Herstellung von mechanisch Tunable und Bioactive Metallgerüste für biomedizinische Anwendungen

Zusammenfassung

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Zusammenfassung

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Einleitung

Während metallische Biomaterialien wurden weithin als tragende Implantate und interne Fixationsvorrichtungen, aufgrund ihrer ausgezeichneten mechanischen Festigkeit und Widerstandskraft, ^1-3 verwendet sie beinhalten zwei kritischen Herausforderungen: 1) mechanische Fehlanpassung, weil Metalle sind viel steifer als biologisches Gewebe, was zu unerwünschten Schäden zu den umliegenden Geweben und 2) geringe Bioaktivität, die oft zu einer schlechten Oberfläche mit biologischen Geweben, oft provozieren Fremdkörperreaktionen (zB Entzündung oder Thrombose). ^4-6 porösen Metallgerüste vorgeschlagen worden, um das Einwachsen von Knochen in den Strukturen fördern, die Verbesserung . Knochen-Implantat-Kontakt, während die Spannungsabschirmung Effekte werden wegen ihrer geringeren Steifigkeit drückt ^7-9 Außerdem können verschiedene Oberflächenmodifikationen wurden angewandt, um die biologischen Aktivitäten von metallischen Implantaten zu verbessern; Solche Modifikationen schließen Beschichtung der Metalloberfläche mit bioaktiven Molekülen (zB Wachstums facToren) oder Arzneimitteln (zB, Vancomycin, Tetracyclin). ^10-12 jedoch Probleme wie reduzierte mechanische Eigenschaften der porösen Metallgerüste, verminderte Steifigkeit und die schnelle Freisetzung des biologisch aktiven Überzugsschichten ungelöst bleiben. ^13-16

Insbesondere Titan (Ti) und Ti-Legierungen sind eine der beliebtesten Biometall Systeme wegen ihrer ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften, chemische Stabilität und gute Biokompatibilität. ^13,17-19 Die schaumförmigen Anwendungen wurden zog auch zunehmendes Interesse, weil der 3D- poröse Netzwerke fördern das Einwachsen von Knochen neben knochenartige mechanische Eigenschaften. ^20-22 wurden Anstrengungen unternommen, um die mechanischen Eigenschaften durch die Entwicklung neuer Fertigungsverfahren, einschließlich Replikation polymerer Schwamm, Sintermetallpartikeln, Rapid Prototyping (RP) Verfahren zu verbessern, und Platzhalter Verfahren, um die verschiedenen Eigenschaften der Poren zu kontrollieren (zB Porenanteil,Form, Größe, Verteilung und Konnektivität) und Materialeigenschaften (zB metallische Phase und Verunreinigung). ^23-25 ​​Vor kurzem hat die Gefriert Gießen von Wasser basierende Metallschlamm beträchtliche Aufmerksamkeit mechanisch verstärkten Ti bildet mit gut ausgerichteten Poren produzieren gewonnen Strukturen durch Ausnutzung der unidirektionalen Eis Dendritenwachstum während der Erstarrung; jedoch Sauerstoffkontamination durch Kontakt von Metallpulvern mit Wasser verursacht erfordert besondere Sorgfalt, um die Versprödung des Ti Gerüsten zu minimieren. ^14,15

Daher haben wir einen neuen Ansatz zur Herstellung von bioaktiven und mechanisch abstimmbaren poröse Ti Gerüsten entwickelt. ^25. Die Gerüste anfänglich porösen Strukturen mit einer Porosität von mehr als 50%. Die hergestellten porösen Gerüste wurden mit bioaktiven Molekülen beschichtet und dann komprimiert unter Verwendung einer mechanischen Presse, in dem die Endporosität, mechanische Eigenschaften und Arzneimittelfreisetzungsverhaltens wurden vom Anmelder gesteuerteed-Stamm. Die verdichteten porösen Ti Implantate geringer Porosität mit guter Festigkeit trotz der geringen Steifigkeit vergleichbar mit der Knochen (3-20 GPa). ² Weil der Beschichtungsschicht gezeigt, wurde die Bioaktivität des verdichteten porösen Ti deutlich verbessert. Darüber hinaus kann aufgrund der einzigartigen Flachporenstrukturen durch das Verdichtungsverfahren induziert wurden die beschichteten biologisch aktiven Moleküle gesehen, allmählich vom Gerüst gelöst werden, die Aufrechterhaltung ihrer Wirksamkeit über einen längeren Zeitraum.

