النقل غشاء عمليات تحليلها بواسطة النظام ثقب النانو رقاقة الموازي عالية في قرار بروتين واحد

Summary

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Abstract

نقل البروتين غشاء على مستوى بروتين واحد لا يزال يتهرب تحليل مفصل، إذا الركيزة translocated غير قابلة للكهربي. وقد بذلت جهود كبيرة في هذا المجال، ولكن تقنيات تمكين تحليل النقل عالية الإنتاجية الآلي في تركيبة مع تقنيات طبقة ثنائية المادة الدهنية الخالية من المذيبات المطلوبة للتحليل النقل غشاء نادرة. هذا النوع من النقل ولكن هو الحاسم في توازن الخلايا وبالتالي هدفا رئيسيا في تطوير العقاقير ومنهجيات للحصول على أفكار جديدة بحاجة ماسة.

يصف المخطوطة هنا قدمت إنشاء والتعامل معها من بيوشيب رواية لتحليل البروتين بوساطة عمليات النقل غشاء على قرار نقل احد. يتكون بيوشيب من microcavities محاطة nanopores التي هي موازية للغاية في التصميم ويمكن أن تنتج في الصف الصناعي وكمية. ويمكن مباشرة الجسيمات الشحمية البروتين إيواء تطبيقها علىسطح رقاقة تشكيل طبقات ثنائية للدهون، والتي تمتد المسام الذاتي تجميعها باستخدام SSM-تقنيات (بدعم الصلبة الأغشية الدهنية). المسام التي تغطي أجزاء من الغشاء وقائما بذاته، وتوفير واجهة للالنبات الركيزة داخل أو خارج الفضاء تجويف، والتي يمكن أن تتبعها قراءات الفلورسنت متعددة الأطياف في الوقت الحقيقي. وضع إجراءات التشغيل القياسية (الأورام) يسمح بإنشاء واضحة من طبقات ثنائية الدهون-إيواء البروتين على سطح رقاقة من تقريبا كل بروتين الغشاء الذي يمكن تشكيلها وظيفيا. الشرط الوحيد هو إنشاء نظام تلا الفلورسنت لركائز النقل غير كهربي.

تطبيقات فحص عالية المحتوى هي محقق عن طريق استخدام آلية المجهر الفلورسنت المقلوب تسجيل رقائق متعددة في نفس الوقت. ويمكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة باستخدام متاحة بحرية برامج التحليل مصمم خصيصا. ثلاثة ألوان متعددة الطيفية الفلوريةقراءة من علاوة على ذلك يسمح للتمييز البيانات غير منحازة إلى فئات الأحداث المختلفة، والقضاء على نتائج إيجابية كاذبة.

وتعتمد هذه التقنية رقاقة حاليا على شافي ₂ السطوح، ولكن المزيد من functionalization باستخدام أسطح رقاقة الذهب المطلي ممكن أيضا.

Introduction

أصبح تحليل بروتينات الغشاء من الاهتمام المتزايد للبحوث الأساسية والأدوية في السنوات ال 20 الماضية. تطوير عقاقير جديدة تعتمد على تحديد وتوصيف مفصل للأهداف جديدة، ويجري حاليا واحدة من العوامل التي تحد. حقيقة أن حوالي 60٪ من جميع الأهداف المخدرات هي بروتينات غشاء ^1، يجعل من تطوير تقنيات لتوضيح وظيفتها الأهم.

في الماضي، وقد تم تطوير تقنيات لدراسة قنوات كهربي والنقل في العديد ^2-4. ركائز غير كهربي في العكس تمثل مهمة أكثر صعوبة. ومع ذلك فهي تحظى باهتمام خاص كأهداف المخدرات الرئيسية، كما أنها تتحكم في تدفق المواد المذابة والمواد الغذائية عبر غشاء الخلية ووظيفتها باسم المستقبلات الرئيسية في الإشارة شلالات ^5.

وقد بذلت جهود كبيرة في تطوير رechniques لدراسة وظيفة البروتينات النقل غشاء ^{6 و 7.} ظهرت النظم التي تستخدم الأغشية الصلبة المدعومة من الأدوات كما الواعدة في هذا المجال ^8-10، بما في صلب طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، طبقات ثنائية المربوطة ^{11، 12،} الأغشية microblack الدهون ^{13 و 14} و الأم صفائف حويصلة ^{15 و 16} على سبيل المثال لا الحصر. تتوفر حتى مع الاجهزة التجارية ^{17، 18} بعضهم. وقد نشرت بعض الأمثلة التي تجمع بين القدرة على دراسة بروتينات الغشاء واحدة بطريقة موازية للغاية ^{14، 19،} وهو شرط أساسي لتطبيقات الفحص. ومع ذلك، هذه الأساليب نادرا ما يسد من البحوث الأساسية إلى البيئة الصناعية. كثيرا ما تكمن الصعوبات في قدرة النظام أن يكون automatable، والإنتاج الكثيف من حيث التكلفة و / أو التحضير شاقة. نهج س vercoming جميع العقبات المذكورة أعلاه هو الهدف النهائي.

