Fabricação de Mecanicamente Tunable e Bioativos metal andaimes para aplicações biomédicas

Resumo

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Resumo

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Introdução

Enquanto biomateriais metálicos têm sido amplamente utilizados como implantes de apoio de carga e dispositivos de fixação interna por causa da sua excelente resistência mecânica e elasticidade, ^1-3 envolvem dois desafios importantes: 1) incompatibilidade mecânico porque os metais são muito mais rígidos do que os tecidos biológicos, causando danos indesejáveis para os tecidos circundantes e 2) baixa bioactividade que muitas vezes resulta em fraca relação com os tecidos biológicos, muitas vezes provocam reacções de corpos estranhos (por exemplo, inflamação ou trombose). ^4-6 andaimes metálicos porosos têm sido propostos para promover o crescimento ósseo nas estruturas, melhorando . contacto osso-implante, enquanto os efeitos de stress de blindagem são suprimidos por causa da sua rigidez reduzida ^7-9 Além disso, várias modificações da superfície ter sido aplicada para melhorar as actividades biológicas dos implantes metálicos; tais modificações incluem revestimento de superfície do metal com moléculas bioactivas (por exemplo, crescimento FACres) ou fármacos (por exemplo, vancomicina, tetraciclina) ^10-12. No entanto, os problemas, tais como reduzidas propriedades mecânicas de andaimes de metal porosos, diminuição da rigidez e a libertação rápida das camadas de revestimento bioactivos continuam por resolver ^13-16.

Em particular, titânio (Ti) e Ti ligas são um dos sistemas Biometal mais populares por causa de suas excelentes propriedades mecânicas, estabilidade química, e boa biocompatibilidade. ^13,17-19 Suas aplicações em forma de espuma, também têm atraído crescente interesse porque o 3D redes porosas promover crescimento ósseo, além das propriedades mecânicas do osso semelhantes. ^20-22 Foram feitos esforços para melhorar as propriedades mecânicas através do desenvolvimento de novas técnicas de fabrico, incluindo a replicação de esponja polimérica, a sinterização de partículas de metal, de prototipagem rápida método (RP), e espaço método de suporte, a fim de controlar as várias características de poros (por exemplo, fracção de poros,forma, tamanho, distribuição e conectividade) e propriedades do material (por exemplo, fase metálica e de impurezas). ^23-25 ​​Recentemente, a fundição congelamento de lodo em metal à base de água tem ganhado considerável atenção para produzir aprimorados mecanicamente formas Ti com poros bem alinhados estruturas, utilizando o unidireccional crescimento dendrítico gelo durante a solidificação; no entanto, a contaminação de oxigênio causada pelo contato de pós metálicos com água requer cuidados especiais para minimizar a fragilização de andaimes Ti. ^14,15

Por isso, desenvolvemos uma nova abordagem para a fabricação de scaffolds bioativos Ti porosos e ajustáveis ​​mecanicamente. ²⁵ Os andaimes inicialmente têm estruturas porosas com uma porosidade de mais de 50%. As matrizes porosas fabricadas foram revestidas com moléculas bioactivas e depois comprimida utilizando uma prensa mecânica durante os quais a porosidade final, as propriedades mecânicas e comportamento de libertação do fármaco foi controlada pela aplied tensão. Os implantes porosos densificadas Ti demonstraram baixa porosidade com boa resistência, apesar da baixa rigidez comparável à do osso (3-20 GPa). ² Por causa da camada de revestimento, a bioactividade do densificada Ti poroso foi significativamente melhorada. Além disso, por causa das estruturas de poros planas originais induzidas pelo processo de densificação, as moléculas bioactivas revestidos foram vistos a ser gradualmente libertado a partir do andaime, mantendo a sua eficácia durante um período prolongado.

Neste estudo, nós introduzimos nosso método estabelecido para fabricar densificadas andaimes Ti porosas para uso potencial em aplicações biomédicas. O protocolo inclui fundição congelamento dinâmica com lamas e densificação de scaffolds porosos metálicos. Em primeiro lugar, para o fabrico de andaimes Ti porosas com boa ductilidade do método de fundição de congelação dinâmica foi introduzido como mostrado na Figura 1A. Ti em pó foi disperso em canfeno líquido; em seguida, pela diminuição da temperatura,a fase líquida foi solidificada, resultando na separação de fase entre a rede de Ti em pó e cristais sólidos canfeno. Subsequentemente, o corpo verde solidificou Ti-canfeno foi sinterizado no qual pós de Ti foram condensados ​​com escoras contínuas Ti, e a fase de canfeno foi completamente removido para se obter uma estrutura porosa. O revestimento e processo de densificação com as matrizes porosas obtidas foi utilizado, variando o grau de densificação e porosidade inicial. A camada de revestimento e o seu comportamento de libertação foram visualizadas e quantificadas utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) -Revestido poroso Ti com e sem densificação em comparação com a GFP denso revestido-Ti. Finalmente, andaimes Ti gradação funcional que têm duas estruturas porosas diferentes foram propostos e demonstrados através da variação do grau de densificação das partes internas e externas das matrizes porosas.

