ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

要約

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

要約

我々は、新規のシグナル伝達経路を解明するために使用することができ、リン酸化基質のための専用のヒトプロテインキナーゼを同定するためのスクリーニングプラットフォームを開発しました。我々のアプローチは、精製GSTタグ付きヒトプロテインキナーゼのライブラリーを使用すると、目的の組換えタンパク質基質を備えています。私たちは、CREB-規制転写コアクチベーター2（CRTC2）のグルコース調節サイトのキナーゼとしてのMAP /微小管親和性調節キナーゼ2（MARK2）を識別するために、β細胞の増殖に必要なタンパク質、ならびにこの技術を使用していますアダプタータンパク質ELMOのリン酸化による細胞の転移の調節因子としてのチロシンキナーゼのAXLファミリー。私たちはこの技術を記述し、それは、細胞が環境刺激に応答する方法の包括的なマップを確立するのを助けることができる方法について説明します。

概要

タンパク質の翻訳後修飾（PTMを）は、細胞内の通信のために不可欠です。おそらく全てのPTMの検討最高の細胞内局在性、コンフォメーション、安定性、それらの生化学的活性を含むタンパク質の機能の無数を調節するタンパク質キナーゼによって触媒されるリン酸化は、です。標的タンパク質上のリン酸化部位の同定は、トリプシンリンペプチドマッピングにより、またはリン酸化ペプチド^1,2-について富化サンプルを使用して、今、標準プロテオミクス技術によって達成することができます。表現プロテオームの四分の三が³リン酸化されることが予想され、100万⁶までの推計で20万リン酸化部位^{5を特定し}ているが、これらの多くは、経路、またはプロテインキナーゼシグナル伝達、全く割り当てられた生物学を持っていません。

リン酸化部位の同定は比較的簡単ですが、比較的大きな挑戦はにあります基板のペア：これらのサイトを対象と同族キナーゼ（複数可）、我々はマッピングキナーゼと呼ぶプロセスが識別されます。いくつかのキナーゼを同定するための方法：基板対は、目的のキナーゼで開始し、その基質を探しまたは対象の基板から始まると修飾キナーゼ実験^7-11または計算^12を検索しようとするいずれかの記載されています。既知のリン酸化基質のためのキナーゼを同定するために、バイオインフォマティクスは、基板と沈殿複合体を形成するキナーゼをリン酸化残基（コンセンサス部位）に隣接する、ならびに特定のアミノ酸の短い保存配列を含むタンパク質を同定するために使用することができます。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、多くの場合、成功して満たしていません。

私たちは、急速に所定の基板^13をリン酸化することができるキナーゼを同定するための体系的な機能的なアプローチを開発しました。スクリーンアッセイは、優れた特定の生成します潜在的な同族のキナーゼのために非常に明確な選択と性、。生物学的シグナル伝達にリン酸化の中心性を考えると、画面は、事実上すべての細胞シグナル伝達経路^14-16で発見するのに便利です。画面には、ヒトタンパ​​ク質キナーゼのライブラリーと、大規模なキナーゼアッセイを実施することを含みます。キナーゼは、細菌のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タンパク質でタグ付けされており、組換え酵素があることを意味する、哺乳類細胞抽出物から精製される - 細菌から調製されたものとは異なり、 - 多くの場合に必要な上流のプロテインキナーゼの存在下で生成されます組換え酵素は、インビトロで活性を有すること。セリン、スレオニン、およびチロシンキナーゼ活性は、下流のキナーゼの活性化のために必要としながら実際には、酵母¹⁰内に存在する、酵母ゲノムは、500を超える遺伝子^17と哺乳類キノームは、するために、かなり複雑になっていることを示す、122プロテインキナーゼをコードしレギュレーションより高次の生物に固有のプロセスをTE。さらに、（例えば、 その他の小分子、増殖因子、ホルモンなど）、細胞生物学およびヒトの疾患に関連した様々な刺激の効果は、適切なコンテキストに^14,15モジュレートキナーゼ活性のために使用することができます。