In dieser Studie haben wir unsere etablierten Methode, um verdichtete poröse Ti Gerüsten für die mögliche Verwendung in biomedizinischen Anwendungen herzustellen. Das Protokoll enthält dynamische Gefrierguss mit Metall Schlämmen und Verdichtung der porösen Gerüsten. Erstens, um poröse Ti Gerüsten mit guter Duktilität der dynamische gefrier Gießverfahren eingeführt wurde, wie in 1A gezeigt, herzustellen. Ti-Pulver wurde in flüssigem Camphen dispergiert sind; Dann wird durch Senken der Temperatur,die flüssige Phase verfestigt, was zur Phasentrennung zwischen dem Ti-Pulver Netzwerk und feste Camphen Kristallen. Anschließend wurde die verfestigte Ti-Camphen Grünkörper gesintert, in dem Ti-Pulver wurden mit kontinuierlicher Ti Streben kondensiert und das Camphen Phase wurde vollständig entfernt, um eine poröse Struktur zu erhalten. Die Beschichtungs- und Verdichtungsverfahren mit den erhaltenen porösen Gerüsten wurde eingesetzt, Variieren der Verdichtungsgrad und erste Porosität. Die Beschichtungsschicht und ihre Freisetzungsverhaltens wurden visualisiert und quantifiziert unter Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beschichteten porösen Ti mit oder ohne Verdichtung im Vergleich zu dem GFP-beschichteten dichten Ti. Schließlich wurden funktionsgradierter Ti Gerüsten, die zwei verschiedene poröse Strukturen vorgeschlagen und durch Variieren der Verdichtungsgrad der inneren und äußeren Teile der porösen Gerüsten demonstriert.

Protokoll

1. Herstellung von porösen Metallgerüste

1. Vorbereitung Ti-Camphen Schlämme durch Mischen von kommerziell erhältlichen Ti-Pulver, Camphen und KD-4 nach dem Abwiegen der geeigneten Mengen von Materialien, wie in Tabelle 1 für poröse Ti Gerüste mit vier anfänglichen Porositäten (40, 50, 60 und 70) beschrieben. Gießen der Aufschlämmungen in 500 ml-Polyethylen (PE-Flaschen) und drehen die Flaschen bei 55 ° C für 30 min in einer Kugelmühle Ofen bei 30 Umdrehungen pro Minute.
2. Gießen der Schlämme aus den PE-Flaschen in zylindrische Aluminium (Al) Formen mit einem Durchmesser von 60 mm und einer Höhe von 60 mm. Siegel Jede Al Form mit dem entsprechenden Al Deckglas, und drehen Sie die Formen in einer Kugelmühle Ofen bei einer Geschwindigkeit von 30 Umdrehungen pro Minute bei 55 ° C für 10 min.
   1. Anschließend senken die Temperatur der Kugelmühle Ofen auf 44 ° C und kontinuierliches Drehen der Formen bei einer Geschwindigkeit von 30 Umdrehungen pro Minute bei einer konstanten Temperatur von 44 ° C für 12 Std.
3. Nehmen Sie die Form aus dem KugelMühle Backofen, nachdem zusätzlich Drehen der Formen bei RT für 1 h für den Kühlprozess. Entfernen Sie die erstarrten Titan / Camphen Grünkörper aus dem Al Form unter Verwendung eines Al-Kolben.
4. Setzen Sie den erstarrten Titan / Camphen Grünkörper in einem Gummisack mit der Hand und der Gummisack vollständig abzudichten durch das Binden der Öffnung des Beutels mit einer Schnur. Legen Sie das Gummisack im Wassertank eines kaltisostatisches Pressen (CIP) Maschine und wenden einen isostatischen Druck von 200 MPa für 10 min. Entfernen Sie die Druckgrünkörper aus der Gummisack.
5. Übertragen Sie die Ti-Camphen Grünkörper auf einen Aluminiumoxid-Tiegel mit der Hand und legen Sie den Tiegel im Gefriertrockner Maschine. Gefrierzutrocknen des Grünkörpers, um das Camphen Phase in der Grünkörpers bei sublimieren - 40 ° C für 24 Stunden.
6. Anschließend schließen Sie den Tiegel mit einem Aluminiumoxiddeckglas und legen Sie die geschlossenen Tiegel in einem Vakuumofen (unter 10 ^{-6 Torr)} bei RT. Dann wird die Temperatur des Ofens auf 1300 ° C bei einer Erwärmungs raß von 5 ° C / min und halten Sie die Temperatur bei 1300 ° C für 2 Stunden.
7. Nach der Wärmebehandlung, halten den gesinterten porösen Ti in dem Ofen für 6-7 Stunden, bis der Ofen voll auf RT abgekühlt.
   Anmerkung: Während der 6 Stunden der Abkühlung ist die mittlere Abkühlungsgeschwindigkeit des Ofens oberhalb von 400 ° C ~ 15 ° C / min und die durchschnittliche Abkühlungsgeschwindigkeit des Ofens unter 400 ° C ~ 2 ° C / min.
8. Falls erforderlich, schneiden den Block aus gesintertem porösem Ti in scheibenförmige Proben mit einem Durchmesser von 16 mm durch elektrische Entladungsbearbeitung (EDM). ²⁷
   Hinweis: Je nach der Größe der Al Schimmelpilze, die Größe des gesinterten porösen Ti muss durch den Bearbeitungsprozess (2A) verändert werden.
9. Einen Glasbecher mit den porösen Ti-Proben in einem Autoklaven sterilisiert und die Proben bei 121 ° C für 15 min. Entfernen der Proben aus dem Autoklaven. Die poröse Ti-Proben mit destilliertem Wasser zweimal zweimal und dann waschen mit 70% Ethanol.Schließlich verlassen die poröse Ti in eine Petrischale und an der Luft trocknen die Proben bei RT auf einem Sterilbank unter UV-Licht.