وقد تم تطوير تقنية المعروضة هنا لدراسة قنوات الغشاء والنقل في المختبر في بيئة تسيطر عليها على مستوى البروتين واحدة ^20-22. وأكثر من ذلك بكثير إنشاء إعادة تشكيل بروتينات الغشاء النقاء في LUVs من نهج مماثلة لGUVs ^23-26 أو الدهون السوداء الأغشية ^27. يمكنهم مباشرة يتم تطبيقها على سطح رقاقة، حيث تشكيل طبقة ثنائية تجري من خلال عملية التجميع الذاتي. تصميم الزجاج السفلي من رقاقة nanoporous (الشكل 1) يسمح للفحص المجهري الهواء، مما يسمح للأتمتة واضحة للنظام. جنبا إلى جنب مع مرحلة الآلية يمكن قياس رقائق متعددة في نفس الوقت، مع كل مجال الرؤية التي تحتوي على الآلاف من تجاويف مختومة لتحليلها.

= "1">
الشكل 1. تصميم biochips ثقب النانو المضاعفة. أ) السيليكون على العازل (منظم أبناء العراق) رقاقة عن طريق النقش على رد الفعل ايون. هي ملفقة حوالي 1150 رقائق الفردية من كل رقاقة مع خصائص مماثلة والجودة. ب) ويضم كل رقاقة 250،000 microcavities الفردية مع فتحات نانو. شريط مقياس: 200 ميكرون C) كل تجويف هو عنونة عبر مضان متعددة الأطياف للقراءة خارج. وintransparent أعلى كتل طبقة الاشارات الفلورسنت من الخزان العازلة، مما يجعل بيوشيب متوافقة مع المجاهر مضان مقلوب. D) مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير يكشف ترتيب بالتساوي فتحات المسام وخشونة سطح طبقة ثاني أكسيد السيليكون من 3.6 نانومتر (ن = 40) الأمثل لالانصهار الحويصلة. مقياس شريط: 5 ميكرون E) هيئة التصنيع العسكري الضوئي الإلكترونمعارض roscopy (SEM) صورة مقطع عرضي من خلال ثقب النانو مما يتيح الوصول إلى تجاويف فيمتولتر داخل رقاقة السيليكون. تم إعادة استخدام هذا الرقم بإذن من ^21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم تنفيذ جميع تحليل البيانات باستخدام مجانية لضمان الوصول غير المقيد للمستخدمين النهائيين. ويتم تحليل السلاسل الزمنية باستخدام برنامج معالجة الصور والعرف بناء منحنى برامج التحليل تمكين تجهيز دفعة والارتباط المباشر لمجموعات كبيرة من البيانات مع قنوات الفلورسنت متعددة وآلاف من المنحنيات.

البروتين النموذج المستخدم في هذا البروتوكول هو قناة mechanosensitive من البروتين قناة (MscL) تصرف كبير المستمدة من E. القولونية. وهي بمثابة صمام للافراج عن صدمة التناضحي في الطبيعة، ولكن تم تعديلها في مثل هذه الطريقة التي صممت بعقلانية syntيمكن أن تساهمي ظائف hetic أن تعلق على جانب قنوات انقباض. عبر المسؤول عن النفور من المنشط ملزمة تساهميا (MTSET) يتم تشغيل القناة لفتح، وخلق نانو صمام. جزيئات صغيرة مثل أيونات، المياه، بروتينات صغيرة، ولكن أيضا fluorophores صغيرة يمكن أن تتخلل من خلال القناة. هنا، يتم استخدام البروتين كنموذج للتدليل على قدرة نظام للكشف عن النبات بوساطة البروتين.

