Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Özet

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Özet

Bu yeni sinyal transdüksiyon yollar aydınlatmak için kullanılabilir fosforile edilmiş alt tabakalar için özel bir insan protein kinazlar tespit için bir tarama platformu geliştirdik. Yaklaşımımız saflaştınldı GST-etiketli insan protein kinazların bir kütüphane ve ilgi konusu bir rekombinant protein alt-tabakanın kullanımı ile ilgilidir. Biz, CREB Düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici 2 (CRTC2) bir glükoz ayarlı bir site için kinaz MAP / mikrotübül afinite düzenleyici kinaz 2 (MARK2) tanımlamak için bir beta hücre çoğalması için gerekli olan bir proteini, hem de bu teknolojiyi kullanmıştır tirozin Axl ailesi adaptör protein ELMO fosforilasyonu, hücre metastazı düzenleyicileri olarak kinazlar. Biz bu teknolojiyi tanımlamak ve hücrelerin çevresel uyaranlara tepki nasıl kapsamlı bir haritasını oluşturmak için nasıl yardımcı olabileceğini tartışmak.

Giriş

Protein post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) hücre içi iletişim için gereklidir. Belki de en iyi incelenen PTMS hücre altı konumlanması, konformasyon ve kararlılık, biyokimyasal aktivitesi de dahil olmak üzere protein fonksiyonları, bir sayısız düzenleyen protein kinazlar tarafından katalize fosforilasyon vardır. Hedef proteinler üzerinde fosforilasyon tanımlanması triptik fosfopeptıt haritalaması ile fosforile peptidler ^1,2 zenginleştirilmiş örnekler kullanılarak artık standart proteomik tekniklerle gerçekleştirilebilir. Ifade proteomun dörtte üçü ³ fosforile olması beklenen ve 1.000.000 ^{6 kadar} tahminleri ile 200,000 fosforilasyon siteleri ⁵ tespit edilir olsa da, bunların çoğu bir yol ya da protein kinazı sinyal, herhangi bir verilen biyoloji sahiptir.

Fosforile sitelerin tespiti nispeten büyük bir meydan okuma olduğunu, görece kolay olmasına karşınAlt tabaka çiftleri: bu siteleri hedefliyor soydaş kinaz (ler), biz haritalama kinaz olarak adlandırdığımız bir süreci tanımlamak. Alt tabaka çiftleri tarif edilmiştir, ya ilgi kinaz ile başlayan ve yüzeylerde arıyor veya ilgi bir alt tabaka ile başlayan ve bir modifiye kinaz deneysel ^7-11 veya hesaplama ¹² bulmaya çalışırken: kinaz tanımlamak için çeşitli yaklaşımlar. Bilinen bir fosforile edilmiş substrat için kinazlar tespit etmek için, alt-tabaka biyoinformatik ile çökeltilebilir kompleks oluşturmak kinazlar fosforilatlanmış bir tortu (konsensüs sitesi) yan, hem de tespit amino asitlerin kısa korunmuş dizisini içeren proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, zaman alıcı ve genellikle başarı ile uymayan.

Biz hızla belirli bir alt tabaka ¹³ fosforile edebilir kinazlar belirlemek için sistematik bir işlevsel yaklaşım geliştirdi. Ekran tahlil mükemmel spesifik üretirPotansiyel soydaş kinazlar için çok net bir seçim ile Sığ. Biyolojik sinyalleşme fosforilasyon merkezi konumu göz önüne alındığında, ekran hemen hemen tüm hücre sinyal yollarının ^14-16'da keşfi için yararlıdır. Ekran, insan protein kinazlann bir kütüphane ile geniş çaplı bir kinaz tahlili yerine getirilmesini kapsamaktadır. Kinazlar bakteriyel glutation S-transferaz (GST) proteini ile etiketlenmiş ve rekombinant enzimlerin, yani memeli hücre özütlerinden saflaştırıldı - bakterilerden hazırlanmış olan farklı - genellikle için gerekli yukarı akış protein kinazların varlığında oluşturulur Rekombinant enzimlerin in vitro aktiviteye sahip oldukları. Serin, treonin ve tirosin kinaz aktivitesi alt kinaz aktivasyonu için gereken Nitekim, maya ¹⁰ içinde mevcut olan, maya genomu 500 gen üzerinde ¹⁷ memeli kinome, için önemli ölçüde daha karmaşık hale gelmiştir belirten 122 protein kinazlan kodlar regulayüksek mertebeden organizmalara özgü süreçleri te. Ayrıca, hücre biyolojisi ve (örneğin, vb küçük moleküller, büyüme faktörleri, hormonlar, gibi), insan hastalığı ile ilgili çeşitli farklı uyarıcı etkisi, uygun bir çerçevede ^14,15 modüle kinaz aktivitesi için kullanılabilir.

