זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

Summary

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Abstract

פיתחנו פלטפורמת הקרנה לזהות קינאזות חלבון האנושית ייעודית למצעי phosphorylated אשר יכול לשמש כדי להבהיר מסלולי העברת אותות רומן. הגישה שלנו כוללת שימוש בספרייה של קינאזות חלבון אנושי מתויג GST מטוהר ומצע חלבון רקומביננטי של עניין. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות קינאז MAP / microtubule ויסות זיקה 2 (MARK2) כקינאז לאתר מוסדר גלוקוז על-מוסדר CREB תעתיק Coactivator 2 (CRTC2), חלבון דרוש להתפשטות תאי ביתא, כמו גם משפחת אקסל של טירוזין קינאז כרגולטורים של גרורות תא על ידי זירחון של חלבון המתאם ELMO. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו ולדון איך זה יכול לעזור להקים מפה מקיפה של כמה תאים מגיבים לגירויים סביבתיים.

Introduction

שינויי חלבון לאחר translational (PTMs) חיוניים לתקשורת תאית. אולי הכי טוב למדו מכל PTMs הוא זרחון, מזורז על ידי קינאז חלבון, המסדיר את מספר עצום של פונקציות חלבון, כוללים הפעילות ביוכימית שלהם, לוקליזציה subcellular, קונפורמציה, ויציבות. זיהוי של אתרי זירחון על חלבוני יעד יכול להתבצע על ידי מיפוי phosphopeptide tryptic או על ידי טכניקות proteomic עכשיו סטנדרטיות באמצעות דגימות מועשרים לפפטידים phosphorylated ^1,2. בעוד שלושה רבעים מproteome הביעה צפויים להיות phosphorylated ³ וזיהה 200,000 אתרי זירחון ^5, עם הערכות עד 1 ^מ'6, רבים מהם אין לי ביולוגיה הוקצתה, מסלול איתות, או חלבון kinase.

בעוד זיהוי של אתרי פוספורילציה הוא יחסית פשוט, אתגר גדול יותר הוא יחסיתלזהות אותו מקור קינאז (ים) שמכוון את האתרים הללו, תהליך שאנו מכנים קינאז מיפוי: זוגות מצע. מספר גישות לזיהוי קינאז: זוגות מצע תוארו, או מתחיל עם קינאז של עניין ומחפש מצעים שלה או מתחיל עם מצע של עניין ומנסה למצוא קינאז שינוי בניסוי ^7-11 או המחשוב ^12. לזהות קינאזות למצע phosphorylated ידוע, ניתן להשתמש ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המכילים רצף נשמר קצר של חומצות אמינו משני צדי שאריות פוספורילציה (אתר הקונצנזוס), כמו גם זיהוי קינאז היוצרים מורכב precipitable עם המצע. עם זאת, גישות אלה הן זמן רב ולעתים קרובות אינו עומדות בהצלחה.

פיתחנו גישה פונקציונלית שיטתית לזהות במהירות קינאז שיכול phosphorylate מצע נתון ^13. Assay המסך מייצר ספציפי מצוינתity, עם מבחר מאוד ברור לקינאז מקור הפוטנציאלי. בהתחשב במרכזיותה של זירחון לאיתות ביולוגית, המסך שימושי לגילוי במסלולי איתות כמעט בכל תא ^14-16. המסך כולל ביצוע assay קינאז בקנה מידה גדולה עם ספרייה של קינאזות חלבון האנושית. קינאז תויג עם S-transferase גלוטתיון חיידקי חלבון (GST) והם מטוהרים מתמציות תאים יונקים, מה שאומר שאנזימי רקומביננטי - בניגוד לאלה שהוכנו מחיידקים - נוצרים בנוכחות חלבון קינאז במעלה הזרם לעתים קרובות נדרש ל אנזימי רקומביננטי יש פעילות במבחנה. ואכן, תוך פעילות קינאז סרין, תראונין, וטירוזין קינאז הנדרשת להפעלה במורד הזרם נמצא בשמרים ^10, שמרי הגנום מקודד חלבון קינאז 122, המציין כי kinome היונקים, עם למעלה מ -500 גנים ^17, הפך באופן משמעותי יותר מורכב כדי Regulate התהליכים ייחודיים לאורגניזמים מסדר גבוהים יותר. יתר על כן, ההשפעה של גירויים שונים רלוונטיים לביולוגיה של תא ומחלות של בני אדם (כגון מולקולות קטנות, גורמי גדילה, הורמונים, וכו ') יכולה לשמש לפעילות קינאז ^14,15 לווסת בהקשר מתאים.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים, צלחות, ותאים