Protocol

1. إعداد كبيرة Unilamellar الحويصلات (LUVs)

1. تنظيف قارورة أسفل جولة (حجم 10 مل) مع غاز النيتروجين لإزالة أي جزيئات الغبار. شطف قارورة أسفل مستديرة مع الايثانول.
   ملاحظة: الإيثانول المتبقية يمكن السكوت ولا تخل الخطوات اللاحقة.
2. غسل 1 مل 4X حقنة زجاجية مع الكلوروفورم، لإزالة أي تلوث. إضافة 4 مل SoyPC20 (25 ملغ / مل في الكلوروفورم) إلى قارورة القاع المستديرة ومخدر الحل الدهون مع مخدر ^ATTO إضافي ³⁹⁰ لتركيز النهائي من 0.1 مول٪.
   ملاحظة: بدلا من مخدر ^{ATTO 390} أخرى الدهون المسمى fluorophore أو الأصباغ محبة للدهون ويمكن أن تستخدم أيضا، اعتمادا على مصادر الإثارة المتاحة.
3. ربط دورق كروي إلى المبخر الدوار. تجفيف فيلم الدهون لمدة 40 دقيقة في 300 مليبار، 30 درجة مئوية درجة حرارة الحمام المائي والقصوى سرعة دوران، إلى تشكيل لفيلم الدهون متجانسة على الجدار الزجاجي من القارورة.
4. Transfإيه القارورة إلى مضخة فراغ عالية وجافة الفيلم الدهون لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
5. إضافة 5 مل العازلة (20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0. العقيمة التي تمت تصفيتها) و 8 حبات الزجاج (2.7 ملم القطر، والايثانول غسلها وتجفيفها) إلى القارورة. ربط القارورة إلى المبخر الدوار وتدوير دون فراغ عند 50 درجة مئوية في أقصى سرعة.
   ملاحظة: الخرز الزجاجي محل ميكانيكيا الفيلم الدهون من جدار زجاجي، مما يؤدي إلى (الصفاحات) تشكل الحويصلات. بعد 45 دقيقة تناوب يظهر حل حليبي وأي فيلم الدهون المتبقية يجب أن تكون واضحة في جدران القارورة. بدلا من الخرز الزجاجي أساليب أخرى مثل sonicating القارورة في sonifier حمام الماء، vortexing لقارورة أو طريقة معالجة الجفاف لطيف هي أيضا قابلة للتطبيق.
6. نقل قارورة تحت غاز خامل (الأرجون) إلى حمام بالموجات فوق الصوتية ويصوتن لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: صدمة الموجات فوق الصوتية تعكر صفو الجسيمات الشحمية، مما يجعلها unilamellar.
7. تقسيم حل LUVفي 1 مل قسامات.
8. أداء دورات 5 تجميد / الذوبان من خلال تجميد الحل لوف في النيتروجين السائل، تليها ذوبان في 40 درجة مئوية في حمام مائي.
   ملاحظة: هذا يؤدي إلى تمزق وإعادة ترتيب عفوية من الجسيمات الشحمية الفردية مع بعضها البعض، مما يؤدي إلى زيادة الحجم.
9. في الماضي مخزن خطوة تجميد جميع العينات في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: سوف LUVs تكون مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.

2. البروتين إعادة إعماره

1. ذوبان الجليد 1 مل LUV قسامة على الجليد. مباشرة قبل إعادة، قذف الجسيمات الشحمية 17X من خلال 400 نانومتر تصفية البولي غشاء باستخدام الطارد مصغرة.
   ملاحظة: سيتم إزالة الركام الدهون والوصول إلى التوزيع النهائي حجم متجانسة.
2. زعزعة استقرار LUVs بإضافة 4٪ تريتون X-100 (ت / ت) لتركيز النهائي من 0.25٪ (ت / ت)، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مئوية.
   ملاحظة: كمية الجسيمات الشحمية تستخدم في هذه الخطوة يعتمد على كتلة النقي MscL ^G <سوب> 22 ^C المستخدمة (راجع الخطوة 2.3). تنقية MscL ^{G 22 C} (مشتقة من كولاي) كما هو موضح بالتفصيل في ^28.
3. مزيج تنقية MscL ^{G 22 C} والجسيمات الشحمية المشبعة المنظفات في 1:20 (ث / ث) نسبة واحتضان لمدة 30 دقيقة إضافية عند 50 درجة مئوية.
4. لإزالة المنظفات إضافة الخرز الحيوي في المخزن تريس (20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0. العقيمة التي تمت تصفيتها) إلى حل البروتين / الحويصلية، مع 16 ملغ (الوزن الرطب) الخرز الحيوي في ميكرولتر المنظفات المستخدمة لزعزعة استقرار الجسيمات الشحمية في خطوة 2.2.
5. إجراء عملية إزالة المنظفات بين عشية وضحاها (16 ساعة) في 4 درجات مئوية على طبق من الدورية.
   ملاحظة: الخلط المستمر للحل يضمن إزالة المنظفات المثلى.
6. بعد إزالة المنظفات proteoliposomes تخزينها في 4 درجة مئوية، وتستخدم للتجارب في نفس اليوم.

