تصنيع ميكانيكيا الانضباطي والحيويه المعادن سقالات للتطبيقات الطبية الحيوية

Summary

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Abstract

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Introduction

بينما الحيوية المعدنية وقد استخدمت على نطاق واسع كما يزرع الحاملة والأجهزة التثبيت الداخلية بسبب قوتها ممتازة الميكانيكية ^{والمرونة،} 1-3 أنها تنطوي على تحديين أساسيين: 1) عدم تطابق الميكانيكية لأن المعادن هي أشد بكثير من الأنسجة البيولوجية، مما تسبب في أضرار غير مرغوب فيها إلى الأنسجة المحيطة و2) النشاط الحيوي المنخفض الذي غالبا ما يؤدي إلى ضعف التفاعل مع الأنسجة البيولوجية، وكثيرا ما أثار ردود فعل جسم غريب (مثل التهاب أو تجلط الدم). وقد اقترحت ^4-6 السقالات المعدنية المسامية لتعزيز نشوب العظام في الهياكل، وتحسين الاتصال العظام زرع حين قمعت آثار درعا الإجهاد بسبب انخفاض صلابة من ^7-9 وعلاوة على ذلك، تم تطبيق مختلف التعديلات السطحية لتعزيز الانشطة البيولوجية ليزرع المعدنية. وتشمل هذه التعديلات طلاء سطح المعدن مع الجزيئات النشطة بيولوجيا (على سبيل المثال، القوات المسلحة الكونغولية النموالاختصاصات) أو الأدوية (مثل فانكومايسين، التتراسيكلين) ^10-12 ومع ذلك، المشاكل مثل انخفاض الخواص الميكانيكية للسقالات معدنية مسامية، انخفض صلابة والإفراج السريع لطبقات الطلاء النشطة بيولوجيا لا تزال دون حل. ^13-16

على وجه الخصوص، التيتانيوم (تي) وتي سبائك هي واحدة من أنظمة biometal الأكثر شعبية بسبب خصائصها الميكانيكية الممتازة والاستقرار الكيميائية، وتوافق مع الحياة جيدة. ^13،17-19 جذبت أيضا تطبيقات على شكل رغوة منها اهتماما متزايدا لأن 3D شبكات مسامية تعزيز نشوب العظام بالإضافة إلى الخواص الميكانيكية مثل العظام. وقد بذلت ^20-22 الجهود المبذولة لتحسين الخواص الميكانيكية من خلال تطوير تقنيات التصنيع الجديدة بما في ذلك تكرار من الإسفنج البوليمر، تلبد من جزيئات معدنية، النماذج الأولية السريعة (RP) الأسلوب، و مساحة طريقة حامل من أجل السيطرة على ميزات مختلفة من المسام (على سبيل المثال، المسام جزء،الشكل والحجم والتوزيع والتوصيل) وخصائص المواد (على سبيل المثال، المرحلة المعدنية والنجاسة) ^23-25 ​​في الآونة الأخيرة، اكتسبت صب تجميد المياه القائمة على المعادن الطين اهتماما كبيرا لإنتاج تعزيز ميكانيكيا أشكال تي مع المسام متماشية بشكل جيد هياكل من خلال الاستفادة من اتجاه ونمو التغصنات الجليد أثناء التصلب. ومع ذلك، وتلوث الأكسجين الناجم عن الاحتكاك ومساحيق المعادن مع الماء يتطلب رعاية خاصة للحد من التقصف السقالات تي. ^14،15

لذلك، وضعنا نهجا جديدا نحو افتعال السقالات تي مسامية النشطة بيولوجيا والانضباطي ميكانيكيا. ²⁵ والسقالات لها في البداية الهياكل التي يسهل اختراقها مع المسامية أكثر من 50٪. تم المغلفة السقالات التي يسهل اختراقها ملفقة مع الجزيئات النشطة بيولوجيا ومن ثم ضغطها باستخدام الصحافة الميكانيكية خلالها المسامية النهائية، كانت تسيطر عليها الخواص الميكانيكية والسلوك تحرر الدواء من قبل تطبيق صحيفةإد سلالة. وقد أظهرت يزرع تي مسامية مكثف المسامية منخفضة مع قوة جيدة على الرغم من صلابة منخفضة مماثلة لتلك التي من العظام (3-20 جيد جدا). ² لأن طبقة الطلاء، والنشاط الحيوي للمسامية تي مكثف وتحسنت بشكل ملحوظ. وعلاوة على ذلك، بسبب الهياكل المسام مسطحة الفريدة الناجمة عن عملية التكثيف، كان ينظر إلى الجزيئات النشطة بيولوجيا المغلفة ان يفرج عنها تدريجيا من السقالة، والحفاظ على فعاليتها لفترة طويلة.

