המצאה של מכאני מתכוונן ויו מתכת פיגומים עבור יישומים ביו

Summary

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Abstract

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Introduction

בעוד בביו-חומרים מתכתיים היה בשימוש נרחב כשתלי עומס נושאות והתקני קיבוע פנימיים בגלל כוחם המעולה המכני והעמידות, ^1-3 הם כרוכים שני אתגרים קריטיים: 1) חוסר התאמה מכאנית כי מתכות הן הרבה יותר נוקשה מאשר רקמות ביולוגיות, גרימת נזקים בלתי רצויים לרקמות הסובבות ו- 2) הפעילות הביולוגית נמוכה שלעתים קרובות תוצאות ממשק עני עם רקמות ביולוגיות, לעתים קרובות עוררו תגובות גוף זר (למשל, דלקת או פקקת). ^4-6 פיגומי מתכת נקבוביים הוצעו לקדם ingrowth עצם במבנים, שיפור . קשר עצם שתל תוך השפעות מגן מתח מדוכאות בגלל הקשיחות מופחתת שלהם ^7-9 יתר על כן, שינויי משטח שונים יושמו כדי לשפר את הפעילות הביולוגית של שתלים מתכתיים; שינויים כאלה כוללים ציפוי משטח המתכת עם מולקולות ביו (למשל, FAC הצמיחהtors) או תרופות (למשל, vancomycin, טטרציקלין). ^10-12 עם זאת, בעיות כגון תכונות מכאניות מופחתות של פיגומי מתכת נקבוביים, ירידה בנוקשות והשחרור המהיר של שכבות הציפוי ביו נותרו לא פתורות. ^13-16

סגסוגות בפרט, טיטניום (TI) וטי הן אחת ממערכות biometal הפופולריות ביותר בגלל תכונותיהם מכאניות מעולות, היציבות כימית, והתאמה ביולוגית טובה. ^13,17-19 גם היישומים בצורת קצפם משכו עניין גוברת מפני 3D רשתות נקבוביות לקדם ingrowth עצם בנוסף לתכונות מכאניות כמו עצם. ^20-22 נעשו מאמצים כדי לשפר את התכונות מכאניות על ידי פיתוח שיטות ייצור חדשים, כוללים שכפול של ספוג פולימרים, sintering של חלקיקי מתכת, אב טיפוס ודגמי שיטה (RP), ו שיטת בעל שטח על מנת לשלוט בתכונות השונות של הנקבוביות (למשל, חלק נקבובית,צורה, גודל, הפצה, וקישוריות) וחומר נכסים (למשל, שלב וטומאה מתכתיים). ^23-25 ​​לאחרונה, ליהוק ההקפאה של תרחיף מתכת על בסיס מים זכו לתשומת לב רבה כדי לייצר צורות Ti משופרות מכאני עם נקבוביות מיושרות היטב מבנים על ידי ניצול צמיחת דנדריט קרח חד כיווני במהלך התמצקות; עם זאת, זיהום חמצן נגרמים על ידי מגע של אבקות מתכת עם מים דורש טיפול מיוחד כדי למזער embrittlement של פיגומי Ti. ^14,15

לכן, פיתחנו גישה חדשה לבודת פיגומי Ti נקבוביים ביו ומכאני מתכונן. תחילה יש ²⁵ הפיגומים מבנים נקבוביים עם נקבוביות של יותר מ -50%. הפיגומים נקבוביים המפוברק היו מצופים במולקולות ביו ולאחר מכן דחוס באמצעות עיתונות מכאנית שבמהלכו הנקבוביות הסופי, תכונות מכאניות ושחרור תרופת התנהגות היו בשליטת appliזן ed. שתלי Ti נקבוביים densified הראו נקבוביות נמוך עם כוח טוב למרות הקשיחות הנמוכה דומה לזה של עצם (3-20 GPA). ² בגלל שכבת הציפוי, הפעילות הביולוגית של Ti הנקבובי densified השתפרה באופן משמעותי. יתר על כן, בגלל המבנים הנקבוביות שטוחים הייחודיים הנגרמים על ידי תהליך הציפוף, המולקולות ביו המצופה נראו להשתחרר בהדרגה מהפיגום, שמירה על יעילותם לתקופה ממושכת.

