Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening

Resumo

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Resumo

Nós desenvolvemos uma plataforma de rastreio para identificar proteínas quinases específicas de substratos fosforilados humanos que podem ser utilizados para elucidar novas vias de transdução de sinal. A nossa abordagem apresenta a utilização de uma biblioteca de proteínas quinases humano marcado com GST purificada e um substrato da proteína recombinante de interesse. Usámos esta tecnologia para identificar MAP / microtúbulo-regulação afinidade quinase 2 (MARK2) como a quinase para um local regulada por glucose, em reguladas pela CREB transcricional coativador 2 (CRTC2), uma proteína necessária para a proliferação das células beta, assim como a família de tirosina-quinases Axl como reguladores de metástases de células por fosforilação da proteína adaptadora ELMO. Descrevemos essa tecnologia e discutir como ela pode ajudar a estabelecer um mapa abrangente de como as células respondem a estímulos ambientais.

Introdução

Proteína modificações pós-traducionais (PTMs) são essenciais para a comunicação intracelular. Talvez o melhor estudada de todas as PTMs fosforilação é catalisada por proteínas quinases, que regulam uma miríade de funções de proteínas, incluindo a sua actividade bioquímica, localização subcelular, conformação, e a estabilidade. A identificação de sítios de fosforilação de proteínas alvo pode ser realizada através de mapeamento triptico fosfopéptido ou por técnicas-padrão de proteómica agora utilizando amostras enriquecidas para péptidos fosforilados ^1,2. Enquanto três quartos do proteoma expressas são esperados para ser fosforilada ^{3 e um} identificado 200.000 locais de fosforilação ^5, com estimativas de até 1 milhão de ^6, muitos deles não têm atribuído biologia, via de sinalização, ou proteína quinase.

Enquanto identificação de locais fosforilados é relativamente simples, uma comparativamente maior desafio éidentificar a cinase cognato (s) que tem como alvo estes locais, um processo que nos referimos como mapeamento de quinase: substrato pares. Várias abordagens para a identificação de quinase: substrato pares foram descritas, começando com uma quinase de interesse e procurando os seus substratos, ou a partir de um substrato de interesse e a tentativa de encontrar um modificador quinase ^7-11 experimentalmente ou computacionalmente ^12. Para identificar quinases para um substrato fosforilado conhecido, bioinformática pode ser usado para identificar proteínas que contêm uma sequência conservada curto de aminoácidos que flanqueiam o resíduo fosforilado (o local de consenso), bem como a identificação de quinases que formam um complexo com o substrato precipitável. No entanto, estas abordagens são demorados e muitas vezes não cumprem com sucesso.

Nós desenvolvemos uma abordagem funcional sistemático para identificar rapidamente quinases que fosforilam pode um determinado substrato ^13. O ensaio tela produz excelente específicodade, com a seleção muito clara para os potenciais quinases cognatas. Dada a centralidade da fosforilação de sinalização biológica, a tela é útil para a descoberta em praticamente todos os celulares vias de sinalização ^14-16. A tela envolve a realização de um ensaio de quinase em larga escala com uma biblioteca de proteínas quinases humanos. As cinases foram marcados com glutationa bacteriano S-transferase (GST) de proteínas e são purificados a partir de extractos de células de mamíferos, o que significa que as enzimas recombinantes - ao contrário do que as preparadas a partir de bactérias - são gerados na presença das proteínas quinases a montante muitas vezes necessários para a enzimas recombinantes para ter actividade in vitro. Com efeito, enquanto que a actividade da cinase de serina, treonina e tirosina necessária para a activação a jusante de quinase estão presentes na levedura ^10, o genoma da levedura codifica 122 cinases de proteína, indicando que o kinome de mamífero, com mais de 500 genes ^17, tornou-se significativamente mais complexa, a fim de regulate os processos originais para os organismos de ordem mais elevada. Além disso, o efeito de diferentes estímulos relevantes para a biologia celular e doença humana (tal como pequenas moléculas, factores de crescimento, hormonas, etc.) podem ser usados ​​para modular a actividade de quinase ^14,15 num contexto apropriado.

