Fabricación de Mecánicamente sintonizable y Bioactivos metal andamios para Aplicaciones Biomédicas

Resumen

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Resumen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Introducción

Mientras biomateriales metálicos han sido ampliamente utilizados como implantes de soporte de carga y dispositivos de fijación interna, debido a su excelente resistencia mecánica y resistencia ^a 1-3 que involucran a dos retos críticos: 1) desajuste mecánico porque los metales son mucho más rígidos que los tejidos biológicos, causando daños indeseables a los tejidos circundantes y 2) baja bioactividad que a menudo resulta en pobres interfaz con los tejidos biológicos, a menudo provocan reacciones a cuerpos extraños (por ejemplo, inflamación o trombosis). Se han propuesto ^4-6 andamios metálicos porosos para promover el crecimiento óseo en las estructuras, mejorando . contacto hueso-implante mientras que los efectos de escudo de estrés son suprimidos debido a su rigidez reducida ^7-9 Además, diversas modificaciones de la superficie se han aplicado para mejorar las actividades biológicas de los implantes metálicos; tales modificaciones incluyen recubrimiento de la superficie metálica con moléculas bioactivas (por ejemplo, fac crecimientores) o drogas (por ejemplo, vancomicina, tetraciclina) ^10-12. Sin embargo, los problemas tales como propiedades mecánicas reducidas de andamios metálicos porosos, disminución de la rigidez y la liberación rápida de las capas de recubrimiento bioactivo siguen sin resolverse. ^{13-16 de}

En particular, el titanio (Ti) y Ti aleaciones son uno de los sistemas Biometal más populares debido a sus excelentes propiedades mecánicas, estabilidad química, y buena biocompatibilidad. ^13,17-19 Sus aplicaciones en forma de espuma también han atraído un interés creciente debido a que el 3D redes porosas promueven el crecimiento óseo, además de propiedades mecánicas similares al hueso. Se han hecho esfuerzos para mejorar ^20-22 las propiedades mecánicas mediante el desarrollo de nuevas técnicas de fabricación, incluyendo la replicación de la esponja polimérica, sinterización de partículas de metal, método de creación rápida de prototipos (RP), y espacio método de soporte con el fin de controlar las diversas características de los poros (por ejemplo, la fracción de poros,forma, tamaño, distribución y conectividad) y de las propiedades del material (por ejemplo, la fase metálica y de impurezas). ^23-25 ​​Recientemente, el casting congelación de suspensión metálica a base de agua se ha ganado una considerable atención para producir formas Ti mejoradas mecánicamente con poros bien alineada estructuras utilizando el crecimiento de dendritas de hielo durante la solidificación unidireccional; sin embargo, la contaminación de oxígeno causada por el contacto de polvos metálicos con agua requiere un cuidado especial para minimizar la fragilización de los andamios Ti ^14,15.

Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo enfoque hacia la fabricación de andamios porosos Ti bioactivos y mecánicamente sintonizables. ²⁵ Los andamios inicialmente tienen estructuras porosas con una porosidad de más de 50%. Los andamios porosos fabricados fueron recubiertas con moléculas bioactivas y luego comprimidos usando una prensa mecánica durante el cual la porosidad final, las propiedades mecánicas y el comportamiento de liberación del fármaco se controla mediante la aplicepa ed. Los implantes densificadas Ti porosos han mostrado baja porosidad con una buena resistencia a pesar de la baja rigidez comparable a la del hueso (desde 3 hasta 20 GPa). ² Debido a la capa de recubrimiento, la bioactividad de la densificado porosa Ti mejoró significativamente. Por otra parte, debido a las estructuras de poros planas únicas inducidas por el proceso de densificación, se observaron las moléculas bioactivas revestidos para ser lanzado gradualmente desde el andamio, manteniendo su eficacia durante un período prolongado.