במחקר זה, הצגנו שיטה הוקמה לפברק פיגומי Ti נקבוביים densified לשימוש פוטנציאלי ביישומים ביו-רפואיים. הפרוטוקול כולל ליהוק הקפאה דינמי עם slurries מתכת וציפוף של פיגומים נקבוביים. ראשית, לפברק פיגומי Ti נקבוביים עם משיכות טובות שיטת יציקת הקפאה הדינמית הוצגה כפי שמוצגת באיור 1 א. אבקת Ti פוזרה בcamphene הנוזלי; לאחר מכן, על ידי הפחתת הטמפרטורה,השלב הנוזלי היה הקרושה, וכתוצאה מכך ההפרדה בין שלב רשת אבקת טי וגבישי camphene מוצקים. בהמשך לכך, הגוף הירוק טי-camphene התגבש היה sintered בי אבקות Ti היו מרוכזים עם תמוכות Ti רציפות, ושלב camphene הוסר לחלוטין כדי להשיג מבנה נקבובי. הציפוי ותהליך הציפוף עם הפיגומים נקבוביים הושגו הועסקו, משתנים מידת הציפוף ונקבובי ראשוניים. שכבת הציפוי ו התנהגות השחרור היו דמיינו ולכמת באמצעות החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) -coated Ti הנקבובי עם ובלי ציפוף לעומת Ti הצפוף מצופה GFP. לבסוף, פיגומי Ti מדורגים פונקציונלי שיש שני מבנים נקבוביים שונים הוצעו והפגינו על ידי שינוי מידת הציפוף של החלקים הפנימיים וחיצוניים של הפיגומים נקבוביים.

Protocol

1. ייצור של פיגומים מתכת נקבוביות

1. הכן slurries טי-ידי ערבוב אבקת camphene זמינה מסחרי Ti, camphene, וKD-4 לאחר שקילת הכמויות המתאימות של חומרים כמתואר בטבלה 1 לפיגומי Ti נקבוביים עם ארבע porosities הראשוני (40, 50, 60, ו -70). יוצקים את slurries לבקבוקי 500 מיליליטר פוליאתילן (PE) ולסובב את הבקבוקים על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שכדור-טחנה ליום 30 בסל"ד.
2. יוצקים את slurries מבקבוקי PE לאלומיניום גלילי (אל) תבניות בקוטר של 60 מ"מ וגובה של 60 מ"מ. לאטום כל עובש אל עם להחליק את המכסה המתאים אל ולסובב את התבניות בתנור כדור-טחנה במהירות של 30 סל"ד ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   1. בהמשך לכך, להקטין את הטמפרטורה של תנור כדור-הטחנה עד 44 מעלות צלזיוס, וברציפות לסובב את התבניות במהירות של 30 סל"ד בטמפרטורה הקבועה של 44 מעלות צלזיוס במשך שעה 12.
3. להוציא את התבנית מהכדוריתטחנת תנור לאחר בנוסף מסתובבת התבניות ב RT עבור שעה 1 לתהליך הקירור. הסר את הגוף הירוק טיטניום / camphene הקרושה מעובש אל באמצעות בוכנת אל.
4. הנח את הגוף הירוק טיטניום / camphene הקרושה בשקית גומי ביד ולאטום את שקית הגומי לחלוטין על ידי קשירת הפה של השקית עם מחרוזת. מניחים את שקית הגומי במכל המים של מכונה קרה isostatic קשה (CIP) ולהחיל לחץ isostatic של 200 MPa במשך 10 דקות. הסר את הגוף הירוק הדחוס משקית הגומי.
5. העבר את הגוף הירוק טי-camphene לכור היתוך אלומינה ביד ומניח את כור ההיתוך במכונה הקפאת המייבש. להקפיא-לייבש את הגוף הירוק לעדן שלב camphene בגוף הירוק ב-- 40 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
6. בהמשך לכך, לסגור את כור ההיתוך עם להחליק את מכסה אלומיניום ומניח את כור ההיתוך הסגור בתנור ואקום (להלן 10 ^-6 Torr) ב RT. לאחר מכן, להעלות את הטמפרטורה של התנור ל1,300 מעלות צלזיוס בr חימוםאכלתי 5 מעלות צלזיוס / דקה ולהחזיק את הטמפרטורה ב1,300 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
7. לאחר הטיפול בחום, לשמור Ti הנקבובי sintered בכבשן ל6-7 שעות עד התנור הוא מקורר באופן מלא לRT.
   הערה: במהלך 6 שעות של תהליך הקירור, השיעור הממוצע של קירור התנור מעל 400 מעלות צלזיוס הוא ~ 15 ° C / דקות והשיעור הממוצע של קירור התנור מתחת 400 ° C היא ~ 2 מעלות צלזיוס / דקה.
8. במידת צורך, לחתוך את הבלוק של טי הנקבובי sintered לדגימות בצורת דיסק בקוטר של 16 מ"מ דרך עיבוד פריקה חשמלית (EDM). ²⁷
   הערה: בהתאם לגודל של תבניות אל, בגודל של Ti הנקבובי sintered צריך להיות שונה בתהליך העיבוד (איור 2 א).
9. מניחים כוס זכוכית עם דגימות Ti נקבוביות בחיטוי ולעקר את הדגימות ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הסר את הדגימות מהחיטוי. שטוף את דגימות Ti נקבוביות במים מזוקקים פעמיים ולאחר מכן עם 70% אתנול פעמיים.לבסוף, לעזוב את Ti הנקבובי לתוך צלחת פטרי ואוויר יבש הדגימות ב RT על ספסל נקי תחת אור UV.