Protocolo

1. Preparação dos reagentes, placas, e Células

1. Adicione 500 ml de tampão de lise: Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glicerofosfato, 5% de glicerol. Armazenar a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, adicionar 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de fluoreto de fenilmetil sulfonil (PMSF), e 1 mM de vanadato de sódio. Após este passo, PMSF não é necessária em qualquer tampão de lavagem.
2. Adicione 20 ml de cinase 10X: Tris Buffer de 200 mM de pH 7,5, 50 mM beta-glicerofosfato (FW 216), vanadato de sódio a 2 mM. Da alíquota em tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C. Imediatamente antes de usar, adicionar DTT 5 mM.
3. Adicione 20 mL de tampão H-ATP 10x: 300 uM de adenosina trifosfato (ATP), 66 _mM de MgCl2, 33 mM de MnCl _2. alíquota para tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C.
4. Adicione 100 ml de 2x dodecil sulfato de sódio (SDS) de tampão de lise: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glicerol, 30 ml de H ₂ O. Dissolver e ajustar o pH para 6,8 com HCl. Adicionar 40ml de SDS a 10%, ajustar o volume para 100 ml. Adicionar 25 mg de azul de bromofenol.
5. Spot 4 ul de 25 ng / uL do plasmídeo de expressão de mamífero que codificam uma cinase de ^GST-14 por poço em placas de conjuntos de 96 poços e as placas de etiqueta em conformidade. Seal e congelar placas a -20 ° C até à sua utilização.
6. 1-2 dias antes da transfecção, as células HEK293T cultura em meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) + 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos numa incubadora a 37 ° C com CO ₂ suplementado (final de 5%). Passage com tripsina e não permitir que o estoque para se tornar> 80% confluentes durante a expansão. Um mínimo de 6 x 10 ⁷ células são necessárias para a tela (aproximadamente 3 x 15 cm pratos de células HEK293T em 80% de confluência).

2. Transfecção

Nota: Consulte a Figura 1 para um fluxograma de protocolo inteiro.

1. Se placas contendo plasmídeos quinase foram congelados, descongele em temperatura ambiente umaND, centrifugar a 1900 xg durante 3 minutos para recolher a humidade no fundo dos poços.
2. Misturar 8,6 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, meio OPTI-MEM), com 312,7 ul de reagente de transfecção à base de lípidos. Deixe descansar por 5 min.
3. Adicionar 10 ul de meio de soro reduzido para cada cavidade utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete.
4. Adiciona-se 10 uL por poço de reagente de forma a mistura de soro / transfecção reduzida a partir do passo 2.2 utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. Deixe descansar por 20 a 45 min.
5. Ressuspender as células 293T em 7,5 x 10 ⁵ células / ml em 80 ml ​​de DMEM completo. Adicionar 100 ul de suspensão de células (isto é, 7,5 x 10 ⁴ células) por poço usando um distribuidor de líquido automático equipado com uma cassete de volume padrão.
6. Verifique poços sob o microscópio para distribuição uniforme de células e retornar à incubadora durante 24 h.

3. pulldown de GST-cinase

1. Faça fresh: 4 mM de solução pervanadato por mistura de 60 ul de 0,2 M de vanadato de sódio, com 540 mL de H ₂ O. Numa segunda mistura tubo de 2,7 mL de peróxido de 30% e 1,4 ml de PBS. Adicionar as duas soluções em conjunto e deixe descansar por 15 min antes do uso.
2. Usando uma pipeta de canais múltiplos (não utilizar um distribuidor de líquido automatizado uma vez que cria demasiada turbulência no poço) dispensar 2 ul de 0,25 _M de CaCl2 em cada poço, seguido de 2,5 mL do pervanadato preparado no passo 3.1. Incubar cada placa a 37 ° C durante 10 min e, em seguida, colocar em gelo.
3. Prepare 35 ml de tampão de lise adicionando DTT, PMSF, e vanadato de sódio, tal como indicado na Seção 1 (Preparação de Reagentes).
4. Mantendo as placas em gelo, remover o meio de cada poço utilizando um aspirador de vácuo. Imediatamente adicionar 50 ul / poço de tampão de lise arrefecido em gelo utilizando um dispensador de líquido automático equipado com uma cassete de padrão. Deixe descansar 30 min em gelo para lise (opcional: pode parar por aqui, se necessário, por meio de selagem platE e armazenar a -80 ° C. Para continuar, placas de descongelamento no gelo).
5. Chapas giram a 1900 xg durante 3 min a 4 ° C.
6. Raspe células de cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e para transferir todos os conteúdos apropriadamente marcada placas de 96 poços de fundo em V. Chapas giram a 1900 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Durante a rotação, encher placas revestidas com glutationa (um para cada placa de 96 poços) com 100 ul / poço de tampão de lise arrefecido em gelo (sem adição de PMSF) como uma lavagem. Mantenha as placas no gelo.
8. Remover placas de fundo em V da centrífuga. Um de cada vez, inverter as placas de glutationa sobre uma pia para esvaziar a solução de lise e blot em uma toalha de papel. Transferir tampão de lise a partir das placas de fundo em V para as placas de glutationa por inclinação da placa e utilizando uma pipeta de canais múltiplos, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento no fundo. Cubra as placas e deixar em gelo durante mínimo 2 horas de se ligar.
9. Perto do fim do passo de ligação 2 h, preparar uma estação de trabalho radioactividade, assegurando tele precauções de segurança necessárias estão no lugar para o trabalho radioativo. Definir forno de hibridação a 30 ° C.
10. Preparar 200 ml de tampão de lise por adição de DTT e vanadato de sódio tal como indicado no ponto 1. PMSF não é necessária nesta fase.
11. Inverter as placas de glutationa sobre uma pia para sacudir a tampão de lise e blot em uma toalha de papel. Lavar os poços 3x com 100 ul de tampão de lise (sem adição de PMSF). Não deixe que os poços sentar seco - mantê-los na lavagem até que esteja pronto para prosseguir.
12. Preparar 55 ml de tampão de quinase 1x (KB) diluindo o estoque de 10x e adição de DTT, tal como indicado no ponto 1. Lavar as placas uma vez com 50 ul de 1x KB utilizando um dispensador de líquido automático equipado com uma cassete de volume padrão. Deixar 1x KB em poços até uma solução pronta é:
    1. Prepare a Solução A pela adição de 500 a 530 ug de o substrato de interesse, 500 ug de proteína básica de mielina (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13,25 ul de DTT 1 M, e _H2O até 15,9 ml.
13. Um de cada vez, inverter as placas sobre uma pia para remover 1x KB enxaguamento, seque sobre toalha de papel, e imediatamente adicionar 30 ul de uma solução utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. Mantenha as placas no gelo.
14. Preparar a solução B na área de trabalho a radioactividade por adição de 2,5 ml de 10x H-ATP, 500 uCi ^{de 32} P ATP gama-, e H _{2 O a} 10 ml.
    1. Adicionar 20 ul de solução B por poço utilizando uma pipeta de repetidor que auxilia na mistura, devido à força de ejecção. Cobrir e incubar em 30 ° C forno de hibridação durante 30 min.
15. Após 30 minutos, a transferência de volta para as placas de gelo. Adicionar 50 ul de tampão de lise 2x SDS para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Pode prosseguir neste ponto para a próxima etapa, ou selar as placas com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C até conveniente.