En este estudio, hemos introducido nuestro método establecido para fabricar andamios densificadas Ti porosas para uso potencial en aplicaciones biomédicas. El protocolo incluye la fundición de congelación dinámica con lechadas de metal y densificación de andamios porosos. En primer lugar, para fabricar andamios porosos Ti con buena ductilidad se introdujo el método de colada de congelación dinámica como se muestra en la Figura 1A. Polvo de Ti se dispersó en canfeno líquido; entonces, por la disminución de la temperatura,la fase líquida se solidificó, dando como resultado la separación de fases entre la red de polvo de Ti y canfeno cristales sólidos. Posteriormente, el cuerpo verde solidificado Ti-canfeno se sinterizó en el que polvos de Ti se condensaron con puntales continuos Ti, y la fase canfeno se eliminó completamente para obtener una estructura porosa. Se empleó el revestimiento y proceso de densificación con los andamios porosos obtenidos, variando el grado de densificación y la porosidad inicial. La capa de recubrimiento y su comportamiento de liberación se visualizaron y cuantificaron utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) presenta el revestimiento poroso Ti con y sin densificación en comparación con la GFP-revestido densa Ti. Por último, se propusieron y demostraron mediante la variación del grado de densificación de las partes interior y exterior de los andamios porosos andamios Ti funcionalmente graduadas que tienen dos diferentes estructuras porosas.

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Protocolo

1. La fabricación de andamios porosos de metal

1. Preparar suspensiones Ti-canfeno mezclando disponible comercialmente polvo de Ti, canfeno, y KD-4 después de pesar las cantidades apropiadas de materiales como se describe en la Tabla 1 para andamios porosos Ti con cuatro porosidades iniciales (40, 50, 60, y 70). Verter las suspensiones en 500 ml de polietileno (PE) y girar las botellas botellas a 55 ° C durante 30 min en un horno de molino de bolas a 30 rpm.
2. Verter las suspensiones de las botellas de PE en cilíndrico de aluminio (Al) moldes con un diámetro de 60 mm y una altura de 60 mm. Cerrar cada molde de Al con el correspondiente hoja de cubierta Al y girar los moldes en un horno de molino de bolas a una velocidad de 30 rpm a 55 ° C durante 10 min.
   1. Posteriormente, disminuir la temperatura del horno molino de bolas a 44 ° C, y continuamente girar los moldes a una velocidad de 30 rpm a la temperatura constante de 44 ° C durante 12 hr.
3. Saque el molde de la bola-molino de horno después adicionalmente la rotación de los moldes a temperatura ambiente durante 1 hr para el proceso de enfriamiento. Retire el titanio / canfeno cuerpo verde solidificada del molde Al usar un Al émbolo.
4. Coloque el titanio / canfeno cuerpo verde solidificado en una bolsa de goma a mano y sellar completamente la bolsa de caucho mediante la vinculación de la boca de la bolsa con una cadena. Colocar la bolsa de goma en el tanque de agua de una presión (CIP) de la máquina isostático en frío y aplicar una presión isostática de 200 MPa durante 10 min. Retire el cuerpo verde comprimido de la bolsa de goma.
5. Transferir el cuerpo verde Ti-canfeno a un crisol de alúmina a mano y colocar el crisol en la máquina liofilizador. Liofilizar el cuerpo verde para sublimar la fase canfeno en el cuerpo verde en - 40 ° C durante 24 hr.
6. Posteriormente, cierre el crisol con una hoja de cubierta de aluminio y colocar el crisol cerrado en un horno de vacío (por debajo de 10 ^-6 Torr) a TA. A continuación, aumentar la temperatura del horno a 1300 ° C a una calefacción rcomió de 5 ° C / min y mantenga la temperatura a 1300 ° C durante 2 horas.
7. Después del tratamiento térmico, mantener el sinterizado poroso Ti en el horno 6-7 por hr hasta que el horno está totalmente enfrió a TA.
   Nota: Durante 6 hr del proceso de enfriamiento, la velocidad media de enfriamiento del horno por encima de 400 ° C es de ~ 15 ° C / min y la velocidad media de enfriamiento del horno por debajo de 400 ° C es de ~ 2 ° C / min.
8. Si es necesario, cortar el bloque de sinterizado poroso Ti en muestras en forma de disco con un diámetro de 16 mm a través de mecanizado por descarga eléctrica (EDM). ²⁷
   Nota: Dependiendo del tamaño de los moldes Al, el tamaño de la sinterizado poroso Ti necesita ser modificado a través del proceso de mecanizado (Figura 2A).
9. Coloque un vaso de precipitados de vidrio con las muestras porosas Ti en un autoclave y esterilizar las muestras a 121 ° C durante 15 min. Retirar las muestras del autoclave. Lavar las muestras porosas Ti con agua destilada dos veces y luego con etanol al 70% dos veces.Por último, dejar la porosa Ti en una placa de Petri y aire seco de las muestras a temperatura ambiente en un banco limpio bajo la luz ultravioleta.