2. טובלים ציפוי של פיגומים עם סוכנים ביו

1. לדלל את החלבון ירוק הקרינה המסחרית (GFP) מ1 מ"ג / מיליליטר ל -100 מיקרוגרם / מיליליטר בספסל נקי על ידי ערבוב 1 מיליליטר של GFP עם 9 מיליליטר של הפתרון של Dulbecco בופר פוספט (DPBS, pH 7.4) ב- 10 מעוקר מ"ל קלקר צינור (PS) כפי שצוין בטבלה 1.
2. לטבול את Ti הצפוף או נקבובי המעוקרים ב 10 מיליליטר של תמיסה מדוללת GFP (100 מיקרוגרם / מיליליטר) על ידי הצבת דגימות Ti לתוך צינור PS עם פתרון ה- GFP ב RT והצבה על ספסל נקי.
3. מניחים את צינור PS בייבוש ואקום ולפנות את תא ייבוש במשך 10 דקות על מנת להבטיח את פתרון ה- GFP חודר את הנקבוביות של Ti הנקבובי בצורה יעילה יותר.
4. הסר את טיטניום הנקבובי מצינור PS באמצעות פינצטה. מניחים את Ti הנקבובי מצופה GFP לקוטר 10 סנטימטרים Peצלחת תלת ואוויר יבש O / N ב RT על ספסל נקי.
5. יש לשטוף את Ti הנקבובי פעמיים עם 10 מיליליטר של בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) בכוס זכוכית, ולהעביר את Ti הנקבובי לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים באמצעות פינצטה ואוויר יבש ב RT על ספסל נקי.

3. ציפוף של פיגומים נקבוביים

1. מניחים את דגימות Ti נקבוביות מצופה GFP עם גבהים שונים בקוביית פלדה גלילית, והכנס את סט של אגרופים לתוך החורים העליונים ותחתונים של קוביית הפלדה (איור 3 א).
2. לדחוס Ti הנקבובי בתוך ההרכבה למות פלדה ב RT בכיוון z של המדגם (איור 3 א) באמצעות מכונה עיתונות בשיעורי זן ביניים של 0.05 ~ 0.1 שניות ^-1 נגד קבוע מראש הזנים מיושמים מוצגים בטבלה 2. החזק את הלחץ 1 דקות לפני הפריקה.
3. הסר את דגימות Ti densified מלמות הפלדה. שטוף את דגימות densified פעמיים עם 10 מיליליטר של DPBSבכוס וO האוויר יבש / N ב RT על ספסל נקי.