في هذه الدراسة، قدمنا ​​أسلوبنا الذي أنشئ لافتعال مكثف السقالات تي مسامية لاستخدامها المحتمل في التطبيقات الطبية الحيوية. ويتضمن البروتوكول دينامية الصب تجميد مع عجائن المعدنية والتكثيف من السقالات التي يسهل اختراقها. أولا، لافتعال السقالات تي التي يسهل اختراقها مع ليونة جيدة تم إدخال ديناميكية طريقة التجميد الصب كما هو مبين في الشكل 1A. وقد فرقت مسحوق تي في الكمفين السائل. ثم، من خلال خفض درجة الحرارة،وقد عزز الطور السائل، مما أدى إلى فصل المرحلة بين شبكة مسحوق تي وبلورات الكمفين الصلبة. وفي وقت لاحق، ومتكلس الجسم الخضراء عزز تي الكمفين التي تم مكثف مساحيق تي تي مع الدعامات المستمرة، وتمت إزالة المرحلة الكمفين تماما للحصول على بنية مسامية. كان يعمل في طلاء وعملية التكثيف مع السقالات التي يسهل اختراقها الحصول عليها، تتفاوت درجة التكثيف والمسامية الأولية. وتصور طبقة الطلاء والسلوك صدوره وكميا باستخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المغلفة التي يسهل اختراقها تي مع وبدون التكثيف مقارنة كثيفة تي المغلفة GFP. وأخيرا، تم اقتراح متدرج وظيفيا السقالات تي التي لديها اثنين من الهياكل التي يسهل اختراقها مختلفة، وأثبتت من خلال تغيير درجة التكثيف من الأجزاء الداخلية والخارجية من السقالات التي يسهل اختراقها.

Protocol

1. تصنيع السقالات المعدنية المسامية

1. إعداد عجائن تي الكمفين عن طريق خلط مسحوق تي المتاحة تجاريا، الكمفين، وKD-4 بعد الموازنة بين كميات مناسبة من المواد كما هو موضح في الجدول رقم 1 لالسقالات تي التي يسهل اختراقها مع أربعة المساميات الأولية (40، 50، 60، و 70). صب عجائن إلى 500 مل البولي إثيلين (PE) زجاجات وتدوير الزجاجات على 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في فرن الكرة مطحنة في 30 دورة في الدقيقة.
2. صب عجائن من زجاجات PE إلى الألومنيوم أسطواني (آل) قوالب التي يبلغ قطرها 60 ملم وارتفاعه 60 ملم. ختم كل قالب آل مع ما يوازيها من آل زلة تغطية وتدوير القوالب في فرن الكرة مطحنة بسرعة 30 دورة في الدقيقة في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   1. وفي وقت لاحق، وانخفاض درجة حرارة الفرن الكرة مطحنة إلى 44 درجة مئوية، وبشكل مستمر تدوير قوالب بسرعة 30 دورة في الدقيقة في درجة حرارة ثابتة من 44 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
3. إخراج القالب من ball-مطحنة الفرن بعد بالإضافة إلى الدورية للقوالب في RT لمدة 1 ساعة لعملية التبريد. إزالة التيتانيوم / الكمفين الجسم الأخضر طدت من العفن آل باستخدام المكبس آل.
4. ضع التيتانيوم / الكمفين الجسم الأخضر طدت في كيس من المطاط من جهة، وختم تماما حقيبة المطاط من خلال ربط مصب حقيبة مع سلسلة. وضع كيس من المطاط في خزان مياه باردة المتوازنة التضاغط قولبة على (CIP) آلة وتطبيق الضغط المتوازنة التضاغط من 200 ميجا باسكال لمدة 10 دقيقة. إزالة الجسم الأخضر مضغوط من الكيس المطاط.
5. نقل الجسم الأخضر تي الكمفين الدخول إلى بوتقة الألومينا من جهة، ووضع البوتقة في الجهاز مجفف التجميد. تجميد تجفيف الجسم الأخضر لتسامى المرحلة الكمفين في الجسم الأخضر في - 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
6. وفي وقت لاحق، أغلق بوتقة مع زلة تغطية الألومينا ووضع بوتقة مغلقة في فرن فراغ (أقل من 10 ^-6 عربة) في RT. ثم، وزيادة درجة حرارة الفرن إلى 1300 درجة مئوية في ص التدفئةأكلت من 5 ° C / دقيقة مع الاستمرار على درجة حرارة 1300 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
7. بعد المعالجة الحرارية، والحفاظ على مسامية تي متكلس في الفرن لمدة 6-7 ساعة حتى يتم تبريد الفرن تماما RT.
   ملاحظة: خلال 6 ساعات من عملية التبريد، فإن متوسط ​​معدل التبريد من الفرن فوق 400 ° C هو ~ 15 ° C / دقيقة ومتوسط ​​معدل التبريد من الفرن أقل من 400 ° C هو 2 ~ ° C / دقيقة.
8. إذا لزم الأمر، وقطع كتلة من متكلس مسامية تي في عينات على شكل قرص بقطر 16 مم من خلال تشكيل التفريغ الكهربائي (EDM). ²⁷
   ملاحظة: اعتمادا على حجم قوالب القاعدة، حجم المسامية تي متكلس يحتاج إلى تعديل من خلال عملية تشكيل (الشكل 2A).
9. وضع دورق زجاجي مع العينات تي مسامية في الأوتوكلاف وتعقيم العينات عند درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة عينات من الأوتوكلاف. غسل العينات تي المسامية بالماء المقطر مرتين ثم مع 70٪ من الإيثانول مرتين.وأخيرا، وترك تي مسامية في طبق بتري والهواء الجاف العينات في RT على مقاعد البدلاء النظيفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