2. Tauchbeschichtung von Gerüsten mit bioaktiven Mitteln

1. Verdünnen des kommerziellen Green Fluorescence Protein (GFP) von 1 mg / ml bis 100 ug / ml in einer Sterilwerkbank, indem 1 ml von GFP mit 9 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS, pH 7,4) Lösung in einem 10 ml-sterilisiert Polystyrol (PS) Rohr, wie in Tabelle 1 angegeben.
2. Tauchen Sie die sterilisiert dicht oder porös Ti in 10 ml verdünnt GFP-Lösung (100 ug / ml), indem Sie die Ti-Proben in das PS-Rohr mit dem GFP-Lösung bei RT und Unterbringung an einem Sterilbank.
3. Setzen Sie den PS Rohr im Vakuumtrockenschrank und evakuieren Exsikkator für 10 Minuten, um sicherzustellen, das GFP-Lösung effektiver dringt in die Poren des porösen Ti.
4. Entfernen Sie die porösem Titan aus der PS Rohr mit einer Pinzette. Legen Sie das GFP-beschichtete poröse Ti in eine 10 cm Durchmesser Petri Gericht und an der Luft trocknen O / N bei RT auf einem Sterilbank.
5. Spülen Sie die poröse Ti zweimal mit 10 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) in einem Becherglas, und verschieben Sie die poröse Ti zu einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit einer Pinzette und an der Luft trocknen bei Raumtemperatur auf eine saubere Bank.

3. Verdichtung von porösen Gerüsten

1. Legen Sie die GFP-beschichtete poröse Ti Proben mit verschiedenen Höhen in einem zylindrischen Stahlform, und legen Sie eine Reihe von Schlägen in die oberen und unteren Löcher der Stahlform (3A).
2. Komprimieren Sie die poröse Ti innerhalb des Stahlformanordnung bei RT in z-Richtung der Probe (3A) mit einer Pressmaschine bei mittleren Belastungsraten von 0,05 ~ 0,1 ^s -1 gegen die in Tabelle 2 gezeigten vorbestimmten angewendet Stämme. Halten Sie die Druck 1 min vor der Entladung.
3. Entfernen Sie die verdichtete Ti Proben aus der Stahlform. Zweimaliges Waschen der verdichteten Proben mit 10 ml DPBSin einem Becherglas und der Luft trocknen O / N bei RT auf einem Sterilbank.