1. הפוך 500 מיליליטר חיץ תמוגה: 25 מ"מ טריס pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 50 מ"מ NAF, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 מ"מ בטא glycerophosphate, גליצרול 5%. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. מייד לפני השימוש, מוסיף dithiothreitol 1 מ"מ (DTT), פלואוריד 1 מ"מ sulfonyl phenylmethyl (PMSF), וvanadate נתרן 1 מ"מ. לאחר שלב זה, PMSF אינו נדרש בכל חיץ לשטוף.
2. לעשות 20 מיליליטר של 10x קינאז מאגר: 200 מ"מ טריס pH 7.5, 50 בטא glycerophosphate מ"מ (FW 216), vanadate נתרן 2 מ"מ. Aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. מייד לפני השימוש, מוסיף 5 מ"מ DTT.
3. לעשות 20 מיליליטר של 10x חיץ M-ATP: 300 מיקרומטר אדנוזין טריפוספט (ATP), 66 מ"מ MgCl _2, 33 Aliquot מ"מ MnCl _2. ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C.
4. הפוך של סולפט dodecyl נתרן 2x 100 מיליליטר (SDS) תמוגה חיץ: 1.5 בסיס גרם טריס, 20 מיליליטר גליצרול, H 30 מיליליטר ₂ O. ממיסים ולהתאים את ה- pH 6.8 עם HCl. הוסף 40מיליליטר 10% SDS, להתאים את עוצמת קול עד 100 מיליליטר. הוסף 25 bromophenol הכחול מ"ג.
5. מקום 4 μl של 25 ng / פלסמיד ביטוי היונקים μl קידוד GST-קינאז ¹⁴ לכל גם בקבוצות של 96 צלחות גם וצלחות תווית בהתאם. צלחות חותם והקפאה ב -20 ° C עד לשימוש.
6. 1-2 ימים לפני transfection, תאי HEK293T התרבות בנשר הבינוני (DMEM) + 10% בסרום שור עוברי (FBS) שונה Dulbecco המלא ואנטיביוטיקה ב37 ° C חממה בתוספת CO ₂ (5% סופיים). מעבר עם טריפסין ואינם מאפשר המניה להפוך> 80% ומחוברות בהרחבה. מינימום של 6 x 10 ⁷ תאים נדרשים עבור המסך (3 x 15 סנטימטר מנות של תאי HEK293T כ בנקודת מפגש 80%).

2. Transfection

הערה: ראה איור 1 עבור תרשים זרימה של כל פרוטוקול.

1. אם צלחות המכילות פלסמידים קינאז הוקפאו, הפשרה בטמפרטורת חדרND צנטריפוגות ב 1,900 XG במשך 3 דקות כדי לאסוף כל לחות בחלק התחתון של בארות.
2. מערבבים 8.6 מיליליטר של מדיום מופחת בסרום (למשל, OPTI-MEM) עם 312.7 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס. בואו לשבת במשך 5 דקות.
3. הוסף 10 μl של מדיום סרום מופחת לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי.
4. הוסף 10 μl לכל גם בתמהיל מגיב בינוני סרום / transfection המופחת מצעד 2.2 באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת במשך 20 עד 45 דקות.
5. תאי Resuspend 293T על 7.5 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר ב 80 מיליליטר של DMEM המלא. להוסיף השעיה תא (כלומר 7.5 x 10 ⁴ תאים) 100 μl לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי.
6. בדקו בארות תחת מיקרוסקופ לחלוקת תא אחיד ולחזור לחממה עבור 24 שעות.

הנפתח 3. GST-קינאז

1. הפוך Fפתרון pervanadate 4 מ"מ על ידי ערבוב 60 μl של 0.2 M vanadate נתרן עם 540 μl של H ₂ O.: ריש בשילוב צינור שני 2.7 μl של 30% חמצן ו -1.4 מיליליטר של PBS. להוסיף שני פתרונות יחד ולתת לשבת במשך 15 דקות לפני השימוש.
2. בעזרת פיפטה רבה (לא משתמש במתקן נוזלי אוטומטי כפי שהוא יוצר יותר מדי מערבולת בבאר) לוותר על 2 μl של 0.25 מ 'CaCl ₂ בכל טוב, ואחריו 2.5 μl של pervanadate מוכן בשלב 3.1. דגירה כל צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למקם על קרח.
3. הכן 35 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי הוספת DTT, PMSF, וvanadate נתרן כפי שצוין בסעיף 1 (הכנת ריאגנטים).
4. שמירה על צלחות על קרח, להסיר בינוני מכל גם באמצעות aspirator ואקום. מייד להוסיף 50 μl / טוב של חיץ תמוגה קר כקרח באמצעות מצויד בקלטת סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת 30 דקות על קרח לlyse (אופציונאלי: ניתן לעצור כאן במידת צורך על ידי איטום platדואר ואחסון ב -80 ° C. כדי להמשיך, צלחות הפשרה על קרח).
5. צלחות ספין ב1,900 XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. לגרד תאים מכל טוב בעזרת פיפטה רבה ולהעביר את כל התוכן לכותרתו כראוי צלחות 96 גם V-תחתון. צלחות ספין ב1,900 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
7. במהלך ספין, למלא צלחות גלוטתיון מצופים (אחד לכל צלחת 96-היטב) עם 100 μl / היטב חיץ קרח קר תמוגה (ללא PMSF) כשטיפה. שמור צלחות על קרח.
8. הסר צלחות V-תחתון מצנטריפוגות. אחד בכל פעם, להפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה והכתם על מגבת נייר. העבר את מאגר תמוגה מהצלחות V-תחתון לצלחות גלוטתיון ידי הטיית הצלחת ובעזרת פיפטה רבה, להיות זהיר, כדי לא להפריע את הכדור בחלק התחתון. לכסות צלחות ולהשאיר על קרח עבור שעה 2 מינימום להיקשר.
9. קרוב לסוף הצעד המחייב 2 שעות, להכין תחנת עבודה רדיואקטיביות, הבטחה לאהוא אמצעי בטיחות דרוש נמצא במקום עבודת רדיואקטיבי. תנור הכלאה להגדיר עד 30 מעלות צלזיוס.
10. הכן 200 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי vanadate DTT ונתרן הוספה כאמורה בסעיף 1. PMSF אינו נדרש בשלב זה.
11. הפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה ולמחוק על מגבת נייר. בארות לשטוף 3x עם 100 חיץ תמוגה μl (ללא PMSF). אל תתנו לבארות לשבת יבשות - לשמור אותם בשטיפה עד מוכן להמשיך.
12. הכן 55 מיליליטר של חיץ 1x קינאז (KB) על ידי דילול המניות 10x והוספת DTT כפי שצוין בסעיף 1. צלחות לשטוף פעם אחת עם 50 μl של 1x KB באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. השאר 1x KB בבארות עד פתרון מוכן:
    1. הכן פתרון על ידי הוספת 500-530 מיקרוגרם של המצע של עניין, 500 מיקרוגרם של חלבון המיאלין בסיסי (MBP), 2.65 מיליליטר של 10x KB, 13.25 μl של 1 M DTT, ו- H ₂ O עד 15.9 מיליליטר.
13. אחד בכל פעם, להפוך את הצלחות מעל כיור כדי להסיר שטיפת KB 1x, למחוק על מגבת נייר, ומייד להוסיף 30 μl של הפתרון באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. שמור צלחות על קרח.
14. הכן פתרון B באזור עבודת הרדיואקטיביות על ידי הוספת 2.5 מיליליטר 10x M-ATP, ATP ³² P 500 gamma- μCi, ו- H ₂ O ל -10 מיליליטר.
    1. הוסף 20 μl של הפתרון B לכל גם באמצעות פיפטה מהדר אשר מסייעת בערבוב בשל כוח פליטה. מכסים ודגירה בתנור הכלאה 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
15. לאחר 30 דקות, להעביר צלחות בחזרה לקרח. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה 2x SDS זה גם בעזרת פיפטה רבה. יכול להמשיך בשלב זה לשלב הבא, או לאטום את הצלחות בנייר אלומיניום ולאחסן ב -20 ° C עד נוח.