プロトコル

試薬、プレート、および細胞の作製

1. 25mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、50mMのNaFを、0.5mMのEDTA pH8.0の、0.5％トリトンX-100、5mMのβグリセロリン酸、5％グリセロール：500 mlの溶解バッファー行います。 4℃で保存します。使用1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び1mMのバナジン酸ナトリウムを添加する直前。このステップの後、PMSFは、任意のすすぎバッファに必要とされません。
2. 200 mMトリスpH7.5の、50mMのベータ - グリセロホスフェート（FW 216）、2mMのバナジン酸ナトリウム：10倍キナーゼ緩衝液20mlのを行います。 -20℃で1 mlチューブで分注し、店舗。使用直前に、5mMのDTTを追加します。
3. 300μMのアデノシン三リン酸（ATP）、66mMの_MgCl 2を、-20℃で33 mMでのMnCl _2.1 mlチューブで小分けして保存：10倍、M-ATPバッファの20ミリリットルを行います。
4. 1.5グラムのトリス塩基、20 mlのグリセロール、30mLのH _{2 O：2X}ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶解緩衝液100mlを作ります溶解し、HClでpHを6.8に調整します。 40を追加mlの10％SDS、100ミリリットルにボリュームを調整します。 25 mgのブロモフェノールブルーを追加します。
5. スポット応じて96ウェルプレートとラベルプレートのセットで、ウェルあたりのGST-キナーゼ^{14をコードする} 25 ngの/μlの哺乳動物発現プラスミドの4μlの。使用するまで-20℃でプレートを密封し、凍結。
6. トランスフェクションの2日前に、CO _2（最終5％）を補充した37℃のインキュベーター内で培養HEK293Tの完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）中の細胞及び抗生物質。そしてトリプシンで通過は在庫が拡張中に、> 80％コンフルエントになることはできません。 6×10 ^7細胞の最小画面（80％コンフルエンスでHEK293T細胞の約3×15cmの皿）に必要とされます。

2.トランスフェクション

注意：プロトコル全体のフローチャートについては、図1を参照してください 。

1. キナーゼプラスミドを含むプレートは、凍結されている場合は、室温aの解凍NDウェルの底に任意の水分を収集するために、3分間1900×gで遠心します。
2. 脂質ベースのトランスフェクション試薬の312.7μlの低血清培地（例えば、OPTI-MEM）の8.6ミリリットルを混ぜます。 5分間座ってみましょう。
3. 小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて各ウェルに減少血清培地10μlのを追加します。
4. 小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて、ステップ2.2から減少血清培地/トランスフェクション試薬混合物のウェルあたり10μLを追加します。 20〜45分間座ってみましょう。
5. 完全DMEM 80mlに7.5×10 ⁵細胞/ mlで再懸濁した293T細胞。よく標準ボリュームカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いあたり100μlの細胞懸濁液（ すなわち 7.5×10 ⁴細胞）を追加します。
6. 均一な細胞分布のために顕微鏡下で井戸を確認し、24時間インキュベーターに戻します。

3. GST-キナーゼプルダウン

1. Fを作りますレッシュ_：H 2 Oの540μlの0.2 Mバナジン酸ナトリウムの60μLを混合することにより、4 mMのペルバナデートソリューション第2のチューブミックス30％の過酸化物の2.7マイクロリットルのPBS 1.4ミリリットルで。 2つのソリューションを追加し、使用前に15分間放置します。
2. マルチチャンネルピ ​​ペットを使用して（それもであまりにも多くの乱流を生成するように自動液体ディスペンサーを使用しないでください）ステップ3.1で調製した過バナジン酸の2.5μlのに続いて、各ウェルに0.25 M _CaCl 2を2μLを分注します。 37℃で10分間各プレートをインキュベートした後、氷の上に置きます。
3. 第1（試薬の調製）に示すようにDTT、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムを添加することによって溶解緩衝液の35ミリリットルを準備します。
4. 氷の上でプレートを維持、真空吸引器を使用して、各ウェルから培地を除去します。すぐに標準カセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて氷冷溶解緩衝液50μl/ウェルを追加します。オプション（溶解し、氷上で30分間座ってみましょう：必要に応じてPLATをシールすることによってここに停止することができますE、-80℃で保存します。氷の上で、解凍プレート）を続行します。
5. 4℃で3分間、1,900×gでスピンプレート。
6. 各ウェルマルチチャンネルピペットを使用してから細胞をこすり落とし、すべての内容を転送は、適切にV底96ウェルプレートをラベル付けします。 4℃で10分間、1900×gでスピンプレート。
7. スピン中、リンスとして（PMSFなし）の氷冷溶解緩衝液100μl/ウェルでグルタチオン被覆したプレート（各96ウェルプレートに1つずつ）を入力します。氷の上でプレートを保管してください。
8. 遠心機からのV底プレートを取り外します。当時の一つは、ペーパータオルの溶解バッファーとブロットを振るために、シンクの上にグルタチオンプレートを反転。底にペレットを乱さないように注意しながら、プレートを傾けると、マルチチャンネルピペットを用いて、グルタチオンプレートにV底プレートから溶解バッファーを転送します。プレートをカバーして結合するための最小2時間、氷上に残します。
9. 2時間結合ステップの終わりに近く、トンを確保し、放射能のワークステーションを準備します彼に必要な安全上の注意事項は、放射性の仕事のための場所です。 30℃のハイブリダイゼーションオーブンを設定します。
10. 1. PMSFこの段階で必要とされていないセクションに示すようにDTTおよびナトリウムバナジン酸を加えることによって、溶解緩衝液200ミリリットルを準備します。
11. 溶解バッファーを振る、ペーパータオルにブロットするシンクの上にグルタチオンプレートを反転します。ウェルは（PMSFなし）、100μlの溶解緩衝液で3倍すすいでください。井戸が乾燥座らせてはいけない - 続行する準備ができるまで、すすぎに保管してください。
12. 10倍の株式を希釈し、標準ボリュームのカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて1×KB50μlの1リンスプレート一度節に示すようにDTTを追加することによって、1×キナーゼ緩衝液（KB）の55ミリリットルを準備します。溶液Aの準備ができるまでのウェルで1倍KBを残します：
    1. 15.9ミリリットルまで530関心の基板μgの、ミエリン塩基性タンパク質の500μgの（MBP）、10倍の2.65ミリリットルKB、1 M DTTの13.25μL、 _および H 2 Oに500を追加することによって、溶液Aを準備します。
13. 一度に1つは、1×KBリンスを除去ペーパータオルにブロットし、すぐに小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて溶液Aの30μlを添加するシンクの上にプレートを反転。氷の上でプレートを保管してください。
14. 2.5ミリリットルの10倍のM-ATP、500μCiのガンマ- ³² PのATP、 _および H 2 Oに10ミリリットルを追加することによって、放射能作業領域に溶液Bを準備します。
    1. よく吐出力による混合に役立つリピーターピペットを用いあたり溶液Bの20μLを加えます。覆い、30分間30℃のハイブリダイゼーションオーブンでインキュベート。
15. 30分後、氷にバックプレートを転送します。各ウェルマルチチャンネルピペットを使用して2倍のSDS溶解緩衝液50μlを追加します。次のステップにこの時点で進行、または便利になるまで-20℃でアルミホイルや店舗でプレートをシールすることができます。

