JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Аннотация

Мы разработали платформу скрининга для выявления специальные протеинкиназы человека для фосфорилированных субстратов, которые могут быть использованы для выяснения новых путей передачи сигнала. Наш подход имеет применение библиотеки очищенных GST-меченый человека протеинкиназ и рекомбинантного белкового субстрата, представляющего интерес. Мы использовали эту технологию, чтобы идентифицировать MAP / микротрубочек сродства регулирования киназы 2 (Mark2), как киназы для глюкозы регулируется сайта на CREB-застройку транскрипционных коактиватора 2 (crtc2), белок, необходимый для пролиферации бета-клеток, а также Эксл семейство тирозинкиназ в качестве регуляторов клеточного метастазов по фосфорилирования белка адаптера ELMO. Мы описываем эту технологию и обсудить, как он может помочь создать комплексную карту, как клетки реагируют на стимулы окружающей среды.

Введение

Белковые посттрансляционных модификаций (PTMs) имеют важное значение для внутриклеточного связи. Возможно, лучше всего изучен всего PTMs является фосфорилирование, катализируемое протеинкиназ, которые регулируют множество белковых функций, в том числе их биохимической активности, субклеточном локализации, конформации и стабильности. Идентификация сайтов фосфорилирования на целевых белков может быть достигнуто путем трипсином отображения фосфопептидного либо теперь стандартными методами с использованием протеомическим образцы обогащенные для фосфорилированных пептидов 1,2. В то время как три четверти выраженной протеома, как ожидается, будет фосфорилируется 3 и определены сайты фосфорилирования 200000 5, с оценками до 1 млн 6, многие из них не имеют назначенного биологию, путь, или протеинкиназы сигнализации.

В то время как идентификация фосфорилированными сайтов является относительно простым, сравнительно больше, задача состоит вопределить родственный киназы (ы), что цели эти сайты, процесс мы называем отображения киназы: пар подложки. Существует несколько подходов для определения киназы: пары подложек были описаны, либо начиная с киназы интереса и ищет ее субстратами или начиная с подложкой интереса и пытается найти модифицирующий киназу экспериментально 7-11 или вычислительно 12. Чтобы определить киназы для известного фосфорилированного субстрата, биоинформатики могут быть использованы для идентификации белков, которые содержат короткий консервативную последовательность аминокислот, фланкирующих фосфорилированный остаток (консенсус-сайта), а также определение киназы, которые образуют осаждаемой комплекс с подложкой. Тем не менее, эти подходы требуют много времени и часто не увенчались успехом.

Мы разработали системный функциональный подход быстро определить киназы, которые могут фосфорилировать данную подложку 13. Экран анализа производит отличную специфику, с очень ясным отбора потенциальных родственных киназ ность. Учитывая центральное фосфорилирования биологического сигнализации, экран полезен для открытия практически во всех клеточных сигнальных путей 14-16. Экран включает в себя проведение крупномасштабной киназы с библиотекой протеинкиназ человека. Киназы были помечены бактериальной глутатион S-трансферазы (GST) белка и очищают от млекопитающих клеточных экстрактов, что означает, что рекомбинантные ферменты - в отличие от тех, полученного из бактерий - генерируются в присутствии вверх по течению протеинкиназ часто требуемых для рекомбинантных ферментов обладают активностью в пробирке. Действительно, в то время как серин, треонин и тирозин киназы для активации нижнего киназы присутствуют в дрожжах 10, геном дрожжей кодирует 122 протеинкиназы, указывая, что kinome млекопитающих, более 500 генов 17, стало значительно сложнее, чтобы Регулат.е процессы, уникальные для более высокого порядка организмов. Кроме того, влияние различных стимулов, имеющих отношение к клеточной биологии и болезни человека (например, небольших молекул, факторов роста, гормонов и т.д.) могут быть использованы для модулирования 14,15 киназной активности в соответствующем контексте.