3. آخر الفحص

1. خلال إعادة البروتين اتخاذ قسامة 100 ميكرولتر من المنظفاتحل proteoliposome زعزعة استقرار بعد الانتهاء من الخطوة 2.3.
2. إضافة 1 حجم calcein (30 ملم) في حل البروتين الحويصلية واحتضان إضافي 5 دقائق عند 50 درجة مئوية.
3. إزالة المنظفات من الحل كما هو موضح في الخطوة 2،4-2،6.
4. بعد إزالة المنظفات تتوازن عمود الحجم الاستبعاد (20 مل حجم السرير أو أكثر) مع العازلة تريس (3X حجم السرير).
   ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها الفصل Proteoliposome في درجة حرارة الغرفة، ولكن الحفاظ على عينة باستمرار في 4 درجات مئوية وينصح لضمان أفضل نشاط البروتين بعد تجزئة.
5. proteoliposomes منفصل عن calcein مجانا عن طريق تطبيق قسامة كامل (200 ميكرولتر) إلى العمود حجم الإقصاء. السماح للخليط لنقع في العمود، تليها شطف من proteoliposomes من العمود عن طريق تطبيق عازلة المستمر على رأس باستخدام تدفق الجاذبية. مراقبة calcein تحتوي على proteoliposomes والفرقة البرتقال منفصلة في الجبهة شطف. جمع كسور 500 & #181؛ ل على التوالي.
   ملاحظة: ستكون مجاني calcein صبغ أزل بعد الكسر proteoliposome مع الفصل التام.
6. ماصة 80 ميكرولتر من كل جزء على طبق من ذهب الصغيرة بشكل جيد لالفلورسنت تلا والتعرف على جزء يحتوي على أكبر قدر من calcein تحتوي على proteoliposomes عبر مضان الانبعاثات. كشف مضان في 520 نانومتر مع الإثارة في 490 نانومتر. استخدام جزء proteoliposome وفقا لأعلى إشارة لفحص النشاط التالي.
7. مزيج 20 ميكرولتر من الكسر التي تحتوي على proteoliposome مع العازلة تريس 980 ميكرولتر في مضان كوفيت 1 مل.
8. قياس الانبعاثات مضان في 520 نانومتر (الإثارة 490 نانومتر) باستخدام الطيفي. سجل لمدة 1 دقيقة ثم إضافة 25 ميكرولتر من MTSET ([2- (trimethylammonium) إيثيل] methanethiosulfonate) من محلول المخزون (160 ملم) وتخلط جيدا. تبقي على التسجيل أثناء الخلط. دائما تحضير محلول المخزون الطازجة مباشرة قبل الاستعمال.
   ملاحظة: بمجرد حلها في المخزن MTSET يتحللالصورة في غضون 30 دقيقة، وسوف تكون غير رد الفعل. MTSET يمكن أن يكون وزنه وأبقى مسحوق كما الجافة قسامة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: بمجرد تنشيط ^سي قناة MscL ^{G 22} يفتح والافراج عن جميع calcein شرك، مما يؤدي إلى نقص تركيز المحلي للcalcein عندما effluxing وproteoliposomes وdequenching اللاحقة للصباغة، مما أدى إلى زيادة في الانبعاثات مضان.
9. بعد مضان الانبعاثات قد وصلت إلى هضبة مستقرة مرة أخرى، إذابة في الليبوزومات بإضافة 50 ميكرولتر تريتون X-100 (4٪ ت / ت).
   ملاحظة: من الناحية المثالية أي زيادة مضان أخرى يمكن ملاحظتها، مما يعني البروتينات النشطة في كل الحويصلية.

