Fabbricazione di meccanicamente Tunable e Bioactive metallo Ponteggi per applicazioni biomediche

Riepilogo

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Abstract

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Introduzione

Mentre biomateriali metallici sono stati ampiamente utilizzati come protesi portanti e dispositivi di fissaggio interni a causa della loro ottima resistenza meccanica e la resistenza, ^1-3 coinvolgono due sfide cruciali: 1) non corrispondente meccanico perché i metalli sono molto più rigido rispetto ai tessuti biologici, provocando danni indesiderati ai tessuti circostanti e 2) bassa bioattività che spesso si traduce in scarsa interfaccia con i tessuti biologici, spesso provocando reazioni da corpo estraneo (ad esempio, infiammazione o trombosi). ^4-6 ponteggi metallici porosi sono state proposte per promuovere la crescita ossea nelle strutture, migliorando . contatto osso-impianto, mentre gli effetti dello scudo di stress vengono soppressi a causa della loro rigidità ridotta ^7-9 Inoltre, varie modifiche di superficie sono stati applicati per migliorare le attività biologiche di impianti metallici; tali modifiche comprendono il rivestimento della superficie metallica con molecole bioattive (ad esempio, la crescita factori) o farmaci (ad esempio, vancomicina, tetracicline). ^10-12 Tuttavia, problemi come la riduzione delle proprietà meccaniche dei ponteggi metallici porosi, diminuito la rigidità e il rilascio veloce degli strati di rivestimento bioattivi restano irrisolti. ^13-16

In particolare, titanio (Ti) e leghe di Ti sono uno dei più diffusi sistemi Biometal causa delle loro eccellenti proprietà meccaniche, stabilità chimica e buona biocompatibilità. ^13,17-19 loro applicazioni a forma di schiuma hanno attirato un crescente interesse perché il 3D reti porosi promuovere crescita ossea in aggiunta alle proprietà meccaniche simile all'osso. ^20-22 sforzi sono stati fatti per migliorare le proprietà meccaniche sviluppando nuove tecniche di produzione inclusi replica di spugna polimerica, sinterizzazione di particelle metalliche, prototipazione rapida metodo (RP), e Metodo titolare spazio per controllare le varie caratteristiche dei pori (ad esempio, la frazione dei pori,forma, dimensione, di distribuzione, e la connettività) e proprietà dei materiali (ad esempio, di fase metallici e impurità). ^23-25 ​​Recentemente, il casting congelamento dei a base di acqua metallo liquami ha guadagnato una notevole attenzione per la produzione di forme avanzate meccanicamente TI con pori ben allineati strutture, utilizzando la unidirezionale ghiaccio crescita dei dendriti durante la solidificazione; tuttavia, la contaminazione di ossigeno causata dal contatto di polveri di metallo con l'acqua richiede una particolare attenzione per ridurre al minimo la fragilità di ponteggi Ti. ^14,15

Pertanto, abbiamo sviluppato un nuovo approccio verso la fabbricazione di impalcature Ti porosi bioattive e meccanicamente accordabili. ^{25 Le} impalcature hanno inizialmente strutture porose con una porosità superiore al 50%. Gli scaffold porosi fabbricati sono stati rivestiti con molecole bioattive e poi compressi utilizzando una pressa meccanica in cui la porosità finale, proprietà meccaniche e comportamenti rilascio del farmaco erano controllati dal appliceppo ed. Gli impianti addensate Ti porosi hanno dimostrato bassa porosità con buona resistenza nonostante la bassa rigidità paragonabile a quella dell'osso (3-20 GPa). ² A causa dello strato di rivestimento, la bioattività del addensato porosa Ti è significativamente migliorata. Inoltre, a causa delle particolari strutture a pori piane indotte dal processo di densificazione, le molecole bioattive rivestiti sono stati osservati essere gradualmente rilasciato dal ponteggio, mantenendo la loro efficacia per un periodo prolungato.