Protokol

Reaktifler, Tabaklar ve Hücreleri 1. Hazırlık

1. 25 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.5 mM EDTA, pH 8.0,% 0.5 Triton X-100, 5 mM p-gliserofosfat,% 5 gliserol, 500 ml lizis tamponu sağlayın. 4 ° C'de saklayın. Kullanmak 1 mM ditiotreitol (DTT), 1mM fenilmetil sülfonil fluorür (PMSF) ve 1 mM sodyum vanadat eklemek için hemen önce. Bu aşamadan sonra, PMSF bir durulama tamponu içinde gerekli değildir.
2. 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-gliserofosfat (FW 216), 2 mM sodyum vanadat: 10x Kinaz Tamponu 20 ml sağlayın. -20 ° C'de 1 ml'lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza. Kullanmak 5 mM DTT eklemek için hemen önce.
3. 300 uM adenosin trifosfat (ATP), 66 _mM MgCl2, -20 ° C'de 33 mM MnCl _2. 1 ml'lik tüplerde ml başına kısım ve mağaza: 10x M-ATP tamponu 20 ml sağlayın.
4. 2x sodyum dodesil sülfat 100 ml Yap (SDS) lizis tamponu: 1,5 g Tris baz, 20 ml gliserol, 30 ml _H2O Eritin ve HCI ile 6.8 pH'a ayarlanır. 40 Ekleml% 10 SDS, 100 ml ses seviyesini ayarlamak. 25 mg bromofenol mavi ekleyin.
5. Noktası buna uygun olarak, 96 gözlü levhalar ve etiket plakaları setleri göz başına bir GST-kinaz kodlayan ¹⁴ 25 ng / | il memeli ekspresyon plazmidi 4 ul. Kullanılana kadar -20 ° C'de dondurularak mühür ve plakalar.
6. Transfeksiyondan 1-2 gün önce, _CO2 (son% 5) ile desteklenmiş 37 ° C inkübatör içinde bir kültür HEK293T tamamlandı Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) +% 10 cenin sığır serumu (FBS) hücreler ve antibiyotik. Ve tripsin ile Passage stok genişleme sırasında>% 80 konfluent haline izin vermez. 6 x 10 ⁷ hücrelerinin en az ekran (80% birleştiği noktada HEK293T hücrelerinin yaklaşık 3 x 15 cm yemekleri) için gereklidir.

2. Transfeksiyon

Not: Tüm protokolün bir akış şeması için Şekil 1'e bakınız.

1. Kinaz plazmidler içeren plakalar donduruldu varsa, oda sıcaklığı a at çözülmend kuyu altındaki nemi toplamak için 3 dakika boyunca 1900 x g'de santrifüjlenir.
2. Lipit bazlı transfeksiyon reaktifi 312,7 ul düşük serum ortamında (örneğin, OPTI-MEM) 8,6 ml karıştırın. 5 dakika bekletin.
3. Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak her bir kuyucuğa, düşük serum ortamı 10 ul ekle.
4. Küçük hacimli bir kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak adım 2.2 düşük serum ortamı / transfeksiyon reaktifi karışımı oyuk başına 10 ul ekle. 20 ila 45 dakika bekletin.
5. Tam DMEM, 80 ml ​​7.5 x 10 ⁵ hücre / ml'de yeniden süspanse 293T hücreleri. Ve bir standart birim kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak göz başına hücre süspansiyonu (yani, 7.5 x 10 ⁴ hücre), 100 ul ekle.
6. Homojen hücre dağılımı için mikroskop altında kuyu kontrol edin ve 24 saat boyunca inkübatör dönmek.