4. الحجم قياس توزيع LUVs عن طريق تتبع نانو الجسيمات

1. لاحظ أن فقط عينات ضئيلة من الجسيمات الشحمية أو proteoliposome حل ضرورية لتحليل حجم التوزيع باستخدام جسيمات متناهية الصغر تعقب. تمييع الحل الحويصلية من 5 ملغ / مل دهن تركيز 1: 5000 (ت / ت) في المخزن (20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0. العقيمة التي تمت تصفيتها) للتحليل إلى وحدة تخزين النهائي من 1 مل. ابحث عن مخازن تستخدم لتخفيف وإعداد LUV مسبق وإعادة استخدام 0.2 ميكرومتر غشاء لإزالة أي الجسيمات العالقة مثل الغبار الذي من شأنه ان يعكر قياسات حجم التوزيع.
2. غسل تدفق غرفة مع الماء نقي للغاية.
3. استخدام علامات سطح التركيز على شعاع ضوء. ضخ ما يقرب من 300 ميكرولتر من عينة الحويصلية المخفف وفورا بإغلاق صمام الخروج لوقف تدفق داخل غرفة التدفق، دون إدخال أي فقاعات الهواء.
4. ضبط التركيز ومصراع الكاميرا / ربح الإعدادات لضمان إشارة تشتت كافية من العينة للكشف.
   ملاحظة: 20-80 إشارات يجب أن تكون واضحة للعيان في مجال الرؤية. منع الاكتظاظ (> 80 الإشارات) كما أن البرنامج لن تكون قادرة على تتبع إشارات الفردية عندما متداخلة.
5. انتقل إلى قرار مجلس الأمن "لقطة"التابعين. ضبط التحكم في درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية ومدة القبض على 90 ثانية باستخدام ضوابط البرنامج. اضغط على "سجل" لبدء تسجيل سلسلة زمنية.
   ملاحظة: عند الانتهاء من سلسلة زمنية يفتح نافذة جديدة.
6. حفظ السلاسل الزمنية في شكل معين (*. افي). لأسباب عملية خلال تحليل دفعة حفظ جميع الملفات في مجلد واحد.
7. فتح صمام الخروج وحقن 300 ميكرولتر آخر في غرفة التدفق. إغلاق صمام وكرر الخطوات من 4،3-4،6 مرتين.
8. بعد الانتهاء من جميع أشواط عينة غسل غرفة التدفق مع 5 مل من الماء نقي للغاية. انتقل إلى شاشة "ما قبل عملية". ضبط درجة الحرارة المعلمات معايرة = 25 درجة مئوية، واللزوجة = 0.91 لعازلة تريس المستخدمة في هذا البروتوكول.
9. فتح نافذة عملية دفعة وتحميل سلسلة الوقت المسجل (المتقدم / دفعة عملية / تعيين ملف 1-3). اضغط على "جو GO" لبدء تحليل حجم التوزيع.
   ملاحظة: أتمتة البرامج التحليليةساتيا يقيس الجسيمات واحدة وتحسب قطر على أساس السلوك الحركي وذلك باستخدام المعايير المحددة في الخطوة 4.8.
   ملاحظة: تحليل توزيع حجم الناتج يحفظ تلقائيا في نفس المجلد مثل ملفات السلاسل الزمنية.
10. بالإضافة إلى إنشاء ملف تقرير لتلخيص النتائج (تصدير / إنشاء تقرير PDF).