2. Dip Coating de andamios con agentes bioactivos

1. Diluir el comercial Fluorescencia verde Protein (GFP) a partir de 1 mg / ml a 100 mg / ml en un banco limpio mediante la mezcla de 1 ml de GFP con 9 ml de tampón fosfato salino (DPBS, pH 7,4) solución de Dulbecco en un 10 esterilizan-ml poliestireno (PS) de tubo como se indica en la Tabla 1.
2. Sumergir el esterilizada densa o porosa Ti en 10 ml de solución de GFP diluido (100 g / ml) mediante la colocación de las muestras de Ti en el tubo de PS con la solución de GFP a TA y colocación en un banco limpio.
3. Colocar el tubo de PS en un desecador de vacío y evacuar el desecador durante 10 min para asegurar la solución GFP penetra en los poros de la porosa Ti con mayor eficacia.
4. Retire el titanio poroso del tubo de PS con unas pinzas. Coloque la GFP recubierto poroso Ti en un diámetro de 10 cm Peplato tri y aire seco O / N a temperatura ambiente en un banco limpio.
5. Enjuague la porosa Ti dos veces con 10 ml de Dulbecco tampón fosfato salino (DPBS) en un vaso de vidrio, y mover el porosa Ti en una placa de Petri de diámetro 10 cm con unas pinzas y aire seco a temperatura ambiente en un banco limpio.

3. La densificación de andamios porosos

1. Colocar las muestras porosas GFP Ti recubierto con varias alturas en un troquel de acero cilíndrica, e insertar un conjunto de golpes en los orificios superior e inferior de la matriz de acero (Figura 3A).
2. Comprimir el porosa Ti dentro del conjunto de troquel de acero a TA en la dirección z de la muestra (Figura 3A) utilizando una máquina de prensa en velocidades de deformación intermedios de 0,05 ~ 0,1 seg ^-1 contra las cepas aplicadas predeterminados mostrados en la Tabla 2. Mantenga la presión durante 1 minuto antes de la descarga.
3. Retire las muestras Ti densificadas de la matriz de acero. Lavar las muestras densificadas dos veces con 10 ml de DPBSen un vaso de precipitados y O-secar al aire / N a temperatura ambiente en un banco limpio.