4. Lassen Test von GFP beschichtet Gerüste

1. Tauchen drei Arten von Proben (GFP beschichteten dichten Ti (nach den Schritten 2), GFP-beschichtete poröse Ti (nach den Schritten 1 und 2) und GFP-beschichtete verdichtete poröse Ti (nach den Schritten 1-3)) in 5 ml DPBS (pH 7,4) Lösung in einem 10 ml sterilisiertem PS Rohr auf eine saubere Bank enthielt bei 37 ° C.
2. Absaugen aus ganze DPBS-Lösung von jedem PS Rohr mit dem GFP-beschichteten Probe und füllt mit einer neuen 5 ml DPBS-Lösung (pH 7,4) unter Verwendung einer Pipette gemäß den vorbestimmten Zeiten von 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 und 29 Tage nach der Immersion.
3. Nehmen Sie die Fluoreszenzbilder der GFP-beschichteten Proben vor dem Eintauchen (Tag 0) und nach 22 Tage-Tauch mit konfokalen Laser-Scanning-Spektroskopie (CLSM).
4. Messung der Fluoreszenzsignalintensität der GFP-Freigabe in 1 ml Lösung von insgesamt 5 ml DPBS-Lösung unter Verwendung von jeder PS Rohr in 4.2 gezeichnetUV-spektroskopisch bei einer Wellenlänge von 215 nm. Den Intensitätswert umzuwandeln in die Konzentration des GFP-Lösung unter Verwendung der Standardkurve.
   Anmerkung: Vor der Messung wird die Ziehung der Standardkurve für GFP Lösung durch Messen der Fluoreszenzsignalintensität der GFP-Lösung in einem Konzentrationsbereich von 0 ng / ml - 10 ug / ml.

5. Herstellung von Graded Porous Ti Gerüste

1. Erzeugen einen Block des gesinterten porösen Ti durch Wiederholen von Schritt 1.1 zu Schritt 1.7.
2. Maschine der gesinterte poröse Ti Block entsprechend der vorbestimmten Struktur-Designs (zB 5a und 5d), die durch EDM.
3. Platzieren der bearbeiteten Ti Proben mit Höhenverteilung in einer Stahlform, wo der Durchmesser des porösen Ti ~ 0,1 mm kleiner als der Durchmesser der Düse und legen eine Reihe von Schlägen in die oberen und unteren Löcher der Stahlform.
4. Führen Sie die Schritte 3.2 und 3.3.

6. Porosität Measurement Ti Gerüste

1. Messen Sie die Masse (m _{n) des} Ti Gerüsten.
2. Berechnung des scheinbaren Volumens (V _n) durch Messen der Länge, Breite und Höhe des Ti Gerüsten.
3. Berechnen der Porosität unter Verwendung der folgenden Gleichung:
   
   wobei P die Gesamtporosität Prozentsatz ρ _Ti beträgt die theoretische Dichte des Titans und m _{S /} V _{S die} gemessene Dichte der Probe.
   Anmerkung: Die Porosität Ti Proben können direkt von microCT Bildern abgerufen werden, nachdem microCT Bildgebung wird unter Verwendung eines Mikrocomputertomographen durchgeführt wird.

Ergebnisse

Der Herstellungsprozess, um poröse Ti Gerüsten verwendet wird in 1A dargestellt. Ti-Pulver gehalten wird homogen in Camphen durch kontinuierliche Drehung des Behälters bei 44 ° C 12 h lang dispergiert und während flüssige Camphen vollständig verfestigt ist, irgendwelche Sedimente des relativ schweren Ti Pulvers minimiert werden. Als Ergebnis wurde die homogene Ti-Camphen Grünkörpers unter Verwendung des dynamischen gefrierGussVerfahren hergestellt, wie in 1B gezeigt,

Diskussion

Während Biometall Systeme sind weit verbreitet für biomedizinische Anwendungen verwendet, insbesondere als tragende Materialien, hohe Steifigkeit und geringe Bioaktivität von Metallen haben große Herausforderungen betrachtet. In dieser Studie haben wir die Herstellungsverfahren für eine neue Metall-System, einer verdichteten porösen Metallgerüst, das biomimetische mechanischen Eigenschaften sowie bioaktive Oberfläche mit einer nachhaltigen Freisetzungsverhalten hat. Die Hauptvorteile der Herstellungsverfahren sc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titanium powder	Alfa Aesar	#42624	-325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Welgene	ML 008-01	­
Green Fluorescent Protein (GFP)	Genoss Co.	-	>98% purity, 1mg/ml
Ball mill oven	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
Freeze dryer	Ilshin Lab.	PVTFD50A	­
Cold isostatic pressing (CIP) machine	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
Vaccum furnace	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
electical chaege machine	FANUC robocut	0iB	External use
Press machine	CG&S	AJP-200	­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	External use