5. إعداد حامل رقاقة

1. تزن 1.0 غرام من MDX4 الطبية الصف قاعدة المطاط الصناعي و 0.1 غرام كيل MDX4 علاج في أنبوب رد فعل 50 مل. مزيج كلا تماما مع شريط الزجاج.
2. وضع الأنبوب في المجفف لمدة 1 ساعة لديغا لاصقة. بعد ذلك استخدامها في غضون 30 دقيقة لرقاقة الإلتصاق، كما لاصقة سوف تتصلب ويكون من الصعب جدا للعمل مع.
3. خلال التفريغ المطاط الصناعي (الخطوة 5.1) تنظيف شريحة زجاجية موضوعية تماما مع الكلوروفورم لإزالة أي تلوثات قبل رقاقة الترابط. شطف الشريحة مع 5 مل من الكلوروفورم باستخدام حقنة زجاجية. جمعالكلوروفورم في دورق وضع تحتها. بعد غسل السماح الجافة الشرائح.
   ملاحظة: إجراء هذه الخطوة تحت غطاء الدخان. بديل لالكلوروفورم، والمذيبات العضوية الأخرى مثل الأسيتون يمكن أن تستخدم أيضا.
4. إيداع كمية صغيرة من المواد الرابطة لاصق على الزجاج غطاء باستخدام طرف ماصة (نصائح وضوح الشمس لماصات 10 ميكرولتر). تذكر أن رقائق يجب أن تنسجم مع حامل الشرائح 8 غرفة في وقت لاحق، ويجب أن توضع على الشريحة وفقا لذلك.
5. إزالة بعناية رقاقة واحدة في وقت واحد من لوحة الرقاقة باستخدام الملقط غيض الجميلة وإيداع رقاقة على قطرة من لاصق على الزجاج غطاء. تأكد من أن الجانب المطلي من رقاقة يواجه صعودا.
6. دفع بلطف الشريحة على الغطاء الزجاجي مع الجزء الخلفي من ملاقط PE حادة. للتأكد من أن الغراء يتم الاستغناء بالتساوي تحت الشريحة، الشريحة بعناية الشريحة ذهابا وعودة. خطوة حاسمة: ضمان عدم وجود فقاعات الهواء محاصرون تحت الشريحة، لأنها سوف يزعج التصوير الضوئيمن تجاويف رقاقة في وقت لاحق. أيضا التأكد من أن أي مادة لاصقة يلوث سطح رقاقة.
7. جفف الغطاء الزجاجي النهائي لمدة 2 ساعة على 65 درجة مئوية في مجفف مجلس الوزراء.
   لا تزال مغلفة رقائق مع تنشأ طبقة واقية من تصنيعها الذي يحتاج إلى إزالتها: مذكرة.
8. لإزالة طبقة واقية، نفذ خطوة الغسيل المذيبات متتابعة. خلال علاج من رقائق، تسخين حمام مائي إلى 54 درجة مئوية.
9. ضع 3 أكواب الزجاج في حمام الماء، اثنان منهم مليئة الأيزوبروبانول وشغل واحد مع الأسيتون.
10. تضاف شرائح غطاء زجاجي إلى حامل الشرائح ويغرق في أول الأيسوبروبانول طبق شغل لمدة 10 دقيقة. بعد ذلك نقلها إلى الطبق الأسيتون شغل، واحتضان مرة أخرى لمدة 10 دقيقة قبل نقله للخطوة الغسيل النهائية للطبق الأيسوبروبانول الثاني واحتضان 10 دقيقة أخرى.
11. إزالة حامل الشرائح من الطبق وتغسل بعناية على نطاق واسع مع ultrapurالمياه ه، تليها تجفيف رقائق مع تيار لطيف من غاز النيتروجين.
12. الاقلاع ورقة التصفيح من 8 جيدا لزجة للانزلاق، ووضعها إلى الوراء على مقاعد البدلاء. اختيار بعناية الشريحة الغطاء واضغط بلطف على الشريحة لزجة مع رقائق تواجه الآبار. دعونا الانتهاء من بقية حامل رقاقة لبضع دقائق قبل الاستخدام.

6. إعداد الفحص

ملاحظة: رقائق ثقب النانو لصقها على غطاء زجاجي ومفصولة 8 جيد لزجة الشريحة تمتلك فائدة، ويمكن معالجة ذلك رقائق متعددة في تشغيل تجريبي واحد، مع رقائق الانفصال تماما عن بعضها البعض.

1. بعد إعداد حامل رقاقة، وشطف كل رقاقة مع الإيثانول النقي وضربة الجافة مع غاز النيتروجين، لإزالة أي تلوثات مثل الغبار.
2. تنظيف سطح رقاقة مع الهواء أو الأكسجين أو البلازما النيتروجين. اعتمادا على نوع من وقت فترات التنظيف البلازما تختلف: أداء معالجة بلازما الأوكسجين لمدة 1 دقيقة، والهواء وأحمقروجن البلازما لمدة 5 دقائق عند 0.3 مللي بار في وضع 80٪ من الطاقة (متوسطة القوة RF أو عالية).
3. بعد تنظيف البلازما احتضان رقائق في الإيثانول النقي لمدة 10-15 دقيقة لضمان تجويف التبول.
4. الإيثانول صرف تدريجي لعازلة بإضافة 400 ميكرولتر من العازلة تريس (20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0. العقيمة التي تمت تصفيتها)، تليها خلط من الحل دون إدخال فقاعات الهواء وإزالة لاحقة من 400 ميكرولتر. كرر هذا الإجراء 12 مرات، لضمان إزالة الإيثانول.
   ملاحظة: سوف الإيثانول تكون ضارة للالجسيمات الشحمية وطبقات ثنائية الدهون مع وقف التنفيذ.
5. عازلة للمنشطات تريس (20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0. العقيمة التي تمت تصفيتها) مع 5 ملي CaCl ₂ و 1 ميكرومتر Oy647 صبغ. تماما إزالة غسل العازلة من رقاقة وعلى الفور إضافة المخزن المؤقت مخدر إلى شرائح. ملاحظة: سيتم تغطية رقائق مع فيلم عازلة رقيقة بعد إزالة غسل العازلة، وبالتالي فإن رقاقة ليست على اتصال مباشر مع الهواء، وضمان ترطيب مستمر من تجاويف وسطح رقاقة.
6. إضافة 1 ملغ / مل LUVs أو PROTEO-LUVs في المخزن تريس (20 ملي تريس، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0. العقيمة التي تمت تصفيتها) إلى كل بئر.
   ملاحظة: الحجم النهائي في كل بئر 300 ميكرولتر. النظر في الإضافات اللاحقة للصباغة التحكم والكيميائية معدل MTSET خلال مخدر تريس العازلة بالإضافة.
7. لالدهون تشكيل طبقة ثنائية، والتي تمتد المسام على سطح رقاقة احتضان شريحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الحل الحويصلية. يغسل بعد ذلك كل رقاقة مع 4X 400 ميكرولتر من الكالسيوم ^{2 +} خالية عازلة تريس.
8. إضافة الصبغة السيطرة على كل جانب، مع تركيز النهائي من 5 ميكرومتر. رقائق جاهزة الآن للفحص النبات.