3. GST-kinaz Düşürme

1. F yapresh: _H2O 540 ul 0.2 M sodyum vanadat 60 ul karıştırılarak 4 mM pervanadate çözeltisi Bir ikinci tüp karışımı 30% peroksit 2,7 ul PBS içinde 1.4 mi. Birlikte iki çözüm ekleyin ve kullanmadan önce 15 dakika bekletin.
2. (Bu oyuk çok fazla türbülans yaratır gibi bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanmayın) Aşama 3.1'de elde pervanadate 2.5 ul ve ardından, her bir çukura 0.25 M _CaCI2 2 ul dağıtmak çok kanallı pipet kullanarak. 10 dakika boyunca 37 ° C 'de, her plaka inkübe ve daha sonra buz üzerine yerleştirin.
3. Bölüm 1 (reaktiflerinin preparasvonu) 'de gösterildiği gibi DTT, PMSF ve sodyum vanadat eklenerek liziz tamponu 35 ml hazırlayın.
4. Buz üzerinde plakaları tutulması, her bir kuyunun bir vakum aspiratörü kullanarak orta çıkarın. Hemen standart kaset ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 50 ul / oyuk buz soğuğu lizis tamponu ilave edin. Parçalamak için buz üzerinde 30 dk bekletin (opsiyonel: plat sızdırmazlık burada gerekirse durdurabilirsinize ve -80 ° C'de saklama. Buz üzerinde, çözülme plakaları) devam etmek.
5. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1900 x g'de Spin plakalar.
6. Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanılarak hücreler kazıyın ve içeriğini aktarmak uygun V-tabanlı 96 gözlü levhalar etiketli. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1900 x g'de Spin plakalar.
7. Spin sırasında, bir durulama maddesi olarak 100 ul / oyuk (PMSF) olmadan, buz sıcaklığında lizis tamponu ile glutatiyon kaplı plakalar (her biri 96-delikli plaka için bir adet) doldurun. Buz üzerinde tabak tutun.
8. Santrifüj V-tabanlı plakalar çıkarın. Bir kerede bir, bir kağıt havlu üzerine lizis tamponu ve leke dışarı sallamak için bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Alt pelet rahatsız değil dikkatli olmak, plaka devirme ve çok kanallı pipet kullanarak glutatyon plakalarına V-tabanlı plakalardan lizis tamponu aktarın. Kapak plakaları ve bağlama en az 2 saat süreyle buz üzerinde bırakın.
9. 2 saat bağlama aşamasında sonuna yakın, t sağlanması, bir radyoaktivite iş istasyonunu hazırlamakO gerekli güvenlik önlemleri radyoaktif çalışmalar için yerdesiniz. 30 ° C olarak ayarlayın hibridizasyon fırın.
10. Bu aşamada gerekli değildir Bölüm 1. PMSF belirtildiği gibi ilave DTT ve sodyum vanadat ile liziz tamponu 200 ml hazırlayın.
11. Lizis tamponu silkelemek ve bir kağıt havlu üzerine örtecek bir lavabonun üzerinde glutatyon plakları ters çevirin. Durulayın kuyular (PMSF olmadan) 100 ul lizis tamponu ile 3x. Devam etmek için hazır olana kadar durulama saklayın - kuyular kuru oturup izin vermeyin.
12. 10x stok seyreltilmesi ve standart bir ses kaseti ile donatılmış bir otomatik sıvı dağıtıcı kullanılarak 1x KB 50 ul 1. Durulama plakalar bir kere daha bölümünde belirtildiği gibi DTT ekleyerek 1x kinaz tamponu (KB) içinde 55 ml hazırlayın. Çözelti A hazır olana kadar kuyularda 1x KB bırakın:
    1. 15,9 ml kadar 530 ilgi substratın ug, miyelin bazik protein, 500 ug (MBP), 10x 2,65 ml KB, 1 M DTT 13.25 ul, _ve H2O için 500 eklenerek çözelti bir hazırlayın.
13. Bir kerede bir, 1x KB durulama kaldırmak kağıt havlu üzerine leke ve hemen bir küçük hacimli kaseti ile donatılmış otomatik bir sıvı dağıtıcı kullanarak Çözüm A 30 ul eklemek için lavabonun üzerinde plakları ters çevirin. Buz üzerinde tabak tutun.
14. 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gama ^32P ATP, _ve H2O ile 10 ml ilave etmek suretiyle radyoaktivite çalışma alanında Çözelti B hazırlayın.
    1. Iyi İtme kuvveti nedeniyle karıştırma yardımcı olan bir tekrarlayıcı pipet kullanarak başına Çözüm B 20 ul ekleyin. Kapak ve 30 dakika boyunca 30 ° C hibridizasyon fırında inkübe edin.
15. 30 dakika sonra, buz geri plakaları aktarın. Her bir göze, bir çok kanallı pipet kullanarak 2x SDS lizis tamponu 50 ul ekle. Bir sonraki adımda, bu noktada gerçekleştirilebilir, ya da uygun kadar -20 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza ile plakaları sızdırmaz olabilir.

4. Koşu, Boyama ve Kurutma Jeller

Not: Tüm çalışmalar bir alan DESIGNA'da yapılmalıdırradyoaktivite ted.