протокол

1. Подготовка реактивов, тарелки, и клеток

  1. Сделать 500 мл буфера для лизиса: 25 мМ Трис рН 7,5, 150 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,5% Тритон Х-100, 5 мМ бета-глицерофосфат, 5% глицерина. Хранить при 4 ° С. Непосредственно перед применением, добавьте 1 мМ дитиотреитола (DTT), 1 мМ фенилметил сульфонильную (ФМСФ), и 1 мМ ванадата натрия. После этого шага, ФМСФ не требуется в любом полоскания буфера.
  2. Сделать 20 мл 10х киназного буфера: 200 мМ Трис рН 7,5, 50 мМ бета-глицерофосфат (FW 216), 2 мМ ванадата натрия. Аликвоты по 1 мл пробирок и хранят при -20 ° С. Непосредственно перед использованием добавляют 5 мМ DTT.
  3. Сделать 20 мл 10х буфера М-АТФ: 300 мкМ аденозинтрифосфата (АТФ), 66 мМ MgCl 2, 33 мМ MnCl 2. Аликвоты в 1 мл пробирки и хранят при -20 ° С.
  4. Сделать 100 мл 2x додецилсульфата натрия (SDS) буфера для лизиса: 1,5 г Трис база, 20 мл глицерина, 30 мл Н 2 О. Растворить и довести рН до 6,8 с помощью HCl. Добавить 40мл 10% SDS, регулировки громкости до 100 мл. Добавить 25 мг бромфенолового синий.
  5. Пятно 4 мкл 25 нг / мкл плазмиды млекопитающих, кодирующие экспрессии в GST-киназы 14 на лунку в наборы 96-луночных планшетах и планшетах этикеток соответственно. Печать и замораживание пластины при температуре -20 ° С до использования.
  6. 1-2 дней до трансфекции культуры клетки HEK293T в модификации Дульбекко среде Игла полном (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики в 37 ° C инкубаторе с добавлением CO 2 (конечная 5%). Прохождение трипсином и не позволяют фондовый стать> 80% сливающиеся в процессе расширения. Минимум 6 х 10 7 клеток необходимы для экрана (примерно 3 х 15 см блюда HEK293T клеток в 80% слияния).

2. Трансфекция

Примечание: На рисунке 1 блок-схемы всего протокола.

  1. Если пластины, содержащие плазмиды киназы были заморожены, оттепель при комнатной температурей центрифуге при 1900 мкг в течение 3 мин, чтобы собрать любую влагу на дне лунки.
  2. Смешайте 8,6 мл среды сывороточного пониженном (например, OPTI-MEM) с 312,7 мкл липидного основе реагента для трансфекции. Пусть сидят в течение 5 мин.
  3. Добавьте 10 мкл восстановленного среде сыворотки в каждую лунку с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного малого объема кассеты.
  4. Добавьте 10 мкл на лунку восстановленного сыворотки среды / трансфекции смеси реагентов со стадии 2.2 с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного малого объема кассеты. Дайте настояться в течение 20 до 45 мин.
  5. Ресуспендируют клетки 293Т 7,5 х 10 5 клеток / мл в 80 мл полной среды DMEM. Добавить 100 мкл клеточной суспензии (т.е. 7,5 х 10 4 клеток на лунку) с использованием автоматизированной дозатора жидкости, снабженного стандартной громкости кассеты.
  6. Проверка под микроскопом скважин для равномерного распределения клеток и вернуться к инкубаторе в течение 24 часов.