מבחן שחרור 4. פיגומים מצופים GFP

1. לטבול את שלושה סוגים של דגימות (מצופה GFP צפוף Ti (לאחר שלבי 2), מצופה GFP-נקבובי Ti (לאחר שלבי 1 ו -2) ומצופה GFP densified הנקבובי Ti (לאחר צעדי 1-3)) ב 5 מיליליטר DPBS (pH 7.4) פתרון כלול בצינור PS מעוקר 10 מיליליטר ב 37 ° C על ספסל נקי.
2. יניקה את כל פתרון DPBS מצינור אחד PS עם המדגם מצופה GFP ולחדש עם פתרון DPBS 5 מיליליטר חדש (pH 7.4) בעזרת פיפטה לפי הזמנים שנקבעו מראש של 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 ו -29 ימים לאחר טבילה.
3. קח את תמונות הקרינה של הדגימות מצופים GFP לפני טבילה (יום 0) ואחרי 22 יום הטבילה באמצעות ספקטרוסקופיה סריקת לייזר confocal (CLSM).
4. למדוד את עוצמת אות הקרינה של ה- GFP שוחרר בפתרון 1 מיליליטר מהסכום כולל של 5 מיליליטר פתרון DPBS נמשך מצינור אחד PS בסעיף 4.2 באמצעותספקטרוסקופיה UV באורך גל של 215 ננומטר. להמיר את ערך העצמה לריכוז של פתרון ה- GFP באמצעות העקומה סטנדרטית.
   הערה: לפני המדידה, לצייר העקומה סטנדרטית של פתרון ה- GFP על ידי מדידת עוצמת אות הקרינה של פתרון ה- GFP בטווח הריכוז של 0 ng / ml - 10 מיקרוגרם / מיליליטר.

5. המצאה של מדורגים פיגומים Ti נקבוביים

1. לייצר בלוק של Ti הנקבובי sintered על ידי חזרה על שלב 1.1 לשלב 1.7.
2. מכונת בלוק Ti הנקבובי sintered לפי העיצובים שנקבעו מראש מבנה (למשל, הציור 5a ו5D) על ידי EDM.
3. מניחים את דגימות Ti במכונה עם הפצת גובה בקוביית פלדה שבו הקוטר של טי הנקבובי הוא ~ 0.1 מ"מ קטן יותר מאשר הקוטר של הקובייה והכנס סט של אגרופים לתוך החורים העליונים ותחתונים של קוביית הפלדה.
4. בצע את השלבים 3.2 ו -3.3.

6. הנקבוביasurement של פיגומים Ti

1. למדוד את המסה (מ _'ים) של פיגומי Ti.
2. חשב את הנפח לכאורה (V _ים) על ידי מדידת אורך, רוחב וגובה של פיגומי Ti.
3. לחשב את נקבוביות באמצעות המשוואה הבאה:
   
   כאשר P הוא מוחלט אחוז הנקבוביות, ρ _Ti הוא הצפיפות התיאורטית של _S טיטניום והמטר / V _S הוא הצפיפות המדודה של המדגם.
   הערה: הנקבוביות של דגימות Ti יכול להאסף ישירות מתמונות microCT לאחר ההדמיה microCT מתבצעת באמצעות סורק טומוגרפיה-מחושב מיקרו.

תוצאות

תהליך הייצור המשמש לייצור פיגומי Ti נקבוביים מתואר באיור 1 א. אבקת TI היא המשיכה מפוזרת בצורה הומוגנית בcamphene ידי סיבוב מתמשך של המכל על 44 מעלות צלזיוס במשך שעה 12 ו, בעוד camphene הנוזל התגבש באופן מלא, ניתן למזער כל משקעים של אבקת Ti כבדה יחסית. כתוצאה מכך, הגוף הירוק ?...

Discussion

בעוד מערכות biometal היו בשימוש נרחב עבור יישומים ביו-רפואיים, במיוחד, כחומרי נושאות עומס, קשיחות גבוהה ופעילות ביולוגית נמוכה של מתכות כבר נחשב לאתגרים גדולים. במחקר זה, הקמנו את שיטת הייצור של מערכת מתכת חדשה, פיגום מתכת נקבובי densified שבו יש תכונות מכאניות biomimetic כמו גם מש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titanium powder	Alfa Aesar	#42624	-325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Welgene	ML 008-01	­
Green Fluorescent Protein (GFP)	Genoss Co.	-	>98% purity, 1mg/ml
Ball mill oven	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
Freeze dryer	Ilshin Lab.	PVTFD50A	­
Cold isostatic pressing (CIP) machine	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
Vaccum furnace	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
electical chaege machine	FANUC robocut	0iB	External use
Press machine	CG&S	AJP-200	­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	External use