1. Hibridizasyon fırında açın ve 85 ° C'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında Plakaları eritin. Bir kez fırın fırın ve 10 dk numune denatüre etmek için inkübe sıcaklık, devir plakaları ulaşmıştır.
2. Bir çok kanallı pipet kullanarak her reaksiyonun 15 ul yükleyin 26-iyi prekast jeller aynı anda birden fazla kuyu doldurun. Bakım Bütün ipuçlarını mukabil önce iyice örnekleri ekleyerek uyum dikkat edilmelidir. Bu unincorporated ATP içerdiği izleme boya (mavi çizgi) jel alt kaçıp izin vermeyin, 150 V'de jel çalıştırın.
3. Jeller sökün ve bir neşter veya filmleri overexpose gibi cetvel kullanarak tüzel kişiliği olmayan ATP (mavi çizgi) kesti. Etiketli kaplar içinde jeller yerleştirin ve 15 dakika için Coomassie boyası ile kaplayın.
4. Kısaca, Coomassie leke çıkarmak suyla durulayın jeller ve çözüm destain ekleyin. Jeller destain proteinler açıkça görünür olana kadar. MBP için bir bant ve alt tabaka için bir grup olmalıdırHer numune için görünür.
5. Jeller kurutulması için:
   1. Filtre kağıdı büyük kesin, kurutma üzerine yerleştirin.
   2. Bu pürüzsüz olana kadar damıtılmış su içinde, bir selofan bir plaka ıslatın ve ücretsiz kırışıklık ve kağıdın üstüne yerleştirin.
   3. Jellerin düzen not ederek, selofan levha üstünde jeller yatırın. İkinci selofan sayfasını ıslatın ve jeller üstüne yerleştirin.
   4. Güzel bir üniforma yüzey tüm kabarcıklar (bir tabak sızdırmazlık silindir bunun için iyi çalışır) dışarı rulo. , Kapağını kapatın vakum açın ve 80 ° C'de 3 saat boyunca jeller kurulayın.
6. Jeller kuru olduğunda, sinyal yoğunlaştırmak için bir ekran kullanılarak XAR filmi bunları ortaya çıkarmak. Saran wrap veya plastik torba ile kaseti sarın ve don dışında tutmak için bant ile mühür. -80 ° C sıcaklıkta gece boyunca kaseti saklayın.

5. XAR Filmleri Geliştirme

1. Ertesi gün, dondurucudan kaseti çıkarmak ve oda sıcaklığında çözülme sağlar. Filmi geliştirinkaranlık oda üreticinin talimatlarına göre bir film işlemcisi kullanılarak.
   Not: kinaz substrat çiftlerinin kanıt filmleri inceleyin. İkinci uzun pozlama da zayıf fosforilasyon olaylarını tespit etmek için yararlı olabilir.

Sonuçlar

Bir ekranda Örnek sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. 180 kinazlar CRTC2 gibi klasik kinaz deneyi alt-tabaka miyelin bazik proteini (MBP) ile ilgili aa 268-283 tekabül eden bir GST-etiketli peptid alt-tabakası kullanılarak taranmıştır. Sadece iki kinazlar MARK2 ve yüksek ölçüde ilişkili kinaz MARK3 CRTC2 peptidi fosforile. Birçok fosforlaştınlabilen kalıntısı içerir ve jelin alt kısmına doğru, 18 kDa'da çalışan olarak MBP, tüm deneylerde bir iç ko...

Tartışmalar

Yaklaşımı ^14,15 tanımlayan özgün yayınlar bu yana, 180 GST-kinazlar orijinal kütüphanesi insan proteini kinome 420 üye, ya da ~% 80 genişletilmiştir. Genişletilmiş kütüphanesi ile, açıklanan protokol (gerekli görüldüğünde gibi) fosforlu ve dijital sinyal iyileştirme kullanılarak kısaltılmış olabilir, hangi filmleri geliştirmek için 4-5 gün sonra 1-4 gün sürer. Dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adımlar (protokol bakış için Bkz: Şekil 1) vardır. İl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Made in house		See Protocol step 1.1
10x kinase buffer	Made in house		See Protocol step 1.2
10x M-ATP	Made in house		See Protocol step 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-tagged in house
96 well plates	Fisher Scientific	CS003595
293T cells	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	supplement with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm cell culture dishes	Fisher Scientific	877224
Reduced serum medium	Invitrogen	22600-050
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen	11668-019
Automated liquid dispenser	Thermo Scientific	5840300
Small cassette attachment	Thermo Scientific	24073295
Standard cassette attachment	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Made in house		See Protocol step 3.1
0.25 M CaCl2	Made in house
Multichannel pipette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Multichannel pipette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bottom 6-well plates	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione coated 96-well plates	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridization oven	Biostad	350355
GST tagged substrate	Made in house
Myelin Basic Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pipette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Made in house		See Protocol step 1.4
26-well precast TGX gels	BioRad	567-1045	gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest
Coomassie stain	Made in house		0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol
Coomassie destain	Made in house		10% acetic acid, 20% methanol
Labeled gel containers	Made in house		Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel
Whatman filter paper	Fisher Scientific	57144
Cellophane sheets (2)	BioRad	165-0963
Gel dryer	Labconco	4330150
Double emulsion autoradiography film	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensifying screen	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275