3. GST-киназы Понижения

  1. Сделайте преш: 4 мм pervanadate решение путем смешивания 60 мкл 0,2 М ванадатом натрия с 540 мкл H 2 O. Во втором смеси трубки 2,7 мкл 30% перекиси и 1,4 мл PBS. Добавить два решения вместе, и пусть сидят в течение 15 мин перед использованием.
  2. Использование многоканальной пипетки (не использовать автоматизированную дозатора жидкости, так как создает слишком много турбулентности в скважине) обойтись 2 мкл 0,25 М CaCl 2 в каждую лунку, после чего 2,5 мкл pervanadate, полученного на стадии 3.1. Инкубируют каждый планшет при 37 ° С в течение 10 мин, а затем поместить на льду.
  3. Подготовьте 35 мл буфера для лизиса, добавив DTT, ФМСФ и ванадат натрия, как указано в разделе 1 (Приготовление реагентов).
  4. Поддержание пластины на льду, удалить носитель из каждой лунки с помощью вакуумного аспиратора. Сразу добавить 50 мкл / лунку ледяной буфер лизиса с использованием автоматизированной дозатора жидкости, снабженного стандартной кассете. Пусть сидят 30 мин на льду лизировать (опционально: может останавливаться, если необходимо, уплотнения Platэлектронной и хранения при -80 ° С. Чтобы продолжить, оттепель пластины на льду).
  5. Побочные пластины в 1900 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
  6. Очистите клетки из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и передать все содержание надлежащим образом помечены пластины V-дно 96 также. Спин пластины при 1900 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  7. Во время спина, заполните глутатиона покрытием пластин (по одному для каждого 96-луночного планшета) с 100 мкл / лунку ледяной буфера для лизиса (без PMSF) в качестве полоскания. Хранить пластины на льду.
  8. Удалить пластины V-дно из центрифуги. По одному, инвертировать глутатиона пластины над раковиной, чтобы вытряхнуть буфер лизиса и пятном на бумажное полотенце. Передача буфера для лизиса с пластин V-нижней части, чтобы глутатион пластин, наклоняя пластину и с помощью многоканальной пипетки, следя, чтобы не мешать осадок на дне. Торцевые пластины и оставить на льду в течение 2 ч минимального связывать.
  9. Ближе к концу стадии связывания 2 ч, подготовить станцию ​​радиоактивности, обеспечивая тон необходимые меры безопасности на месте для радиоактивных работы. Установите гибридизации духовку до 30 ° C.
  10. Подготовьте 200 мл буфера для лизиса, добавив DTT и натрия ванадатом, как указано в разделе 1. PMSF не требуется на данном этапе.
  11. Обратить глутатиона пластины над раковиной, чтобы вытряхнуть буфер лизиса и промокните на бумажном полотенце. Промыть лунки 3 раза с 100 мкл буфера для лизиса (без PMSF). Не позволяйте скважин сидеть сухой - не держать их в полоскании до готовности, чтобы продолжить.
  12. Подготовка 55 мл 1x киназного буфера (KB) путем разбавления 10x запас и добавление ДТТ, как указано в разделе 1. Промыть пластины один раз с помощью 50 мкл 1х КБ с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного стандартной объемной кассеты. Оставить 1x КБ в скважинах до раствор А не готова:
    1. Приготовьте раствор А, добавив 500 до 530 мкг субстрата интерес, 500 мкг основного белка миелина (ОБМ), 2,65 мл 10х KB, 13,25 мкл 1 М DTT, и H 2 O до 15,9 мл.
  13. По одному, инвертировать пластин над раковиной, чтобы удалить 1x KB полоскание, пятно на бумажное полотенце и сразу же добавить 30 мкл раствора А с использованием автоматического дозатора жидкости, снабженного малого объема кассеты. Хранить пластины на льду.
  14. Приготовьте раствор B в области радиоактивности работы, добавляя 2,5 мл 10x M-АТФ, 500 мкКи гамма 32 P АТФ, и H 2 O в 10 мл.
    1. Добавьте 20 мкл раствора В в каждую лунку с помощью пипетки ретранслятора, который помогает в смешивании из-за выброса силы. Накройте и инкубируйте в 30 ° C гибридизации печи в течение 30 мин.
  15. Через 30 мин, трансфер пластины обратно в лед. Добавить 50 мкл 2x буфера для лизиса SDS в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Могут протекать при этой точке к следующему шагу, или не запечатать пластины с алюминиевой фольгой и хранят при -20 ° С до удобно.

4. Выполнение, окрашивание и сушка Гели

Примечание: Все работы должны быть выполнены в области DESIGNAТед радиоактивности.

  1. Включите гибридизации печи и установлен на 85 ° С. Оттаивания пластины при комнатной температуре. После того, как печь достигла температуры, передачи пластин печи и инкубировать в течение 10 мин для денатурации образцов.
  2. Нагрузка 26-а гели предварительно литые с 15 мкл каждого реакции с использованием многоканальной пипетки, чтобы заполнить несколько скважин сразу. Уход должны быть приняты, что все советы выравнивания с соответствующими перед добавлением образцов. Запустите гель при 150 В. Не позволяйте отслеживания краситель (синяя линия) бежать в нижней части геля, поскольку это содержит неинкорпорированную АТФ.
  3. Демонтаж гели и отрезать неинкорпорированную АТФ (синяя линия), используя скальпель или прямой край, как это будет передержать фильмы. Поместите гели маркированных контейнерах и накрыть Coomassie пятно в течение 15 мин.
  4. Удалить пятно Кумасси, кратко промыть водой гели с, и добавить destain решение. Destain гелей, пока белки не четко видны. Полоса для MBP и группа для подложки должныбудет видно для каждого образца.
  5. Чтобы высушить гели:
    1. Вырезать большой лист фильтровальной бумаги и поместите его на стол.
    2. Смочите лист целлофана в дистиллированной воде, пока она не является гладкой и морщины бесплатно, и поместите его в верхней части листа.
    3. Положите гели сверху целлофановую листа, принятия к сведению порядка гелей. Смочите второй целлофановой лист и поместите на вершине гелей.
    4. Раскатать все пузырьки (плита уплотнения ролика работает хорошо для этого) для хорошей однородной поверхностью. Закрыть крышку, включить вакууме и высушить гели в течение 3 ч при 80 ° С.
  6. После того, как гели сухой, не подвергайте их XAR фильма с помощью экрана, чтобы активизировать сигнал. Оберните кассету с пленкой или Саран полиэтиленовый пакет и запечатать лентой, чтобы не пустить мороз. Хранить кассету при -80 ° С в течение ночи.