7. إعداد الفحص

1. جبل حامل شريحة المجهر epifluorescence (هدف الهواء 20X، والعمل لمسافات طويلة). التركيز على حافة رقاقة ثقب النانو لإيجاد أكثر سهولة البؤري للتجاويف الصغيرة. مرة واحدة تجاويف هي في التركيز مسح مجموعة ثقب النانو لمنطقة الفي يعرض أعلى ختم النسبة.
   ملاحظة: كل المجهر epifluorescence مقلوب يمكن استخدامها لإجراء فحوصات رقاقة. اعتمادا على التكبير موضوعي (20X - 60X) عدد تجاويف يعاير سوف تختلف، مع ما يصل الى 9000 تجاويف في حقل واحد من العرض باستخدام 20X التكبير. أهداف الهواء مع المسافة العمل الطويلة هي الأفضل. استخدام مقلوب مبائر المجاهر المسح بالليزر (CLSM) هو أيضا ممكن، ولكن الحصول على الصور قد يكون العامل المحدد نظرا لعمق بؤرة محدود.
2. تحسين رقاقة إضاءة.
   ملاحظة: تأكد من أن كل القنوات صبغ لا يتجاوز الحد الأقصى لقيمة مقياس الرمادية، والتغيرات لا يمكن ملاحظتها. للتجارب تصدير ضبط الإضاءة الصبغة translocated إلى 90٪ من قدرة إشارة القصوى. ضبط الصبغة تحكم في تجاويف مفتوحة إلى 80-90٪ من الطاقة القصوى إشارة إلى كشف بوضوح أي ختم غشاء المتسرب.
3. مرة واحدة يتم ضبط جميع القنوات بدء سلسلة زمنية. التقاط صور كل 10-20 حد ذاتهاج لمدة 90 دقيقة.
   ملاحظة: هذا هو كاف لمتابعة بالمثل أحداث معينة وغير محددة هروب رأس المال.
4. تهيئة هروب رأس المال من الركيزة الفلورسنت من خلال إضافة السيستين محددة، موجبة الشحنة MTSET مركب إلى التركيز النهائي من 3 ملم. سماح 5 دقائق على الأقل من وقت التجربة قبل MTSET بالإضافة إلى أن تكون قادرة على إقامة في وقت لاحق على إشارة الفلورسنت مستقرة السابقة الأساس لتوجيه الافتتاح. نستعد دائما حل MTSET الطازجة مباشرة قبل الاستعمال.

تحليل 8. البيانات

1. فتح في الوقت كومة صورة سلسلة مع الإصدار القياسي من يماغيج (ملف / استيراد / تسلسل الصور).
2. إذا مكدسة قنوات الفلورسنت، وتقسيم القنوات في أكوام الفردية لكل قناة (صورة / الأكوام / ستاك إلى الصور).
3. تكرار الصورة الأولى من قناة النبات الركيزة للالعائد على الاستثمار (المناطق ذات الاهتمام) تحديد الهوية (صورة / مكرر).
4. تحويل الصورة إلى صورة ثنائية (صورة / ضبط / عتبة). ضمانأن الخوارزمية المستخدمة يصور إشارات لجميع تجاويف مختومة من دون تداخل غرابة الأطوار.
5. تحديد المناطق ذات الاهتمام مع أداة الجسيمات محلل تلقائيا (تحليل / تحليل الجسيمات). تحديد الحد الأدنى لحجم الجسيمات محددة، لتجنب الضوضاء الجسيمات. التحقق من الخيارات "استبعاد على حواف" و "تشمل الثقوب". تأكد من أن الناتج رويس تعكس نمط microcavity مجموعة. رويس بين المتجاورين والتحف، وبالتالي إزالتها. حفظ قائمة العائد على الاستثمار.
   ملاحظة: المعلمة القياس لابد من تعيين "المجال" قبل تحليل الجزيئات (تحليل / تعيين القياسات / المنطقة)
6. فتح السلاسل الزمنية محلل المكونات في (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html)، الذي تغيير حجم كل رويس تلقائيا إلى نفس الحجم. إعادة حجم كل رويس موجودة إلى عرض / ارتفاع بكسل 6X6 والشكل البيضاوي (الموقت سلسلة محلل / AutoROIProperties). تحقق من خيار "تغيير حجم ROIS الحالية". مما أدى إلى إنقاذ قائمة العائد على الاستثمار حجمها.
7. فتح مدير ROI(تحليل / أدوات / مدير ROI) وتحميل قائمة العائد على الاستثمار حجمها لكل قناة من السلاسل الزمنية (ROI مدير / المزيد / فتح). سيتم متراكبة رويس. لتحليل تغير إشارة لكل العائد على الاستثمار بدء تشغيل أداة قياس متعدد (مدير ROI / المزيد / قياس متعددة)، حدد "قياس جميع شرائح" و "صف واحد لكل شريحة" والبدء في قياس متعددة.
   ملاحظة: المعلمة القياس لابد من تعيين "يعني قيمة الرمادي" لهذه الخطوة (تحليل / تعيين القياسات / يعني قيمة الرمادي)
8. حفظ الجدول الناتج، وإعطاء قيمة الرمادي يعني لكل العائد على الاستثمار في *. TXT أو تنسيق *. XLS.
9. استيراد تحليل العائد على الاستثمار من كل قناة التصوير في NanoCalcFX عبر خيار "استيراد الملف". تعيين "استخدام الخط الأول لتسمية سلسلة". تعيين حجم الخطوة بين الصور وفقا للوقت فترات الحصول على الصور سلسلة واختيار العمود المقابل والفاصل العشري.
10. استخدام الخيار "ورقة متعددة" لربط الرسوم البيانية للفلوو الفردية تلقائياقنوات rescent.
    ملاحظة: يمكن الآن تحليل الأحداث وتصنيفها باستخدام المعلومات التي قدمها 3-لون المعلومات الطيفية.
11. تناسب منحنيات المحدد باستخدام البناء في وظيفة مناسبة (الخيار مناسبا).
    ملاحظة: نفذت هروب رأس المال وتدفق معادلة مناسبة ليمكن تعيين كل الأحداث يحركها نشر monoexponential وحدود مناسبة. مما أدى الثوابت معدل يمكن رسم باستخدام أداة الرسم البياني أو تصديرها لصقل المزيد من البيانات.

النتائج

يمكن بسهولة الأغشية التي تغطي المسام المراد إنشاؤها على سطح رقاقة ذات البنية النانومترية بطريقة الذاتي تجميعها. لكن العملية الأساسية لا تزال حساسة وتتأثر العديد من المعلمات مثل حجم الجسيمات الشحمية، monodispersity من السكان الحويصلية، lamellarity، lipid- والمل?...

Discussion

تقنية المعروضة هنا يسمح للتحليل مواز للغاية من النقل بروتين الغشاء. ويمكن مباشرة أنظمة بروتين الغشاء أعيد تطبيقها على بيوشيب، مما يجعل التكيف من الناحية النظرية كل نقل غشاء أو توجيه ممكن. تحليل النقل يقتصر فقط عن طريق إنشاء نظام تلا الفلورسنت، إما عن طريق تغيير مباش?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
[2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.
1 ml gas-tight syringe	Hamilton	#1001
10 ml round flask	Schott Duran
2.7 mm glas beads	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube	Sarstedt	744304
Acetone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920	need to be activated before first use
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	store dark at -20 °C
Chloroform reagent grade	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	store dark at -20 °C
Ethanol absolute	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Single-use syringe	Braun	460 60 51V
Injekt-F single-use syringe	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)	Avanti Polar Lipids	5416016	store under inert gas at -20 °C
NaCl 99.5% p.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Germany)		available on request
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	store dark at -20 °C
Oy647	Luminartis (Münster/Germany)	OY-647-T-1mg	store dark at -20 °C
Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	column material for size exclusion chromatography
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		curing agent for chip fixation onto cover glass support
sticky-Slide 8-well	ibidi	80828	multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)
Three-way stopcock blue	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter	Roth	NH69.1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Büchi 461 water bath	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Membrane pump	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE microscope	Synentec		available on request
Pump control	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator bath Sonorex RK100H	Brandelin electronic	31200001107477
Vaccum pump RC5	Vaccubrand	1805400204
Water bath W13	Haake	002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	scientific image processing software
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets
NTA 2.3 Analytical Software	Nanosight		data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		temperature controle software for nanoparticle tracking microscope