Protocolo

1. A fabricação de andaimes metálicos porosos

1. Prepare lamas Ti-canfeno por mistura em pó disponíveis comercialmente Ti, canfeno, e KD-4 depois de pesar as quantidades apropriadas de materiais como descrito na Tabela 1 para andaimes Ti porosos com porosidades quatro iniciais (40, 50, 60 e 70). Pour as suspensões em 500 ml de polietileno (PE) e rodar garrafas os frascos a 55 ° C durante 30 min num forno em moinho de bolas a 30 rpm.
2. Pour as lamas provenientes dos frascos de PE em alumínio cilíndrica (Al) moldes com um diâmetro de 60 mm e uma altura de 60 mm. Selar cada molde Al com a correspondente tampa de deslizamento Al e rodar os moldes numa estufa em moinho de bolas a uma velocidade de 30 rpm, a 55 ° C durante 10 min.
   1. Subsequentemente, diminuir a temperatura do forno em moinho de bolas a 44 ° C, e rodar continuamente os moldes a uma velocidade de 30 rpm, à temperatura constante de 44 ° C durante 12 h.
3. Retire o molde da bola-moinho de forno rotativo depois adicionalmente os moldes à temperatura ambiente durante 1 h durante o processo de arrefecimento. Retire o corpo verde de titânio / camphene solidificado do molde Al usando um êmbolo Al.
4. Coloque o corpo verde de titânio / camphene solidificado em uma bolsa de borracha à mão e selar completamente o saco de borracha, amarrando a boca do saco com uma corda. Coloque o saco de borracha no reservatório de água de uma pressionando (CIP) máquina de frio isostática e aplicar uma pressão isostática de 200 MPa para 10 min. Retire o corpo verde comprimido do saco de borracha.
5. Transferir o corpo verde Ti-camphene para um cadinho de alumina com a mão e coloque o cadinho no congelar-máquina de secar roupa. Liofilizar o corpo verde para sublimar a fase canfeno no corpo verde a - 40 ° C durante 24 h.
6. Subsequentemente, fechar o cadinho com uma lamela de cobertura de alumina e colocar o cadinho fechado numa fornalha de vácuo (abaixo de 10 Torr ^-6) à TA. Em seguida, aumentar a temperatura do forno para 1300 ° C a uma r aquecimentoComeram de 5 ° C / min e manter a temperatura a 1300 ° C durante 2 horas.
7. Após o tratamento térmico, manter o sinterizado poroso Ti no forno durante 6-7 horas até que o forno é inteiramente arrefecida até à temperatura ambiente.
   Nota: Durante 6 horas do processo de arrefecimento, a taxa média de arrefecimento do forno acima de 400 ° C é de ~ 15 ° C / min e a velocidade média de arrefecimento do forno abaixo de 400 ° C é de ~ 2 ° C / min.
8. Se necessário, cortar o bloco de Ti sinterizado poroso em amostras em forma de disco com um diâmetro de 16 mm por meio de usinagem descarga elétrica (EDM). ²⁷
   Nota: Dependendo do tamanho dos moldes de Al, o tamanho do sinterizado poroso Ti precisa ser modificado através do processo de maquinação (Figura 2A).
9. Coloque um copo de vidro com as amostras porosas Ti num autoclave e esterilizar as amostras a 121 ° C durante 15 min. Retirar as amostras do autoclave. Lavam-se as amostras porosas de Ti com água destilada duas vezes e em seguida com etanol a 70% duas vezes.Finalmente, deixe a Ti porosa em uma placa de Petri e deixe secar as amostras em temperatura ambiente em um banco limpo sob luz UV.

2. Dip Coating de andaimes com agentes bioactivos

1. Dilui-se a comercial Fluorescência verde Protein (GFP) a partir de 1 mg / ml a 100 ug / ml em um banco limpo por mistura de 1 ml de GFP com 9 ml de solução de Dulbecco Tamponado com Fosfato Salino (DPBS, pH 7,4) em um 10-esterilizado ml poliestireno (PS) do tubo, tal como indicado na Tabela 1.
2. Mergulha-se o esterilizado Ti densos ou porosos em 10 ml de solução diluída de GFP (100 ug / ml), colocando as amostras TI PS para dentro do tubo com a solução de GFP à TA e colocação num bancada limpa.
3. Colocar o tubo de PS num exsicador de vácuo e evacuar o exsicador durante 10 minutos para assegurar que a solução de GFP penetra nos poros do Ti poroso de forma mais eficaz.
4. Remover o titânio poroso a partir do tubo de PS utilizando pinças. Coloque a revestido poroso Ti-GFP em 10 cm de diâmetro Peprato tri e ar seco O / N à temperatura ambiente em um banco limpo.
5. Lavar o Ti poroso duas vezes com 10 ml de Dulbecco Tamponado com Fosfato Salino (DPBS) num copo de vidro, e mover o Ti poroso numa placa de Petri de diâmetro de 10 cm, usando uma pinça e ar seco, à temperatura ambiente numa bancada limpa.