4.ランニング、染色、乾燥ゲル

注：すべての作業は、エリアdesignaで実行する必要があります放射能のためのテッド。

1. ハイブリダイゼーションオーブンをオンにして、85℃に設定してください。室温で解凍プレート。一度オーブンオーブンで10分間サンプルを変性するためにインキュベートした温度、転写板に到達しました。
2. ロード一度に複数の井戸を埋めるためにマルチチャンネルピペットを用いて、各反応15μlの26ウェルのプレキャストゲル。ケアは、すべてのヒントは、サンプルを追加する前に十分に対応して整列するように注意しなければなりません。これが組み込まれていないATPが含まれているとして、追跡用色素（青線）は、ゲルの底部から実行させてはいけない150 Vでゲルを実行します。
3. ゲルを解体して、フィルムを露出オーバーになりますようにメスまたはストレートエッジを使用して、取り込まれていないATP（青線）を遮断します。ラベル付き容器にゲルを置き、15分間のクマシー染色でカバーしています。
4. 簡単に、クマシー染色を取り除くには、水でゲルを洗浄し、溶液を脱色追加。タンパク質がはっきりと見えるようになるまで、ゲルを脱色。 MBPのためのバンドと基板用バンドべき各サンプルの見えること。
5. ゲルを乾燥させるには：
   1. ろ紙の大きなシートをカットし、乾燥機の上に置きます。
   2. それは滑らかで、しわがなくなるまで蒸留水にセロファンシートを湿らせて、紙の上に置きます。
   3. ゲルのためのノートを作り、セロハンシートの上にゲルを置きます。二セロファンシートを湿らせ、ゲルの上に置きます。
   4. 素敵な均一な表面のためのすべてのバブルを（プレートシールローラは、この適しています）ロールアウト。 、フラップを閉じ、真空をオンにし、80℃で3時間、ゲルを乾燥させます。
6. ゲルが乾燥したら、信号を強化するには、画面を使用してXARフィルムにそれらを公開します。サランラップやビニール袋でカセットをラップし、霜を保つためにテープで密封します。 -80℃で一晩カセットを保管してください。

5. XARフィルムを開発

1. 次の日、冷凍庫からカセットを除去し、室温で解凍してみましょう。フィルムを開発製造業者の指示に従ってフィルムプロセッサを用いて暗室。
   注：キナーゼ基質のペアの証拠のためのフィルムを調べます。より長い第2の露光はまた、より弱いリン酸化事象を検出するのに有用であり得ます。

結果

画面の代表的な結果を図2に示す 。180は、CRTC2キナーゼならびに古典的なキナーゼアッセイ基質ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のアミノ酸268から283に対応するGSTタグ化ペプチド基質を用いてスクリーニングしました。唯一の2つのキナーゼ、MARK2および高度に関連するキナーゼMARK3は、CRTC2ペプチドをリン酸化しました。それは多くのリン酸化残基を含有し、ゲルの底?...

ディスカッション

アプローチ^{14,15を記述する}元の出版以来、180 GST-キナーゼの元のライブラリは、ヒトタンパク質キノームの420のメンバー、または〜80％ ​​にまで拡大されました。拡大ライブラリを使用すると、説明したようにプロトコルは、ホスホおよびデジタル信号増強を使用することによって短縮することができた、（必要と認めた場合）フィルムを開発するために4〜5日、その後1-4日かかり?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275