4. Prueba de Liberación de andamios GFP-revestido

1. Sumergir tres tipos de especímenes (GFP-revestido densa Ti (después de las etapas 2), recubierto GFP-porosa Ti (después de los pasos 1 y 2) y GFP-revestido porosa densificada Ti (después de los pasos 1-3)) en 5 ml DPBS (pH 7.4) solución contenida en un tubo esterilizado PS 10 ml a 37 ° C en un banco limpio.
2. Succión toda la solución de DPBS de cada tubo PS con la muestra de GFP-revestido y reponer con una solución de nuevos 5 ml de DPBS (pH 7,4) usando una pipeta de acuerdo con los tiempos predeterminados de 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 y 29 días después de la inmersión.
3. Tome las imágenes de fluorescencia de las muestras recubiertas de GFP antes de la inmersión (día 0) y después de 22 días de inmersión usando espectroscopia láser confocal de barrido (CLSM).
4. Medir la intensidad de la señal de fluorescencia de la GFP lanzado en 1 ml de solución de un total de 5 ml de solución DPBS extraída de cada tubo de PS en la sección 4.2 utilizandoEspectroscopía UV a una longitud de onda de 215 nm. Convertir el valor de intensidad en la concentración de la solución de GFP usando la curva estándar.
   Nota: Antes de la medición, dibujar la curva estándar de la solución de GFP mediante la medición de la intensidad de la señal de fluorescencia de la solución de GFP en el intervalo de concentraciones de 0 ng / ml - 10 mg / ml.

5. Fabricación de Graded porosos Ti Andamios

1. Producir un bloque del sinterizado poroso Ti repitiendo el paso 1.1 al paso 1.7.
2. El bloque de Ti sinterizado poroso de acuerdo con los diseños de estructura predeterminada (por ejemplo, la Figura 5A y 5D) por EDM Machine.
3. Colocar las muestras mecanizadas Ti con distribución de la altura en un troquel de acero, donde el diámetro de Ti porosa es de ~ 0,1 mm menor que el diámetro de la matriz e insertar un conjunto de golpes en los orificios superior e inferior de la matriz de acero.
4. Realice los pasos 3.2 y 3.3.

6. La porosidad de míasurement de Ti Andamios

1. Mida la masa (m _s) de andamios Ti.
2. Calcular el volumen aparente (V _s) mediante la medición de la longitud, anchura y altura de andamios Ti.
3. Calcular la porosidad usando la siguiente ecuación:
   
   donde P es el porcentaje total de porosidad, ρ _Ti es la densidad teórica del titanio y m _{S /} V _S es la densidad medida de la muestra.
   Nota: La porosidad de las muestras de Ti puede ser recuperada directamente de las imágenes después de la impresión microCT microCT se lleva a cabo utilizando un escáner de micro-tomografía computarizada.

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Resultados

El proceso de fabricación utilizado para producir andamios porosos Ti se ilustra en la Figura 1A. Polvo de Ti se mantiene dispersa homogéneamente en canfeno por la rotación continua del recipiente a 44 ° C durante 12 horas y, mientras canfeno líquido se solidifica completamente, ningún sedimentos relativamente pesado polvo de Ti se pueden minimizar. Como resultado, el cuerpo verde homogénea Ti-canfeno fue producido usando el proceso de fundición de congelación dinámica como se muestra ...

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Discusión

Mientras que los sistemas Biometal han sido ampliamente utilizados para aplicaciones biomédicas, sobre todo, como materiales de carga, alta rigidez y baja bioactividad de los metales han sido considerados como los principales desafíos. En este estudio, hemos establecido el método de fabricación de un nuevo sistema de metal, un andamio de metal poroso densificado que tiene propiedades mecánicas biomiméticos, así como con superficie bioactiva comportamiento de liberación sostenible. Las principales ventajas de nue...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titanium powder	Alfa Aesar	#42624	-325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene	SigmaAldrich	#456055	95%, C10H16
KD-4	Croda	­	Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Welgene	ML 008-01	­
Green Fluorescent Protein (GFP)	Genoss Co.	-	>98% purity, 1 mg/ml
Ball mill oven	SAMHENUG ENERGY	SH-BDO150	­
Freeze dryer	Ilshin Lab.	PVTFD50A	­
Cold isostatic pressing (CIP) machine	SONGWON SYSTEMS	CIP 42260	­
Vaccum furnace	JEONG MIN INDUSTRIAL	JM-HP20	­
electical chaege machine	FANUC robocut	0iB	External use
Press machine	CG&S	AJP-200	­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM)	Olympus	FluoView FV1000	External use