In questo studio, abbiamo introdotto il nostro metodo stabilito per fabbricare densificati scaffold Ti porosi per uso potenziale in applicazioni biomediche. Il protocollo include colata congelamento dinamico con fanghi metallo e densificazione di scaffold porosi. In primo luogo, per fabbricare scaffold porosi TI con buona duttilità è stato introdotto il metodo freeze fusione dinamica come mostrato nella Figura 1A. Polvere ti è stata dispersa in camphene liquido; quindi, diminuendo la temperatura,la fase liquida è solidificato, causando la separazione di fase tra la rete polvere Ti e cristalli canfene solidi. Successivamente, il corpo verde solidificato Ti-canfene stato sinterizzato in cui le polveri di Ti sono stati condensati con continue puntoni Ti, e la fase canfene stato completamente rimosso per ottenere una struttura porosa. Il rivestimento e processo densificazione con scaffold porosi ottenuti è stato impiegato, variando il grado di addensamento e porosità iniziale. Lo strato di rivestimento ed il suo comportamento rilascio sono stati visualizzati e quantificati tramite la proteina fluorescente verde (GFP) Rivestiti poroso Ti con e senza densificazione rispetto alla GFP rivestite denso Ti. Infine, impalcature Ti funzionalmente graduati che hanno due diverse strutture porose sono stati proposti e dimostrate variando il grado di addensamento delle parti interne ed esterne dei scaffold porosi.

Protocollo

1. Realizzazione di metallo poroso Ponteggi

1. Preparare fanghi Ti-canfene mescolando disponibile in commercio in polvere Ti, canfene, e KD-4 dopo aver valutato l'ammontare adeguato di materiali come descritto nella tabella 1 per porosi ponteggi TI con quattro porosità iniziale (40, 50, 60, e 70). Versare fanghi in 500 ml di polietilene (PE) e ruotare le bottiglie bottiglie a 55 ° C per 30 minuti in un forno di macinazione a 30 rpm.
2. Versare fanghi dalle bottiglie PE in alluminio cilindrico (Al) stampi con un diametro di 60 mm ed un'altezza di 60 mm. Sigillare ogni stampo Al con la corrispondente copertura di slittamento Al e ruotare gli stampi in forno di macinazione ad una velocità di 30 giri al minuto a 55 ° C per 10 min.
   1. Successivamente, diminuire la temperatura del forno di macinazione a 44 ° C, e continuamente ruotare gli stampi ad una velocità di 30 giri al minuto a temperatura costante di 44 ° C per 12 ore.
3. Togliere lo stampo dal palla-mulino forno dopo inoltre ruotare gli stampi a temperatura ambiente per 1 ora per il processo di raffreddamento. Rimuovere il titanio / canfene corpo verde solidificato dallo stampo di Al con un pistone di Al.
4. Posizionare il titanio / canfene corpo verde solidificato in un sacchetto di gomma a mano e completamente sigillare il sacchetto di gomma legando la bocca del sacco con una stringa. Posizionare il sacchetto di gomma nel serbatoio di una pressatura isostatica (CIP) Macchina fredda e applicare una pressione isostatica di 200 MPa per 10 min. Rimuovere il corpo verde compressa dal sacchetto di gomma.
5. Trasferire il corpo verde Ti-canfene su un crogiolo di allumina a mano e posizionare il crogiolo nella macchina liofilizzatore. Liofilizzare il corpo verde sublimare fase canfene nel corpo verde a - 40 ° C per 24 ore.
6. Successivamente, chiudere il crogiolo con una copertura di slittamento allumina e posizionare il crogiolo chiuso in un forno sotto vuoto (inferiore a 10 ^-6 Torr) a temperatura ambiente. Quindi, aumentare la temperatura del forno a 1300 ° C ad un riscaldamento rate di 5 ° C / min e mantenere la temperatura a 1300 ° C per 2 ore.
7. Dopo il trattamento termico, mantenere la sinterizzato poroso Ti nel forno per 6-7 ore finché il forno è completamente raffreddata a RT.
   Nota: Durante 6 hr del processo di raffreddamento, la velocità di raffreddamento media del forno sopra 400 ° C è di ~ 15 ° C / min e la velocità di raffreddamento media del forno inferiore a 400 ° C è ~ 2 ° C / min.
8. Se necessario, tagliare il blocco di sinterizzato poroso Ti in campioni a forma di disco con un diametro di 16 mm mediante elettroerosione (EDM). ²⁷
   Nota: A seconda delle dimensioni degli stampi Al, la dimensione del sinterizzato poroso Ti deve essere modificata durante il processo di lavorazione (Figura 2A).
9. Posizionare un bicchiere di vetro con i campioni porosi Ti in autoclave e sterilizzare i campioni a 121 ° C per 15 min. Rimuovere i campioni dall'autoclave. Lavare i campioni porosi TI con acqua distillata e quindi due volte con etanolo al 70% per due volte.Infine, lasciare la porosa Ti in una capsula di Petri e aria asciugare i campioni a temperatura ambiente su una panchina pulita sotto raggi UV.