4. corrida, coloração e géis de secagem

Nota: Todo o trabalho deve ser realizado em uma área DESIGNAted para a radioactividade.

1. Ligue forno de hibridação e ajustado para 85 ° C. Placas de descongelamento em temperatura ambiente. Uma vez forno atingiu a temperatura, placas de transferência para forno e incubar por 10 min para desnaturar amostras.
2. Carga 26 poços géis pré-moldados com 15 ul de cada reacção utilizando uma pipeta de canais múltiplos para preencher vários poços de uma só vez. Cuidados devem ser tomados para que todas as dicas alinhar com as correspondentes bem antes de adicionar amostras. Execute gel em 150 V. Não deixe que o corante de rastreio (linha azul) funcionar fora do fundo do gel como esta contém a ATP não incorporado.
3. Desmontar os géis e cortou a ATP não incorporado (linha azul), utilizando um bisturi ou borda reta como ele vai expor demais os filmes. Coloque os gels em recipientes rotulados e cubra com Coomassie mancha para 15 min.
4. Remover a mancha de Coomassie, brevemente enxaguar os géis com água, e adicionar destain solução. Destain os géis até que as proteínas são claramente visíveis. Uma banda para MBP e uma banda para o substrato deveser visível para cada amostra.
5. Para secar o gel:
   1. Corte uma folha grande de papel de filtro e coloque-o no secador.
   2. Molhe uma folha de celofane em água destilada até que esteja lisa e sem rugas, e colocá-lo no topo do papel.
   3. Coloque os géis em cima da folha de celofane, fazendo uma nota da ordem de géis. Molhar uma segunda folha de celofane e colocar na parte superior dos géis.
   4. Rolar para fora todas as bolhas (um rolo de vedação placa funciona bem para isso) para uma superfície uniforme agradável. Fechar a aba, ligar o vácuo, e secar o gel durante 3 horas a 80 ° C.
6. Uma vez géis estão secos, expô-los a filme XAR com um ecrã de intensificar o sinal. Enrole a fita com saran wrap ou um saco plástico e feche com fita adesiva para impedir a entrada de geada. Armazenar a cassete a -80 ° C durante a noite.

5. Desenvolver XAR Films

1. No dia seguinte, remove cassete do congelador e deixar descongelar à temperatura ambiente. Desenvolver o filme emuma câmara escura usando um processador de filme de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: Examinar os filmes para provas de pares quinase-substrato. Uma segunda exposição mais longa pode também ser útil para detectar eventos de fosforilação fracas.

Resultados

Os resultados representativos de uma tela são mostrados na Figura 2. 180 quinases foram rastreadas utilizando um substrato de péptido marcado com GST correspondente aos aa 268-283 da CRTC2, bem como a proteína básica clássico ensaio de quinase substrato de mielina (MBP). Apenas duas cinases, MARK2 e o MARK3-quinase altamente relacionados com o peptídeo fosforilado CRTC2. MBP é incluído como um controlo interno em todos os ensaios, uma vez que contém muitos resíduos fosforiláv...

Discussão

Uma vez que as publicações originais que descrevem a abordagem ^14,15, a biblioteca original de 180 GST-quinases foi ampliada para 420 membros, ou ~ 80% do kinome proteína humana. Com a biblioteca ampliada, o protocolo conforme descrito leva 4-5 dias e, em seguida, 1-4 dias para desenvolver filmes (como necessário), o que pode ser encurtado através da utilização de imagiologia com fósforo e o aumento do sinal digital. Há várias etapas-chave em que os cuidados devem ser tomados (veja ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275