמונה לסט נתונים 8 סיביות (0 עד 255).
4. הפחת את תוכן זרחן מהמפה החנקן (באמצעות"שכבות" חלון) כדי ליצור מפה איכותית שמציגה את ההתפלגות של חלבון.
5. המרת המפות של חומצות הגרעין (זרחן) וחלבון (החנקן) נוצרו בשלב הקודם ל" צבע צמוד "וליצור טבלת בדיקה צהובה במרחב צבעי CMYK למפה המציגה את התפלגות חומצות גרעין וטבלת חיפוש ציאן כדי להראות את המפה הלא-nucleoprotein. הצבעים נבחרו כדי ליצור ניגוד מרבי בין שתי המפות הבסיסיות.
6. ליצור תמונה חדשה ולייבא את המפות המציגות את החלוקה של זרחן וחלבון כשכבות שונות. השתמש במצב "המסך" השקיפות כדי לראות את שני השכבות על גבי זה.
7. פתח את תמונת אפס האובדן רכשה בשלב 5.2. תמונה זו מייצגת תמונה של האזור נרשם שנראה כמו תמונת TEM קונבנציונלית אלא רק מכילה אלקטרונים שעברו בדגימה ללא התנגשות עם הדגימה. יצואתמונה זו כתמונת TIFF.
8. פתח את תמונת אפס האובדן מיוצאת בעורך תמונה ולהעתיק אותו לשכבה העליונה של התמונה מראה את מפת היסודות. יישר את התמונה באמצעות המצב "מסך" שקיפות.
9. סף לחלופין תמונת אפס האובדן למגזר האות שמקורו בminiSOG. הוסף את התמונה וכתוצאה מכך כשכבת נפרדת כפי שתואר לעיל.

תוצאות

ESI

השוואת תמונות ESI של הגרעין (איור 1) עם תמונות TEM קונבנציונליות (לדוגמא, איור 7-1) כי חל גידול דרמטי במבנים אנטומיים שניתן להבחין בקלות. רכסי הכרומטין מופיעים בצהוב וזה די קל לזהות chromocenters בתאי עכבר. ב...

Discussion

ESI יכול לשמש ככלי מצוין לבחינת מצבים שונים של הכרומטין וribonucleoproteins בגרעין, כי הוא מסוגל למפות במיוחד אזורים עשירים בזרחן. זה עמוק מרחיב את כמות הפרטים שניתן להשיג על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים ואינה תלוי בשיטות מנוגדות ספציפיות. אחד חסרונות של ESI הוא שהיא דורשת חלקים רזי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208 carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	Life Technologies	16000-044
G418	Life Technologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan