تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية

Summary

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Abstract

قمنا بتطوير منصة الفحص لتحديد مخصصة تحركات البروتينات البشرية للركائز فسفرته والتي يمكن استخدامها لتوضيح رواية مسارات نقل الإشارة. نهجنا ميزات استخدام مكتبة تنقية الموسومة GST تحركات البروتينات البشرية وركيزة البروتين المؤتلف من الاهتمام. وقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لتحديد MAP / أنيبيب التنظيم تقارب كيناز 2 (MARK2) كما كيناز لموقع التنظيم الجلوكوز على الخاضعة للرقابة CREB الترانسكربتي Coactivator 2 (CRTC2)، وهو بروتين اللازم لتكاثر الخلايا بيتا، وكذلك الأسرة AXL التيروزين كيناز كما المنظمين من ورم خبيث الخلية عن طريق الفسفرة من البروتين محول ELMO. وصفنا هذه التكنولوجيا ومناقشة كيف يمكن أن يساعد على وضع خريطة شاملة لكيفية استجابة الخلايا للمؤثرات البيئية.

Introduction

البروتين التعديلات بعد متعدية (PTMs) ضرورية للتواصل بين الخلايا. ولعل أفضل درس لجميع PTMs هو الفسفرة، يحفزه تحركات البروتينات، التي تنظم عدد لا يحصى من وظائف البروتين، بما في ذلك نشاطهم الكيمياء الحيوية، وتوطين التحت خلوية، التشكل، والاستقرار. تحديد المواقع الفسفرة على البروتينات الهدف يمكن تحقيقه عن طريق التعيين phosphopeptide زيتية أو عن طريق تقنيات البروتين الآن القياسية باستخدام عينات المخصب لالببتيدات فسفرته ^1،2. في حين من المتوقع أن يتم فسفرته ³ ثلاثة أرباع بروتيوم أعرب وحددت 200،000 مواقع الفسفرة ^5، مع تقديرات تصل إلى 1000000 ^6، وكثير من هؤلاء ليس لهم علم الأحياء المخصصة، مما يشير إلى مسار أو بروتين كيناز.

في حين تحديد المواقع فسفرته واضح ومباشر نسبيا، تحديا أكبر نسبيا هوتحديد كيناز وما شابه ذلك (ق) التي تستهدف هذه المواقع، وهي عملية نطلق عليه رسم الخرائط كيناز: أزواج الركيزة. عدة طرق لتحديد كيناز: وقد وصفت أزواج الركيزة، إما بدءا من كيناز من الفائدة وتبحث عن ركائز، أو بدءا ركيزة من الاهتمام ومحاولة لإيجاد كيناز المعدلة تجريبيا ^11/07 أو حسابيا ^12. لتحديد تحركات لالركيزة فسفرته معروف، المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تحتوي على تسلسل الحفظ قصيرة من الأحماض الأمينية المرافقة بقايا فسفرته (موقع الإجماع)، فضلا عن تحديد تحركات التي تشكل مجمع precipitable مع الركيزة. ومع ذلك، هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، وغالبا ما لا تفي بالنجاح.

قمنا بتطوير نهج وظيفي منتظم لتحديد بسرعة تحركات التي يمكن أن الفوسفات ركيزة معينة ^(13). فحص الشاشة تنتج تحديدا ممتازإيتي، مع اختيار واضحة جدا لتحركات المشابهة المحتملة. ونظرا لمركزية الفسفرة إلى الإشارات البيولوجية، والشاشة هي مفيدة لاكتشاف خلية تقريبا في جميع مسارات إشارات ^14-16. ينطوي على الشاشة إجراء فحص كيناز على نطاق واسع مع مكتبة من تحركات البروتينات البشرية. تم الموسومة تحركات مع الجلوتاثيون البكتيرية S-ترانسفيراز (GST) البروتين وتنقيته من مقتطفات خلايا الثدييات، وهو ما يعني أن الإنزيمات المؤتلف - على عكس تلك التي أعدت من البكتيريا - تتولد في وجود تحركات البروتينات المنبع في كثير من الأحيان اللازمة ل الانزيمات المؤتلف أن يكون النشاط في المختبر. في الواقع، في حين سيرين، ثريونين، والتيروزين النشاط كيناز اللازمة لتفعيل كيناز المصب الموجودة في الخميرة ^10، الجينوم الخميرة بترميز 122 تحركات البروتينات، مشيرا إلى أن kinome الثدييات، مع أكثر من 500 جين ^17، أصبحت أكبر بكثير من مجمع ل العاديهالشركة المصرية للاتصالات العمليات الفريدة للكائنات العليا. وعلاوة على ذلك، فإن تأثير المحفزات المختلفة ذات الصلة لبيولوجيا الخلية والأمراض التي تصيب البشر (مثل الجزيئات الصغيرة، عوامل النمو والهرمونات وغيرها) يمكن أن تستخدم ^ل14،15 تعدل النشاط كيناز في سياق مناسب.

Protocol

1. إعداد الكواشف، لوحات، والخلايا

1. جعل 500 مل العازلة تحلل: 25 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي ناف، 0.5 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 0.5٪ TritonX-100، 5 ملي بيتا سكرولي، 5٪ الجلسرين. تخزينها في 4 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 1 ملي dithiothreitol (DTT)، 1 ملم phenylmethyl السلفونيل الفلورايد (PMSF)، و 1 ملي فانادات الصوديوم. بعد هذه الخطوة، غير مطلوب PMSF في أي العازلة الشطف.
2. جعل 20 مل من 10X كيناز العازلة: 200 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 50 ملي بيتا سكرولي (FW 216)، 2 مم فانادات الصوديوم. قسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 5 ملي DTT.
3. جعل 20 مل من 10X M-ATP العازلة: 300 ميكرومتر ثالث فسفات الأدينوزين (ATP)، 66 ملي MgCl _2، 33 ملم MnCl _2. قسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C.
4. جعل 100 مل من 2X دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) تحلل العازلة: 1.5 غرام قاعدة تريس، 20 مل الجلسرين، 30 مل H ₂ O. حل وضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع حمض الهيدروكلوريك. إضافة 40مل 10٪ SDS، وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل. إضافة 25 ملغ الأزرق برموفينول.
5. بقعة 4 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر الثدييات التعبير البلازميد ترميز-GST كيناز ¹⁴ لكل بئر في مجموعات من 96 لوحات جيدة ولوحات التسمية وفقا لذلك. وختم تجميد لوحات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. 1-2 أيام قبل ترنسفكأيشن، وخلايا ثقافة HEK293T في كامل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية في 37 ° C حاضنة تستكمل مع CO ₂ (النهائية 5٪). مع مرور التربسين ولا تسمح الأوراق المالية لتصبح> 80٪ متموجة خلال التوسع. ويلزم ما لا يقل عن 6 × 10 ^{7 خلايا} للشاشة (حوالي 3 × 15 سم أطباق من الخلايا HEK293T في 80٪ التقاء).

2. ترنسفكأيشن

ملاحظة: انظر الشكل 1 للاطلاع على سير بروتوكول بأكمله.

1. إذا كان قد تم تجميدها لوحات تحتوي على البلازميدات كيناز، ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لالثانية الطرد المركزي في 1900 x ج لمدة 3 دقائق لجمع أي رطوبة في الجزء السفلي من الآبار.
2. خلط 8.6 مل من انخفاض متوسط ​​المصل (على سبيل المثال، OPTI-MEM) مع 312.7 ميكرولتر من الدهون على أساس كاشف ترنسفكأيشن. اتركيه لمدة 5 دقائق.
3. إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل إلى كل بئر باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير.
4. إضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من انخفاض متوسط ​​المصل / ترنسفكأيشن مزيج كاشف من الخطوة 2.2 باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير. اتركيه لمدة 20 إلى 45 دقيقة.
5. Resuspend الخلايا 293T على 7.5 × 10 ⁵ خلية / مل في 80 مل من DMEM. إضافة 100 ميكرولتر من التعليق الخلية (أي 7.5 × 10 ⁴ خلايا) لكل بئر باستخدام موزع السائل الآلي مزودة حجم الكاسيت القياسية.
6. تحقق من الآبار تحت المجهر لتوزيع الخلايا موحد والعودة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة.

المنسدلة 3. GST-كيناز

1. جعل وresh: 4 ملي حل pervanadate عن طريق خلط 60 ميكرولتر من 0.2 M فانادات الصوديوم مع 540 ميكرولتر من H ₂ O. في مزيج الأنبوب الثاني 2.7 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد و 1.4 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة الحلين معا، وترك الجلوس لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
2. باستخدام ماصة الأقنية (لا تستخدم موزع السائل الآلي لأنها تخلق الكثير من الاضطراب في البئر) الاستغناء 2 ميكرولتر من 0.25 M CaCl ₂ في كل بئر، تليها 2.5 ميكرولتر من pervanadate أعدت في الخطوة 3.1. احتضان كل لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم ضع على الجليد.
3. إعداد 35 مل من تحلل العازلة بإضافة DTT، PMSF، وفانادات الصوديوم كما هو مبين في القسم 1 (إعداد الكواشف).
4. حفظ وحات على الجليد، وإزالة المتوسطة من كل بئر باستخدام الشافطة فراغ. على الفور إضافة 50 ميكرولتر / بئر الجليد العازلة تحلل الباردة باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت القياسية. اتركيه مدة 30 دقيقة على الجليد لليز (اختياري: يمكن أن تتوقف هنا إذا لزم الأمر عن طريق ختم بلاته وتخزينها في -80 ° C. للمتابعة، لوحات ذوبان الجليد على الجليد).
5. لوحات تدور في 1900 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
6. تتخلص الخلايا من كل بئر باستخدام ماصة الأقنية ونقل جميع محتويات المسمى بشكل مناسب لوحات 96 بئر V-القاع. لوحات تدور في 1900 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
7. أثناء الدوران، وملء الجلوتاثيون المغلفة لوحات (واحد لكل لوحة 96-جيدا) مع 100 ميكرولتر / بئر الجليد العازلة تحلل الباردة (بدون PMSF) باعتباره شطف. الحفاظ على لوحات على الجليد.
8. إزالة لوحات V-السفلي من أجهزة الطرد المركزي. في وقت واحد، عكس لوحات الجلوتاثيون أكثر من بالوعة لنفض العازلة تحلل وصمة عار على منشفة ورقية. نقل العازلة تحلل من لوحات V-القاع إلى لوحات الجلوتاثيون عن طريق إمالة لوحة وباستخدام ماصة الأقنية، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه في الجزء السفلي. تغطية لوحات وترك على الجليد لمدة لا تقل 2 ساعة الربط.
9. على مقربة من نهاية الخطوة ملزم 2 ساعة، وإعداد محطة عمل النشاط الإشعاعي، وضمان رانه احتياطات السلامة الضرورية هي في مكان للعمل الإشعاعي. ضبط الفرن التهجين إلى 30 ° C.
10. إعداد 200 مل من تحلل العازلة بإضافة DTT والصوديوم فانادات كما هو مبين في القسم 1. PMSF ليس مطلوبا في هذه المرحلة.
11. عكس لوحات الجلوتاثيون أكثر من بالوعة لنفض العازلة تحلل وصمة عار على منشفة ورقية. شطف الآبار 3X مع 100 ميكرولتر العازلة تحلل (بدون PMSF). لا تدع الآبار الجلوس الجافة - الاحتفاظ بها في شطف حتى على استعداد للمضي قدما.
12. إعداد 55 مل من 1X العازلة كيناز (KB) من خلال تمييع الأسهم 10X وإضافة DTT كما هو مبين في القسم 1. لوحات شطف مرة واحدة مع 50 ميكرولتر من 1X KB باستخدام موزع السائل الآلي مزودة حجم الكاسيت القياسية. ترك 1X KB في الآبار حتى حل A جاهز:
    1. إعداد الحل A بإضافة 500-530 ميكروغرام من الركيزة المصالح، 500 ميكروغرام من البروتين الأساسي المايلين (ب ب)، 2.65 مل من 10X KB، 13.25 ميكرولتر من 1 M DTT، وH _{2 O} ما يصل الى 15.9 مل.
13. في وقت واحد، عكس لوحات أكثر من بالوعة لإزالة 1X KB شطف، وصمة عار على منشفة ورقية، وعلى الفور إضافة 30 ميكرولتر من محلول A باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير. الحفاظ على لوحات على الجليد.
14. إعداد الحل B في منطقة العمل الإشعاعي وذلك بإضافة 2.5 مل 10X M-ATP، 500 μCi أشعة غاما ³² P ATP، وH _{2 O} إلى 10 مل.
    1. إضافة 20 ميكرولتر من محلول B لكل بئر باستخدام ماصة مكرر الذي يساعد في خلط بسبب قوة الطرد. تغطية واحتضان في 30 ° C الفرن التهجين لمدة 30 دقيقة.
15. بعد 30 دقيقة، ونقل لوحات إلى جليد. إضافة 50 ميكرولتر من 2X SDS العازلة تحلل إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. يمكن المضي قدما في هذه المرحلة إلى الخطوة التالية، أو ختم لوحات مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مريحة.

4. الجري، تلطيخ، والمواد الهلامية التجفيف

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال في منطقة DESIGNAتيد لنشاط إشعاعي.

1. تشغيل الفرن التهجين وتعيين إلى 85 درجة مئوية. لوحات ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة وصلت درجة حرارة الفرن، لوحات نقل إلى الفرن واحتضان لمدة 10 دقيقة لتفسد العينات.
2. تحميل 26-كذلك المواد الهلامية مسبقة الصب مع 15 ميكرولتر من كل رد فعل باستخدام ماصة الأقنية لملء العديد من الآبار في وقت واحد. ويجب الحرص على أن جميع النصائح محاذاة مع المقابلة بشكل جيد قبل أن يضيف العينات. تشغيل هلام في 150 V. لا تدع تتبع صبغ (الخط الأزرق) تشغيل الخروج من الجزء السفلي من هلام لأن هذا يحتوي على ATP غير مدمج.
3. تفكيك المواد الهلامية وقطع ATP غير مدمج (الخط الأزرق) باستخدام مشرط أو حافة مستقيمة لأنها سوف إفرط في التعريض الأفلام. وضع المواد الهلامية في حاويات وصفت وتغطي مع Coomassie وصمة عار لمدة 15 دقيقة.
4. إزالة وصمة عار Coomassie، لفترة وجيزة شطف المواد الهلامية مع الماء، وإضافة يزيل اللون الحل. يزيل اللون المواد الهلامية حتى البروتينات هي واضحة للعيان. فرقة لMBP وفرقة لالركيزة ينبغييكون لكل عينة واضحة.
5. لتجفيف المواد الهلامية:
   1. قطع ورقة كبيرة من ورق الترشيح ووضعه على مجفف.
   2. الرطب ورقة السيلوفان في الماء المقطر حتى على نحو سلس وتجعد الحرة، ووضعه على رأس ورقة.
   3. وضع الجل على رأس ورقة السيلوفان، مما يجعل علما ترتيب المواد الهلامية. الرطب ورقة السيلوفان الثانية ووضع على رأس المواد الهلامية.
   4. طرح جميع فقاعات (لوحة ختم الأسطوانة يعمل بشكل جيد لهذا) لطيفة سطح موحدة. إغلاق رفرف، بدوره على فراغ، وتجفيف المواد الهلامية لمدة 3 ساعة على 80 درجة مئوية.
6. مرة واحدة الهلام جافة، يعرضهم لفيلم XAR باستخدام الشاشة لتكثيف الإشارة. التفاف كاسيت مع التفاف ساران أو كيس من البلاستيك وختم بشريط لمنع دخول الصقيع. تخزين الكاسيت في -80 درجة مئوية خلال الليل.

5. تطوير XAR أفلام

1. في اليوم التالي، وإزالة كاسيت من الثلاجة والسماح ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. تطوير الفيلم فيغرفة مظلمة باستخدام معالج الفيلم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: فحص الأفلام عن أدلة على أزواج كيناز الركيزة. A التعرض الطويل الثاني ويمكن أيضا أن تكون مفيدة للكشف عن أحداث الفسفرة الأضعف.

النتائج

وتظهر نتائج ممثلة من شاشة في الشكل 2. تم فحص 180 تحركات باستخدام الببتيد الركيزة GST الموسومة الموافق أأ 268-283 من CRTC2 وكذلك البروتين الأساسي الكلاسيكي كيناز فحص الركيزة المايلين (ب ب). اثنين فقط من تحركات، MARK2 وMARK3 كيناز ذات الصلة للغاية مفسفر الببتيد CRTC2. يتم تضمين ...

Discussion

منذ المنشورات الأصلية واصفا نهج ^14،15، تم توسيع المكتبة الأصلي من 180 GST-تحركات إلى 420 عضوا، أو ~ 80٪ من kinome البروتين البشري. مع مكتبة الموسعة، البروتوكول كما هو موضح يستغرق 4-5 أيام ثم 1-4 أيام لتطوير الأفلام (بحسب ما تقتضيه الضرورة)، والتي يمكن اختصارها عن طريق استخدام ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275