2. Immergere Rivestimento di impalcature con gli agenti bioattivi

1. Diluire il commerciale verde Fluorescence Protein (GFP) da 1 mg / ml a 100 pg / ml in un banco pulito mescolando 1 ml di GFP con 9 ml di soluzione di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS, pH 7.4) in 10 ml-sterilizzati polistirene (PS) tubo come indicato nella Tabella 1.
2. Immergere il sterilizzato densa o porosa Ti in 10 ml di soluzione diluita GFP (100 mcg / ml) ponendo i campioni di Ti nel tubo PS con la soluzione GFP a RT e mettendo su un banco pulito.
3. Posizionare il tubo PS in un essiccatore a vuoto ed evacuare l'essiccatore per 10 minuti per assicurare la soluzione GFP penetra più efficacemente i pori del porosa Ti.
4. Rimuovere il titanio poroso dal tubo di PS con una pinzetta. Posizionare la GFP rivestite poroso Ti in un diametro di 10 centimetri Pepiatto tri e asciugare O / N a RT su un banco pulito.
5. Sciacquare la porosa Ti due volte con 10 ml di Dulbecco tampone fosfato (DPBS) in un bicchiere di vetro, e spostare il porosa Ti in un diametro di Petri piatto 10 centimetri con una pinzetta e aria secca a temperatura ambiente su una panchina pulita.

3. densificazione porosi Ponteggi

1. Porre i campioni Ti porosi GFP rivestite con diverse altezze in uno stampo cilindrico di acciaio, e inserire una serie di punzoni nei fori superiori e inferiori dello stampo in acciaio (Figura 3A).
2. Comprimere il porosa Ti nell'assieme stampo di acciaio a temperatura ambiente nella direzione z del campione (Figura 3A) utilizzando una pressa a velocità di deformazione intermedie di 0,05 ~ 0,1 sec ^-1 contro le sollecitazioni applicate predeterminati illustrati nella Tabella 2. Tenere la pressione per 1 min prima di scarico.
3. Rimuovere i campioni Ti densificati dallo stampo in acciaio. Lavare i campioni addensate due volte con 10 ml di DPBSin un becher e asciugare O / N a RT su un banco pulito.