4. ריצה, מכתים, וג'לי ייבוש

הערה: כל העבודה צריכה להתבצע בdesigna אזורטד לרדיואקטיביות.

1. הפעל תנור הכלאה ולהגדיר עד 85 מעלות צלזיוס. צלחות הפשרה בטמפרטורת חדר. ברגע שהתנור הגיע טמפרטורה, צלחות העברה לתנור ודגירה של 10 דקות ללפגל דגימות.
2. עומס 26 היטב מראש יצוק ג'לי עם 15 μl של כל תגובה באמצעות פיפטה רבה כדי למלא כמה בארות ובעונה אחת. יש להקפיד שכל הטיפים ליישר עם מקביל היטב לפני הוספת דגימות. הפעל ג'ל ב 150 V. אל תתנו צבע המעקב (קו כחול) לברוח מתחתית הג'ל כזה מכיל ATP מאוגדים.
3. לפרק את ג'לי ומנותק ATP מאוגדים (קו כחול) באמצעות אזמל או קצה ישר כפי שהוא יהיה לחשוף יותר מדי הסרטים. מניחים את ג'לי במכולות שכותרתו ולכסות עם כתם Coomassie במשך 15 דקות.
4. להסיר את כתם Coomassie, בקצרה לשטוף את ג'לי עם מים, ולהוסיף destain פתרון. Destain ג'לי עד החלבונים נראים בבירור. להקה לMBP ולהקה למצע צריךיהיה גלוי לכל דגימה.
5. לייבש את ג'לי:
   1. חותך גיליון גדול של נייר סינון ולמקם אותו במייבש.
   2. להרטיב גיליון צלופן במים מזוקקים עד שהוא חלק ולהתקמט בחינם, ומניח אותו על גבי הנייר.
   3. הנח את ג'לי על גבי גיליון נייר צלופן, מה שהופך את הערה של סדר ג'לי. להרטיב גיליון צלופן שני ומניח על גבי ג'לים.
   4. מרדדים כל הבועות (רולר איטום צלחת עובד היטב עבור זה) למשטח אחיד נחמד. סגור את הדש, להדליק את הוואקום, ולייבש את ג 'לים 3 שעות על 80 מעלות צלזיוס.
6. ברגע שהג'לי הוא יבשים, לחשוף אותם לסרט XAR באמצעות מסך כדי להגביר את האות. עטוף את הקלטת עם ניילון נצמד או שקית ניילון ולאטום עם קלטת כדי לשמור את כפור. אחסן את הקלטת בלילה -80 ° C.

5. פיתוח XAR סרטים

1. למחרת, להסיר קלטת מהמקפיא ולתת הפשרה בטמפרטורת חדר. לפתח את הסרט בחדר חושך באמצעות מעבד סרט על פי הוראות יצרן.
   הערה: בדוק את הסרטים לראיות של זוגות קינאז-מצע. חשיפה ארוכה יותר שנייה יכולה להיות שימושית גם כדי לזהות אירועי זירחון חלשים.

תוצאות

נציגי תוצאות ממסך מוצגות באיור 2. 180 קינאז הוקרן באמצעות מצע פפטיד GST מתויג המתאים לaa 268-283 מCRTC2 כמו גם חלבון המיאלין מצע assay קינאז הקלאסי הבסיסי (MBP). רק שתי קינאזות, MARK2 וMARK3 קינאז הקשורים מאוד phosphorylated פפטיד CRTC2. MBP נכלל כבקרה פנימית בכל מבחני, כפי שהוא מכיל הרבה שא?...

Discussion

מאז הפרסומים המקוריים המתארים את הגישה ^14,15, הספרייה המקורית של 180 GST-קינאז הורחבה 420 חברים, או ~ 80% מkinome החלבון האנושי. עם הספרייה המורחבת, הפרוטוקול כפי שתואר לוקח 4-5 ימים ולאחר מכן 1-4 ימים כדי לפתח סרטים (כהכרחי), אשר יכול להתקצר על ידי שימוש בphosphorimaging ושיפור אותות ד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275