2. تراجع طلاء من السقالات مع وكلاء الحيويه

1. تمييع التجاري الأخضر الإسفار البروتين (GFP) من 1 ملغ / مل إلى 100 ميكروغرام / مل في مقعد نظيفة عن طريق خلط 1 مل من GFP مع 9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (DPBS، ودرجة الحموضة 7.4) حل Dulbecco لفي 10 مل تعقيمها البوليسترين (PS) أنبوب كما هو مبين في الجدول 1.
2. تزج تي الكثيفة أو التي يسهل اختراقها تعقيمها في 10 مل من محلول GFP المخفف (100 ميكروغرام / مل) عن طريق وضع العينات تي في أنبوب PS مع الحل GFP في RT ووضع على مقعد نظيفة.
3. وضع أنبوب PS في مجفف فراغ وإجلاء المجفف لمدة 10 دقيقة لضمان حل GFP تخترق مسام تي مسامية على نحو أكثر فعالية.
4. إزالة التيتانيوم التي يسهل اختراقها من الأنبوب PS باستخدام الملقط. وضع المغلفة GFP مسامية تي في 10 سم القطر بيطبق الثلاثية والهواء الجاف O / N في RT على مقاعد البدلاء النظيفة.
5. شطف تي يسهل اختراقها مرتين مع 10 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) في كوب من الزجاج، ونقل تي مسامية إلى 10 سم القطر طبق بتري باستخدام الملقط والهواء الجاف في RT على مقاعد البدلاء النظيفة.

3. التكثيف من المسامية السقالات

1. وضع مسامية عينات المغلفة GFP تي مع ارتفاعات مختلفة في يموت الصلب أسطواني، وإدراج مجموعة من اللكمات في الثقوب العلوية والسفلية من يموت الصلب (الشكل 3A).
2. ضغط تي مسامية داخل الجمعية الصلب يموت في RT في اتجاه z من العينة (الشكل 3A) باستخدام آلة الصحافة في معدلات الإجهاد وسيطة من 0.05 ~ 0.1 ثانية ^-1 ضد سلالات تطبيقها مسبقا هو مبين في الجدول 2. امسك الضغط لمدة 1 دقيقة قبل التفريغ.
3. إزالة عينات تي مكثف من يموت الصلب. غسل العينات مكثف مرتين مع 10 مل من DPBSفي كوب وO-الهواء الجاف / N في RT على مقاعد البدلاء النظيفة.