4. Prova Rilascio di Ponteggi GFP rivestite

1. Immergere tre tipi di campioni (GFP rivestite denso Ti (dopo i passaggi da 2), rivestito GFP-poroso Ti (dopo i punti 1 e 2) e GFP-rivestito addensato poroso Ti (dopo i passi 1-3)) in 5 ml DPBS (pH 7.4) soluzione contenuta in una provetta da 10 ml sterilizzato PS a 37 ° C su un banco pulito.
2. Aspirazione su tutta la soluzione DPBS da ciascuna provetta PS con il campione GFP rivestite e riempite con una soluzione nuova 5 ml DPBS (pH 7,4) usando una pipetta secondo i tempi prestabiliti di 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 e 29 giorni dopo l'immersione.
3. Prendete le immagini di fluorescenza dei campioni GFP rivestite prima immersione (giorno 0) e dopo 22 giorni-immersion utilizzando la spettroscopia confocale a scansione laser (CLSM).
4. Misurare l'intensità del segnale di fluorescenza della GFP rilasciato in 1 ml di soluzione da un totale di 5 ml di soluzione DPBS disegnata da ciascuna provetta PS nella sezione 4.2 usandoSpettroscopia UV alla lunghezza d'onda di 215 nm. Convertire il valore di intensità nella concentrazione della soluzione GFP utilizzando la curva standard.
   Nota: Prima della misurazione, tracciare la curva standard di soluzione GFP misurando l'intensità segnale di fluorescenza della soluzione GFP in un intervallo di concentrazione da 0 ng / ml - 10 mg / ml.

5. Realizzazione di Graded porosi Ti Ponteggi

1. Produrre un blocco del sinterizzato poroso Ti ripetendo il punto 1.1 al punto 1.7.
2. Macchina del blocco poroso sinterizzato Ti secondo i disegni struttura predeterminata (ad esempio, la figura 5a e 5d) di EDM.
3. Porre i campioni lavorati TI con distribuzione dell'altezza in uno stampo in acciaio, dove il diametro porosa Ti è ~ 0,1 mm inferiore al diametro dello stampo e inserire una serie di punzoni nei fori superiori e inferiori dello stampo in acciaio.
4. Eseguire i passi 3.2 e 3.3.

6. porosità Measurement di Ti Ponteggi

1. Misurare la massa _(m s) di ponteggi Ti.
2. Calcolare il volume apparente (V _s), misurando la lunghezza, la larghezza e l'altezza di scaffold Ti.
3. Calcolare la porosità utilizzando la seguente equazione:
   
   dove P è la percentuale totale di porosità, ρ _Ti è la densità teorica del titanio e m _S / V _S è la densità misurata del campione.
   Nota: La porosità dei campioni di Ti può essere recuperato direttamente dalle immagini microCT dopo l'imaging microCT viene effettuata utilizzando una tomografia scanner micro-calcolata.

Risultati

Il processo di fabbricazione utilizzata per produrre scaffold porosi Ti è illustrato nella Figura 1A. Polvere di Ti è mantenuto disperso omogeneamente in canfene dalla rotazione continua del contenitore a 44 ° C per 12 ore e, mentre canfene liquido è completamente solidificato, eventuali sedimenti di relativamente pesante polvere Ti possono essere minimizzati. Come risultato, il corpo verde omogeneo Ti-canfene stato prodotto utilizzando il processo di congelamento colata dinamica co...

Discussione

Mentre i sistemi Biometal sono stati ampiamente utilizzati per applicazioni biomediche, in particolare, come materiali portanti, elevata rigidità e bassa bioattività dei metalli sono stati considerati come grandi sfide. In questo studio, abbiamo stabilito il metodo di fabbricazione di un nuovo sistema di metallo, una impalcatura metallo poroso addensato che ha biomimetici proprietà meccaniche e di superficie bioattiva con comportamento rilascio sostenibile. I principali vantaggi del nostro metodo di fabbricazione inc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titanium powder	Alfa Aesar	#42624	-325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Welgene	ML 008-01	­
Green Fluorescent Protein (GFP)	Genoss Co.	-	>98% purity, 1mg/ml
Ball mill oven	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
Freeze dryer	Ilshin Lab.	PVTFD50A	­
Cold isostatic pressing (CIP) machine	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
Vaccum furnace	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
electical chaege machine	FANUC robocut	0iB	External use
Press machine	CG&S	AJP-200	­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	External use