3. Adensamento da porosas Andaimes

1. Coloque as amostras TI-GFP porosos revestidos com várias alturas numa matriz de aço cilíndrica, e inserir um conjunto de punções para os orifícios superior e inferior do molde de aço (Figura 3A).
2. Comprimir a Ti poroso no interior do conjunto de matriz de aço, à TA na direcção z da amostra (Figura 3A), utilizando uma máquina de prensa em taxas de deformação intermédios de 0,05 ~ 0,1 seg ^-1 contra as estirpes aplicadas predeterminados mostrados na Tabela 2. Mantenha a pressão para 1 min antes da descarga.
3. Retirar as amostras Ti densificadas da matriz de aço. Lavam-se as amostras duas vezes densificadas com 10 ml de DPBSnuma proveta e O ar seco / N à TA numa bancada limpa.

4. Teste de lançamento de Andaimes revestido de GFP

1. Imergir três tipos de amostras (revestido-GFP densa Ti (após os passos 2), revestida GFP-porosa Ti (após os passos 1 e 2) e revestido-GFP densificada poroso Ti (após os passos 1-3)) em 5 mL de DPBS (pH 7,4) solução contida em um tubo de 10 ml esterilizado PS a 37 ° C numa bancada limpa.
2. Sucção para fora toda a solução de DPBS de cada tubo PS com a amostra revestida de GFP e reabastecer com uma solução de DPBS novos 5 ml (pH 7,4) utilizando uma pipeta de acordo com os tempos pré-determinados de 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 e 29 dias após a imersão.
3. Aqui as imagens de fluorescência das amostras revestidas de GFP antes da imersão (dia 0) e depois de 22 dias de imersão utilizando espectroscopia confocal de varrimento laser (CLSM).
4. Medir a intensidade de sinal de fluorescência da GFP libertado em 1 ml de solução a partir de um total de 5 ml de solução de DPBS retirada de cada tubo de PS na secção 4.2 usandoEspectroscopia de UV a um comprimento de onda de 215 nm. Converter o valor de intensidade para a concentração da solução de GFP usando a curva padrão.
   Nota: Antes da medição, desenhar a curva padrão de uma solução de GFP através da medição da intensidade do sinal de fluorescência da GFP em solução no intervalo de concentração de 0 ng / mL - 10 ng / ml.

5. Fabricação de Graded porosas Ti Andaimes

1. Produzir um bloco do sinterizado Ti poroso repetindo o passo 1.1 para o passo 1.7.
2. Máquina do bloco Ti poroso sinterizado de acordo com os modelos de estrutura pré-determinados (por exemplo, a Figura 5A e 5d) por EDM.
3. Coloque as amostras maquinadas Ti com distribuição altura numa matriz de aço em que o diâmetro poroso de Ti é ~ 0,1 mm menor que o diâmetro do molde e inserir um conjunto de punções para os orifícios superior e inferior da matriz de aço.
4. Realize os passos 3.2 e 3.3.

6. A porosidade Measurement de Ti Andaimes

1. Medir a massa _(M s) de andaimes Ti.
2. Calcular o volume aparente (V _s) pela medição de comprimento, largura e altura de andaimes Ti.
3. Calcular a porosidade usando a seguinte equação:
   
   onde P é a percentagem total de porosidade, ρ _{Ti é} a densidade teórica do titânio e m _S / V _{S é a} densidade medida da amostra.
   Nota: A porosidade de amostras TI podem ser directamente recuperados a partir de imagens microCT após microCT imagiologia é efectuada utilizando um scanner de tomografia computadorizada de micro.

Resultados

O processo de fabrico usado para produzir suportes porosos Ti é ilustrado na Figura 1A. Ti é mantido em pó disperso homogeneamente em canfeno pela rotação contínua do recipiente a 44 ° C durante 12 h e, ao mesmo tempo canfeno líquido é totalmente solidificados, quaisquer sedimentos de pó Ti relativamente pesado pode ser minimizada. Como um resultado, o corpo verde homogénea Ti-canfeno foi produzido utilizando o processo de fundição de congelação dinâmica, como mostrado n...

Discussão

Embora os sistemas de Biometal têm sido amplamente utilizado para aplicações biomédicas, em particular, como materiais de suporte de carga, elevada rigidez e baixa bioactividade de metais têm sido consideradas como principais desafios. Neste estudo, foi estabelecido o método de fabricação de um novo sistema de metal, um andaime de metal poroso densificada que tem propriedades mecânicas, bem como biomiméticos superfície bioactiva com comportamento de libertação sustentável. As principais vantagens do nosso ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titanium powder	Alfa Aesar	#42624	-325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Welgene	ML 008-01	­
Green Fluorescent Protein (GFP)	Genoss Co.	-	>98% purity, 1 mg/ml
Ball mill oven	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
Freeze dryer	Ilshin Lab.	PVTFD50A	­
Cold isostatic pressing (CIP) machine	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
Vaccum furnace	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
electical chaege machine	FANUC robocut	0iB	External use
Press machine	CG&S	AJP-200	­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	External use