4. الإصدار اختبار السقالات المغلفة GFP

1. تزج ثلاثة أنواع من العينات (المغلفة GFP كثيفة تي (بعد خطوات 2)، المغلفة GFP مسامية تي (بعد الخطوتين 1 و 2) والمغلفة GFP مكثف مسامية تي (بعد الخطوات 1-3)) في 5 مل DPBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) الحل الوارد في 10 مل تعقيم أنبوب PS عند 37 درجة مئوية على مقاعد البدلاء النظيفة.
2. شفط خارج كل حل DPBS من كل أنبوب PS مع عينة المغلفة GFP وتجديد بمحلول 5 مل جديدة DPBS (7.4 درجة الحموضة) باستخدام ماصة وفقا لمرات محددة سلفا من 1، 2، 3، 5، 8، 12، 15 و 22 و 29 يوما بعد الغمر.
3. أخذ الصور مضان من العينات المغلفة GFP قبل الغمر (يوم 0) وبعد 22 يوما الغمر باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر الطيفي (CLSM).
4. قياس كثافة إشارة مضان من GFP صدر في 1 مل من محلول من إجمالي 5 مل من محلول DPBS استخلاصها من كل أنبوب PS في القسم 4.2 استخدامالتحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي 215 نانومتر ل. تحويل قيمة كثافة في تركيز المحلول GFP باستخدام المنحنى القياسي.
   ملاحظة: قبل قياس، رسم المنحنى القياسي من حل GFP عن طريق قياس كثافة مضان إشارة من الحل GFP في نطاق تركيز 0 نانوغرام / مل - 10 ميكروغرام / مل.

5. تصنيع متدرج المسامية تي السقالات

1. إنتاج كتلة من مسامية تي متكلس بتكرار الخطوة 1.1 إلى الخطوة 1.7.
2. آلة الملبدة التي يسهل اختراقها كتلة تي وفقا لتصاميم بنية محددة مسبقا (على سبيل المثال، 5A الشكل و5D) من خلال التنظيم الإداري.
3. وضع العينات تي تشكيله مع ارتفاع في توزيع يموت الصلب حيث القطر من مسامية تي هو ~ 0.1 ملم أصغر من قطر يموت وإدراج مجموعة من اللكمات في الثقوب العلوية والسفلية من يموت الصلب.
4. تنفيذ الخطوات 3.2 و 3.3.

6. المسامية عنيasurement من تي السقالات

1. قياس الكتلة (م _{ق) من} السقالات تي.
2. حساب حجم واضح (V _{ق) عن طريق} قياس طول وعرض وارتفاع السقالات تي.
3. حساب المسامية باستخدام المعادلة التالية:
   
   حيث P هي نسبة المسامية الكلية، ρ _تي هي الكثافة النظرية من التيتانيوم وم _S / V _S هو الكثافة المقاسة من العينة.
   ملاحظة: المسامية لعينات تي يمكن استرجاعها مباشرة من الصور microCT بعد إجراء التصوير microCT خارج باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الماسح الضوئي الصغير.

النتائج

ويتضح من عملية التصنيع المستخدمة لإنتاج السقالات تي مسامية في الشكل 1A. يتم الاحتفاظ فرقت مسحوق متجانس تي في الكمفين بالتناوب المستمر للحاويات في 44 درجة مئوية لمدة 12 ساعة و، في حين عزز الكمفين السائل تماما، أي رواسب من مسحوق تي ثقيل نسبيا يمكن التقل?...

Discussion

في حين نظم biometal استخدمت على نطاق واسع لالتطبيقات الطبية الحيوية، وخاصة، والمواد الحاملة، وصلابة عالية والنشاط الحيوي منخفض من المعادن تم اعتبار تحديات كبيرة. في هذه الدراسة، أنشأنا طريقة تصنيع نظام المعدن الجديد، وهو مكثف سقالة معدنية مسامية الذي له خصائص الميكاني...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titanium powder	Alfa Aesar	#42624	-325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Welgene	ML 008-01	­
Green Fluorescent Protein (GFP)	Genoss Co.	-	>98% purity, 1mg/ml
Ball mill oven	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
Freeze dryer	Ilshin Lab.	PVTFD50A	­
Cold isostatic pressing (CIP) machine	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
Vaccum furnace	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
electical chaege machine	FANUC robocut	0iB	External use
Press machine	CG&S	AJP-200	­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	External use