5. Разработка Xar Фильмы

  1. На следующий день, удалить кассету из морозильника и пусть оттепель при комнатной температуре. Разработка пленку вфотолаборатории с использованием процессора пленки в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Изучите фильмы для доказательства пар киназы-подложки. Второй больше экспозиции также может быть полезно для выявления слабых события фосфорилирования.

Результаты

Типичные результаты экране показаны на рисунке 2. 180 киназы, подвергали скринингу с использованием GST-меченый субстрат, соответствующий пептид АА 268-283 из crtc2 а также классический киназы субстрат основного белка миелина (МВР). Только два киназы, MARK2 и высоко связанные киназы фосфо...

Обсуждение

С оригинальных публикаций, описывающих подход 14,15, оригинальная библиотека 180 GST-киназы был расширен до 420 членов, или ~ 80% от kinome белка человека. С расширенной библиотеки, протокол, как описано занимает 4-5 дней, а затем 1-4 дней, чтобы развивать фильмы (по мере необходимости), которая мо...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSERC 386634. Мы хотели бы поблагодарить членов Screaton Lab за полезные обсуждения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Lysis bufferMade in houseSee Protocol step 1.1
10x kinase bufferMade in houseSee Protocol step 1.2
10x M-ATPMade in houseSee Protocol step 1.3
Human kinase plasmidsOrfeome, Invitrogen, OrigeneGST-tagged in house
96 well platesFisher ScientificCS003595
293T cellsATCCCRL-11268
DMEMFisher ScientificSH3002201supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubatorSanyoMCO-17AIC
15 cm cell culture dishesFisher Scientific877224
Reduced serum mediumInvitrogen22600-050
Lipid-based transfection reagentInvitrogen11668-019
Automated liquid dispenserThermo Scientific5840300
Small cassette attachmentThermo Scientific24073295
Standard cassette attachmentThermo Scientific14072670
4 mM pervanadateMade in houseSee Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)Labnetp4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)Thermo Scientific4661040
V-bottom 6-well platesEvergreen Scientific290-8116-01V
Glutathione coated 96-well platesFisher ScientificPI-15240
Hybridization ovenBiostad350355
GST tagged substrateMade in house
Myelin Basic Protein (MBP)SigmaM1891
Repeater pipette (1 ml)Eppendorf22266209
32P gamma-ATPPerkin ElmerBLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)Made in houseSee Protocol step 1.4
26-well precast TGX gelsBioRad567-1045gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stainMade in house0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destainMade in house10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containersMade in houseUsed plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paperFisher Scientific57144
Cellophane sheets (2)BioRad165-0963
Gel dryerLabconco4330150
Double emulsion autoradiography filmVWRIB1651454
Film cassetteFisher ScientificFBAC-1417
Intensifying screenFisher ScientificFBIS-1417
Plate sealing rubber rollerSigmaR1275

Ссылки

  1. Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).
  2. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS chem. 10, 63-71 (2015).
  3. Sharma, K., et al. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).
  4. Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update. Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).
  5. Walsh, C. T. . Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).
  6. Boersema, P. J., et al. In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling. Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).
  7. Hutti, J. E., et al. A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity. Nat Methods. 1, 27-29 (2004).
  8. Johnson, S. A., Hunter, T. Kinomics: methods for deciphering the kinome. Nat Methods. 2, 17-25 (2005).
  9. Pawson, T., Nash, P. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science. 300, 445-452 (2003).
  10. Zhu, H., et al. Analysis of yeast protein kinases using protein chips. Nat Genet. 26, 283-289 (2000).
  11. Shah, K., Shokat, K. M. A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases. Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).
  12. Zou, L., et al. PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites. BMC bioinform. 14, 247 (2013).
  13. Varjosalo, M., et al. Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling. Cell. 133, 537-548 (2008).
  14. Jansson, D., et al. Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).
  15. Fu, A., Screaton, R. A. Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family. Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).
  16. Abu-Thuraia, A., et al. Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion. Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).
  17. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

102kinomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены