Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Riepilogo

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Abstract

trasporto proteina di membrana a livello della proteina singolo elude ancora un'analisi dettagliata, se il substrato traslocato non è elettrogenico. Notevoli sforzi sono stati fatti in questo campo, ma le tecniche che permettono automatizzato di analisi trasporto ad alta produttività in combinazione con lipidi tecniche di doppio strato privi di solventi necessari per l'analisi dei trasportatori di membrana sono rari. Questa classe di trasportatori, tuttavia, è cruciale nella omeostasi cellulare e quindi un obiettivo chiave nello sviluppo di farmaci e metodologie per acquisire nuove conoscenze disperatamente bisogno.

Il manoscritto qui presentato descrive la creazione e la gestione di un romanzo biochip per l'analisi di proteine ​​mediata processi di trasporto di membrana con risoluzione singolo trasportatore. Il biochip è composto da microcavità racchiuse da nanopori che è altamente parallelo nel suo design e possono essere prodotti in grado industriale e quantità. liposomi Protein-nutrirebbero possono essere direttamente applicati aila superficie del chip che formano doppi strati lipidici poro-spanning auto-assemblate utilizzando SSM-tecniche (solido supportato membrane lipidiche). Pore-attraversa parti della membrana sono indipendenti, fornendo l'interfaccia per substrato traslocazione dentro o fuori lo spazio della cavità, che può essere seguita da lettura fluorescente multispettrale in tempo reale. La definizione di procedure operative standard (SOP) permette la creazione diretta di doppi strati lipidici proteine ​​ospitare sulla superficie del chip di proteine ​​virtualmente ogni membrana che può essere ricostituito in modo funzionale. L'unico requisito è la creazione di un sistema di read-out fluorescente per substrati di trasporto non elettrogeniche.

applicazioni ad alto contenuto di screening sono attuabile mediante l'uso di microscopi a fluorescenza automatizzati invertiti registrazione chip multipli in parallelo. Grandi insiemi di dati possono essere analizzati utilizzando il software di analisi custom-designed liberamente disponibile. Tre colori multi spettrale fluorescenteread-out, inoltre, consente una discriminazione dati imparziale in diverse classi di eventi, eliminando falsi risultati positivi.

La tecnologia dei chip si basa attualmente su SiO ₂ superfici, ma un'ulteriore funzionalizzazione con superfici di chip d'oro rivestite è inoltre possibile.

Introduzione

L'analisi delle proteine ​​di membrana è diventato di crescente interesse per la ricerca di base e farmaceutica negli ultimi 20 anni. Lo sviluppo di nuovi farmaci dipende identificazione e caratterizzazione dettagliata di nuovi bersagli, attualmente essendo uno dei fattori limitanti. Il fatto che circa il 60% di tutti i bersagli farmacologici sono proteine ​​di membrana ^1, rende lo sviluppo di tecniche per chiarire la loro funzione più importante.

In passato, le tecniche per lo studio dei canali elettrogeniche e trasportatori sono stati sviluppati in moltitudine ^{di 2 - 4.} substrati non elettrogeniche in contrario presentano un compito più impegnativo. Sono comunque di particolare interesse come obiettivi primari droga, come controllano il flusso di soluti e nutrienti attraverso la membrana cellulare e la funzione come recettori chiave in cascate di segnalazione ^5.

considerevole sforzo è stato messo nello sviluppo di techniques per studiare la funzione di trasportatore di membrana ^{6, 7.} I sistemi che utilizzano membrane solidi supportati sono emersi come strumenti più promettenti in questo campo ^{8 - 10,} compreso solidi doppi strati lipidici supportati, bistrati frenati ^{11, 12,} membrane lipidiche microblack ^{13, 14} e nativi array vescicola ^{15, 16} solo per citarne alcuni. Alcuni di loro sono anche disponibili come configurazioni commerciali ^{17, 18.} Alcuni esempi sono stati pubblicati combinando la capacità di studiare singole proteine ​​di membrana in modo altamente paralleli ^{14, 19,} un prerequisito per applicazioni di screening. Tuttavia, questi metodi raramente colmare dalla ricerca di base per l'ambiente industriale. Le difficoltà spesso trovano nella capacità del sistema di essere automatizzabili, la produzione costose e / o preparazione laboriosa. Un approccio overcoming tutti gli ostacoli di cui sopra è l'obiettivo finale.

La tecnica qui presentata è stato sviluppato per studiare canali di membrana e trasportatori in vitro in un ambiente controllato al livello proteico singola ^{20 - 22.} Ricostituzione di proteine ​​di membrana purificate in luvs è molto più stabilito di approcci comparabili per GUVs ^{23 - 26} o lipidi nero membrane ^27. Essi possono essere applicati direttamente alla superficie del chip, dove la formazione doppio strato avviene attraverso un processo di auto-assemblaggio. Il design fondo di vetro del chip nanoporoso (Fig. 1) permette per microscopia dell'aria, che permette l'automazione semplice del sistema. In combinazione con uno stadio motorizzato chip multipli possono essere misurate allo stesso tempo, con ogni campo di vista contenente migliaia di cavità sigillate per l'analisi.

Figura 1. Progettazione di biochip nanopori multiplex. A) una Silicon-on-Insulator (SOI) wafer è strutturata da incisione reattiva ioni di litio. Circa 1.150 singoli chip sono fabbricati da ogni wafer con proprietà identiche e qualità. B) Ogni chip comprende 250.000 microcavità individuali con aperture nano. Barra di scala:. 200 micron C) Ogni cavità è indirizzabile tramite fluorescenza multispettrale read-out. Un blocchi strato superiore non trasparenti i segnali fluorescenti dal serbatoio tampone, rendendo il biochip compatibile con microscopi a fluorescenza invertiti. D) microscopia a forza atomica (AFM) di imaging rivela organizzati uniformemente aperture dei pori e la rugosità superficiale dello strato di biossido di silicio di 3,6 nm (n = 40) ottimale per la fusione delle vescicole. Barra di scala:. 5 micron E) mic elettronico a scansioneimmagine roscopy (SEM) mostra una sezione trasversale attraverso il nanoporo consentendo l'accesso alla cavità femtoliter all'interno del chip di silicio. Questo dato è stato riutilizzato con il permesso di ^21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tutte le analisi dei dati viene effettuata utilizzando freeware per garantire l'accesso senza restrizioni per gli utenti finali. Le serie temporali vengono analizzati utilizzando il software gratuito di elaborazione delle immagini e di una elaborazione batch curva di generazione personalizzata software di analisi che permette e la correlazione diretta di dati di grandi dimensioni con canali fluorescenti multiple e migliaia di curve.

La proteina modello utilizzato in questo protocollo è il canale meccanosensibili di proteine ​​grande conduttanza (MscL) canale derivato da E. coli. Esso funziona come una valvola per rilasciare shock osmotico in natura, ma è stato modificato in modo tale che razionalmente progettato syntfunzionalità hetic possono covalentemente essere fissati al cielo canali costrizione. Via carica-repulsione dell'attivatore legame covalente (MTSET) il canale viene attivato per aprire, la creazione di un nano-valvola. Piccole molecole come ioni, acqua, piccole proteine, ma anche piccoli fluorofori possono permeare attraverso il canale. Qui, la proteina viene utilizzato come modello per dimostrare la capacità del sistema di rilevare la traslocazione di proteine ​​mediata.

Protocollo

1. preparazione di grandi unilamellari vescicole (luvs)

1. Pulire un pallone a fondo tondo (volume 10 ml) con azoto per rimuovere eventuali particelle di polvere. Risciacquare il pallone a fondo tondo con etanolo.
   Nota: etanolo residuo può essere tollerata e non disturba fasi successive.
2. Lavare a 1 ml 4x siringa di vetro con cloroformio, per eliminare ogni contaminazione. Aggiungere 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml in cloroformio) per il pallone a fondo tondo e drogare la soluzione lipidica con un ulteriore ^ATTO DOPE ³⁹⁰ ad una concentrazione finale di 0,1 moli%.
   Nota: Invece di DOPE ^{ATTO 390} altri lipidi fluoroforo marcato o coloranti lipofili può anche essere usato, a seconda delle fonti di eccitazione disponibili.
3. Collegare il pallone a fondo tondo in un evaporatore rotante. Essiccare il film lipidico per 40 min a 300 mbar, 30 ° temperatura del bagnomaria C e la velocità di rotazione massima, per formare un film lipidico omogeneo sulla parete di vetro del pallone.
4. Trasfer pallone in una pompa a vuoto in secca il film lipidico per ulteriori 30 min a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 5 ml di tampone (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; filtrata sterile) e 8 perle di vetro (diametro 2,7 mm, etanolo lavato ed essiccato) al pallone. Collegare il pallone all'evaporatore rotante e ruotare senza vuoto a 50 ° C alla velocità massima.
   Nota: Perle di vetro spostano meccanicamente il film lipidico dalla parete di vetro, che porta a (multilamellare) la formazione di vescicole. Dopo 45 min di rotazione la soluzione appare lattiginosa e nessun film lipidico residua dovrebbe essere visibile sulle pareti pallone. Invece di perline di vetro altri metodi come sonicating il pallone in un bagno d'acqua Sonifier, vortex il pallone o il metodo di reidratazione dolce sono anche applicabili.
6. Trasferire la beuta sotto gas inerte (argon) in un bagno ad ultrasuoni ed ultrasuoni per 4 minuti a temperatura ambiente.
   Nota: Le onde d'urto ad ultrasuoni disturbare i liposomi, che li rende unilamellare.
7. Dividere la soluzione LUVin 1 ml aliquote.
8. Eseguire cicli 5 congelamento / scongelamento congelando la soluzione LUV in azoto liquido, seguita da scongelamento a 40 ° C in un bagno d'acqua.
   Nota: Questo porta alla rottura e riarrangiamento spontanea di singoli liposomi con l'altro, con conseguente aumento di dimensioni.
9. All'ultimo negozio fase di congelamento tutti i campioni a -80 ° C.
   Nota: I luvs saranno stabili per almeno 6 mesi.

2. Proteine ​​Ricostituzione

1. Scongelare 1 ml LUV aliquota sul ghiaccio. Direttamente prima di ricostituzione, estrudere liposomi 17x attraverso una membrana filtro in policarbonato 400 nm utilizzando un mini estrusore.
   Nota: gli aggregati lipidici saranno rimossi e si raggiunge la distribuzione finale dimensione omogenea.
2. Destabilizzare luvs per aggiunta di 4% Triton X-100 (v / v) ad una concentrazione finale di 0,25% (v / v) e incubare per 5 min a 50 ° C.
   Nota: La quantità di liposomi usati in questa fase dipende dalla massa del purificato MscL ^{G 22 C usato (vedi punto 2.3). Purificare MscL G 22 C (derivato da E. coli), come descritto in dettaglio nel 28.}
3. Mescolare purificato MscL ^{G 22 C} e liposomi detergenti saturi da 1:20 (w / w) Rapporto e incubare per altri 30 min a 50 ° C.
4. Per la rimozione del detersivo aggiungere bio-sfere in tampone Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterile filtrato) alla soluzione proteica / liposomi, con 16 mg (peso umido) bio-perle per microlitri detergente utilizzato per destabilizzare liposomi in step 2.2.
5. Eseguire rimozione del detersivo notte (16 ore) a 4 ° C su una piastra rotante.
   Nota: La miscelazione costante della soluzione garantisce massima rimozione del detersivo.
6. Dopo la rimozione detergente negozio proteoliposomi a 4 ° C e utilizzare per esperimenti nello stesso giorno.

Assay 3. Attività

1. Durante la ricostituzione delle proteine ​​prendere un'aliquota di 100 ml di detergent-soluzione proteoliposome destabilizzato dopo aver terminato il passo 2.3.
2. Aggiungere 1 volume di calceina (30 mM) alla soluzione proteica-liposomi e incubare ulteriori 5 min a 50 ° C.
3. Rimuovere il detersivo dalla soluzione come descritto nella fase 2,4-2,6.
4. Dopo la rimozione del detersivo equilibrare una colonna di dimensione-esclusione (20 ml volume del letto o più) con tampone Tris (3x il volume letto).
   Nota: separazione Proteoliposome può essere eseguita a temperatura ambiente, ma mantenendo il campione costantemente a 4 ° C è consigliato per garantire la migliore attività della proteina dopo frazionamento.
5. proteoliposomi separate da calceina libero applicando l'intera aliquota (200 ml) alla colonna di dimensione di esclusione. Lasciare il composto a bagno nella colonna, seguita da eluizione dei proteoliposomi dalla colonna tramite l'applicazione di buffer continuo sulla parte superiore che utilizzano il flusso di gravità. Osservare la calceina contenente proteoliposomi come una banda arancione discreta nella parte anteriore eluizione. Raccogliere frazioni di 500 & #181; l rispettivamente.
   Nota: tintura calceina libero sarà eluire dopo la frazione proteoliposome con la separazione completa.
6. Pipettare 80 ml di ogni frazione su una piastra di micro-bene per lampade fluorescenti read-out e identificare la frazione contenente la più alta quantità di calceina contenenti proteoliposomi tramite emissione di fluorescenza. Rilevare la fluorescenza a 520 nm con eccitazione a 490 nm. Utilizzare la frazione proteoliposome con il segnale più elevato per la seguente saggio di attività.
7. Mescolare 20 ml della frazione proteoliposome contenente con 980 microlitri tampone Tris in una fluorescenza cuvetta 1 ml.
8. Misurare emissione di fluorescenza a 520 nm (eccitazione 490 nm) utilizzando uno spettrofluorometro. Record per 1 min e poi aggiungere 25 ml di MTSET ([2- (trimetilammonio) etil] methanethiosulfonate) da una soluzione madre (160 mm) e mescolare bene. Tenere sulla registrazione durante la miscelazione. Sempre preparare la soluzione di riserva fresco direttamente prima dell'uso.
   Nota: Una volta risolto in tampone MTSET Hydrolyzes entro 30 minuti e sarà non reattivo. MTSET può essere pesato e mantenuta secca aliquota polvere a -20 ° C fino al momento dell'uso.
   Nota: Una volta attivato il canale MscL ^{G 22 C} apre e rilascia il calceina intrappolata, portando ad una diminuzione di concentrazione locale del calceina quando effluxing le proteoliposomi e successiva dequenching del colorante, con conseguente aumento della fluorescenza.
9. Dopo l'emissione di fluorescenza ha raggiunto nuovamente un plateau stabile, solubilizzare i liposomi mediante aggiunta di 50 microlitri Triton X-100 (4% v / v).
   Nota: Idealmente alcun ulteriore aumento della fluorescenza può essere osservato, implicando proteina attiva in ogni liposomi.

4. Formato Misura Distribuzione di luvs uso del monitoraggio delle nano-particelle

1. Si noti che solo i campioni minimi di liposomi o proteoliposome soluzione sono necessari per l'analisi distribuzione delle dimensioni utilizzando il tracker nanoparticelle. Diluire una soluzione di liposomi di 5 mg / ml concentrazione di lipidi 1: 5.000 (v / v) in tampone (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; filtrata sterile) per l'analisi ad un volume finale di 1 ml. Filtrare tutti i buffer utilizzati per la diluizione e la preparazione LUV prima e ricostituzione utilizzando una membrana di 0,2 micron per rimuovere eventuali particelle in sospensione come la polvere che potrebbe disturbare le misurazioni distribuzione delle dimensioni.
2. Lavare il flusso da camera con acqua ultra-pura.
3. Utilizzare i marcatori di superficie di concentrarsi sul fascio di luce. Iniettare circa 300 ml di campione diluito liposomi e chiudere immediatamente la valvola di uscita per arrestare il flusso all'interno della camera di flusso, senza introdurre bolle d'aria.
4. Regolare le impostazioni di messa a fuoco e la macchina fotografica di scatto / guadagno per garantire un adeguato segnale di dispersione del campione per la rilevazione.
   Nota: 20 - 80 segnali devono essere chiaramente visibili nel campo visivo. Evitare il sovraffollamento (> 80 segnali) come il software non sarà in grado di monitorare i singoli segnali quando si sovrappongono.
5. Vai alla scr "Capture"een. Regolare il controllo della temperatura a 25 ° C e la durata di cattura per 90 sec utilizzando i controlli software. Premere il tasto "Record" per avviare la registrazione di una serie di tempo.
   Nota: Al termine della serie storica si apre una nuova finestra.
6. Salvare la serie storica nel formato data (* .avi). Per ragioni pratiche durante l'analisi dei lotti salvare tutti i file in una singola cartella.
7. Aprire la valvola di uscita e iniettare altri 300 microlitri nella camera di flusso. Chiudere la valvola e ripetere i passaggi 4,3-4,6 per due volte.
8. Dopo aver completato tutte le corse di esempio lavare la camera di flusso 5 ml di acqua ultra-pura. Vai alla schermata "Pre-Process". Impostare la temperatura parametri di calibrazione = 25 ° C e viscosità = 0,91 per il buffer Tris utilizzato in questo protocollo.
9. Aprire la finestra di processo batch e caricare il tempo di serie registrato (Advanced Process / batch / Set File 1-3). Premere il tasto "GO" per avviare l'analisi distribuzione delle dimensioni.
   Nota: i automati software analiticocamente tiene traccia delle singole particelle e calcola il loro diametro in base al loro comportamento movimento utilizzando i parametri impostati nel passo 4.8.
   Nota: L'analisi della distribuzione dimensione risultante salva automaticamente nella stessa cartella dei file di serie temporali.
10. Inoltre creare un file di report per riassumere i risultati (Export / Crea rapporto PDF).

5. Chip Holder Preparazione

1. Pesare 1,0 g di MDX4 grado medico di base in elastomero e 0,1 g agente MDX4 indurimento in un tubo di reazione da 50 ml. Miscela sia accuratamente con una bacchetta di vetro.
2. Inserire il tubo in un essiccatore per 1 ora degassare l'adesivo. Successivamente utilizzare entro 30 minuti per il chip incollaggio, come l'adesivo si indurisce e essere troppo difficile da lavorare.
3. Durante elastomero degassamento (passo 5.1) pulire un vetrino obiettivo accuratamente con cloroformio per rimuovere eventuali contaminazioni prima di chip bonding. Lavare il vetrino con 5 ml di cloroformio con una siringa di vetro. raccogliere ilcloroformio in un becher posizionato sotto. Dopo il lavaggio far scorrere secca.
   Nota: Eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante. Alternative al cloroformio, altri solventi organici come acetone possono anche essere utilizzati.
4. Depositare una piccola quantità di materiale legante adesivo sul vetro di copertura utilizzando un puntale (punte di cristallo per pipette 10 ml). Ricordate che i chip hanno per adattarsi nel supporto diapositive 8-camera di seguito e devono essere immessi sul vetrino di conseguenza.
5. Rimuovere accuratamente un chip alla volta dalla scheda wafer con una pinzetta punta fine e depositare il chip sulla goccia di adesivo sul vetro di copertura. Assicurarsi che il lato rivestito del chip rivolto verso l'alto.
6. Premere delicatamente il chip sul vetro di copertura con il dorso di una pinzetta PE smussato. Per garantire che la colla viene erogato in modo uniforme sotto il chip, far scorrere con attenzione il chip avanti e indietro. PUNTO CRITICO: verificare che non ci siano bolle d'aria intrappolate sotto il chip, in quanto disturba imaging otticodelle cavità di chip più tardi. Assicurarsi inoltre che nessun materiale adesivo contamina la superficie del chip.
7. Desiccate il vetro di copertura finito per 2 ore a 65 ° C in un armadio essiccatore.
   Nota: Chip sono ancora rivestite con uno strato protettivo che deriva dalla loro fabbricazione che deve essere rimosso.
8. Per rimuovere lo strato protettivo, effettuare una fase di lavaggio con solvente sequenziale. Durante la polimerizzazione di chip, preriscaldare un bagno di acqua a 54 ° C.
9. Mettere 3 bicchieri di vetro nel bagno d'acqua, due dei quali riempiti con isopropanolo e uno pieno di acetone.
10. Inserire il vetro di copertura chip in un supporto per diapositive e immergerlo nel primo piatto pieno isopropanolo per 10 min. Successivamente trasferirlo al piatto acetone riempito, incubare ancora per 10 min prima di trasferire per la fase di lavaggio finale per il secondo piatto isopropanolo e incubare altri 10 min.
11. Rimuovere il supporto per diapositive dal piatto e con attenzione lavare a lungo con Ultrapure acqua, seguito da essiccazione i chip con una leggera corrente di azoto.
12. Take-off il foglio di laminazione dal 8-ben appiccicoso-scivolo e metterlo a ritroso in panchina. prendere con cautela il vetrino coperchio e premere delicatamente sul appiccicoso-slide con i chip che affrontano i pozzi. Lasciare riposare finito titolare di chip per un paio di minuti prima dell'uso.

6. Assay Preparazione

Nota: chip nanoporo incollati ad un vetro di copertura e separati da 8 ben appiccicoso-slide possedere vantaggio, che più chip possono essere affrontate in una singola prova sperimentale, con chip di essere completamente separati tra loro.

1. Dopo la preparazione titolare di chip, lavare ogni chip con etanolo puro e asciugare con azoto gassoso, per rimuovere eventuali contaminazioni come polvere.
2. Pulire la superficie del chip con aria, ossigeno o plasma di azoto. A seconda del tipo di plasma pulizia periodi di tempo variare: effettuare il trattamento al plasma di ossigeno per 1 min, aria e nitplasma Rogen per 5 minuti a 0,3 mbar a livello di potenza 80% (media potenza RF o alta).
3. Dopo la pulizia del plasma incubare chips in etanolo puro per 10-15 minuti al fine di garantire la cavità bagnatura.
4. Graduale etanolo cambio di tampone aggiungendo 400 ml di tampone Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; filtrata sterile), seguita da miscelazione della soluzione senza introdurre bolle d'aria e successiva rimozione di 400 microlitri. Ripetere questa procedura per 12 volte, per garantire la rimozione di etanolo.
   Nota: L'etanolo sarebbe dannoso per liposomi e doppi strati lipidici sospesi.
5. Dope tampone Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterile filtrato) con 5 mM CaCl ₂ e 1 mM Oy647 colorante. Rimuovere completamente il tampone di lavaggio dal chip e aggiungere immediatamente il buffer drogato al chip. Nota: Chips saranno coperti con una pellicola sottile di buffer dopo la rimozione del tampone di lavaggio, in modo che il chip non è a diretto contatto con l'aria, garantendo una bagnatura costante delle cavità e la superficie del chip.
6. Aggiungere 1 mg / ml luvs o Proteo-luvs a tampone Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterile filtrata) in ciascun pozzetto.
   Nota: Il volume finale in ciascun pozzetto è di 300 ml. Considerate successive aggiunte di colorante controllo e il modificatore MTSET chimica durante drogato Inoltre tampone Tris.
7. Per lipidico formazione doppio strato di pori estende sulla superficie del chip incubare il chip per 1 ora a temperatura ambiente con la soluzione di liposomi. Successivamente lavare ogni chip con 4x 400 ml di Ca ^{2 +} -free tampone Tris.
8. Aggiungere il colorante di controllo per ogni pozzetto, con una concentrazione finale di 5 mM. I chip sono ora pronti per il test traslocazione.

7. Setup Assay

1. Montare il supporto di chip al microscopio a epifluorescenza (obiettivo 20X aria, lunga distanza di lavoro). Focus sul bordo del chip nanoporo per trovare facilmente il piano focale delle microcavità. Una volta che le cavità sono a fuoco la scansione della matrice nanoporo per una regione esimoa schermi più alto rapporto di tenuta.
   Nota: Ogni microscopio a epifluorescenza invertito può essere utilizzato per eseguire test di chip. A seconda del ingrandimento dell'obiettivo (20X - 60X) il numero di cavità dosati varia, con fino a 9.000 cavità in un unico campo visivo usando 20 ingrandimenti. obiettivi aria con una lunga distanza di lavoro sono preferibili. L'uso di microscopi invertiti scansione laser confocale (CLSM) è anche possibile, ma acquisizione immagine potrebbe essere il fattore limitante causa della limitata profondità di fuoco.
2. Ottimizzare l'illuminazione chip.
   Nota: assicurarsi che entrambi i canali di tintura non superino il valore massimo della scala di grigi, in quanto non possono essere osservati cambiamenti. Per gli esperimenti di esportazione regolare l'illuminazione del colorante traslocato al 90% della capacità massima del segnale. Regolare il colorante di controllo in cavità aperte al 80-90% della capacità massima del segnale di individuare chiaramente qualsiasi tenuta della membrana che perde.
3. Una volta che tutti i canali sono regolati iniziare la serie storica. Prendere immagini ogni 10-20 SEc per 90 min.
   Nota: Questo è sufficiente per seguire allo stesso modo eventi specifici e non specifici di efflusso.
4. Inizializzare efflusso del substrato fluorescente con l'aggiunta di specifici cisteina, carica positiva MTSET composto ad una concentrazione finale di 3 mM. Lasciare almeno 5 min di runtime esperimento prima MTSET oltre ad essere in grado di stabilire in seguito un segnale fluorescente stabile basale prima incanalare apertura. Sempre preparare soluzione MTSET freschi direttamente prima dell'uso.

Analisi 8. Dati

1. Aprire la pila di serie storiche con una versione standard di ImageJ (File / Importa / Image Sequence).
2. Se i canali fluorescenti sono impilati, dividere i canali in singole pile per ogni canale (Immagine / Stacks / Pila per Immagini).
3. Duplicare la prima immagine del canale substrato traslocazione di ROI (regioni di interesse) identificazione (Immagine / Duplica).
4. Convertire l'immagine in un'immagine binaria (Immagine / Regola / Threshold). Garantireche l'algoritmo utilizzato raffigura segnali per tutte le cavità sigillate senza sovrapposizioni pixilation.
5. definire automaticamente le regioni di interesse con lo strumento analizzatore di particelle (Analisi / Analisi delle particelle). Definire una dimensione minima delle particelle definite, per evitare il rumore delle particelle. Controllare le opzioni "escludere sui bordi" e "includere buchi". Assicurarsi che ROI derivanti riflettono il modello di matrice microcavità. ROI Interjacent sono artefatti, quindi rimuoverli. Salvare l'elenco ROI.
   Nota: il parametro di misura deve essere impostato a "zona" prima analisi delle particelle (Analisi / Set Misure / Area)
6. Aprire il plug-in Time Series Analyzer (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), che ridimensiona automaticamente tutte le ROI alla stessa dimensione. Ridimensionare tutte le ROI esistente ad una larghezza / altezza di 6x6 pixel e la forma ovale (Timer Serie Analyzer / AutoROIProperties). Selezionare l'opzione "Resize ROIS esistente". Salvare l'elenco ROI ridimensionata risultante.
7. Aprire il manager ROI(Analisi / Strumenti / ROI Manager) e caricare l'elenco ROI ridimensionata per ciascun canale delle serie storiche (ROI Manger / Altro / Open). ROI sarà sovrapposta. Per analizzare la variazione del segnale per ogni ROI avviare lo strumento di misura Multi (ROI Gestore / Altro / Misura Multi), selezionare "Misura tutte le sezioni" e "una riga per fetta" e avviare la misura più.
   Nota: il parametro di misura deve essere impostato a "valore di grigio significare" in questa fase (Analisi / Set Misure / valore medio grigio)
8. Salvare la tabella risultante, dando il valore di grigio medio per ogni ROI in * .txt o * formato .xls.
9. Importa l'analisi del ROI di ogni canale di imaging nella NanoCalcFX tramite l'opzione "Importa file". Impostare "Usa prima linea per la denominazione della serie". Impostare il passo tra le immagini in base ai periodi di acquisizione di immagini serie temporali e scegliere la colonna corrispondente e separatore decimale.
10. Utilizzare l'opzione "scheda multipla" di correlare automaticamente i grafici del singolo fluocanali fluore-.
    Nota: Gli eventi possono essere analizzati e classificati utilizzando le informazioni fornite dalle informazioni spettrali a 3 colori.
11. Montare le curve selezionate utilizzando il-in costruzione funzione in forma (opzione in forma).
    Nota: L'equazione efflusso e afflusso implementato è adatto per tutti gli eventi di diffusione-driven monoesponenziali e confini in forma possono essere impostati. Risultanti costanti di velocità possono essere tracciati con lo strumento istogramma o esportati per la raffinatezza ulteriori dati.

Risultati

membrane Pore-spanning possono essere facilmente creati sulla superficie del chip nanostrutturata in maniera auto-assemblati. Tuttavia il processo di fondo è ancora delicata e influenzato da molti parametri come la dimensione dei liposomi, monodispersity della popolazione liposomi, lamellarity, lipid- e le proprietà del sale di concentramento e di superficie chimica. La maggior parte di questi parametri sono stati accuratamente caratterizzato e standardizzato nel protocollo di cui sopr...

Discussione

La tecnica qui presentata permette un'analisi altamente parallela di trasporto delle proteine ​​di membrana. sistemi proteici di membrana ricostituiti possono essere direttamente applicati al biochip, rendendo l'adattamento teoricamente ogni trasportatore di membrana o canale possibile. Analisi dei trasporti è limitata solo dalla creazione di un sistema di read-out a fluorescenza, sia attraverso il passaggio diretto di fluorescenza (traslocazione di fluorofori o substrati fluorescente) o il cambiamento di f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
[2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.
1 ml gas-tight syringe	Hamilton	#1001
10 ml round flask	Schott Duran
2.7 mm glas beads	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube	Sarstedt	744304
Acetone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920	need to be activated before first use
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	store dark at -20 °C
Chloroform reagent grade	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	store dark at -20 °C
Ethanol absolute	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Single-use syringe	Braun	460 60 51V
Injekt-F single-use syringe	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)	Avanti Polar Lipids	5416016	store under inert gas at -20 °C
NaCl 99.5% p.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Germany)		available on request
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	store dark at -20 °C
Oy647	Luminartis (Münster/Germany)	OY-647-T-1mg	store dark at -20 °C
Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	column material for size exclusion chromatography
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		curing agent for chip fixation onto cover glass support
sticky-Slide 8-well	ibidi	80828	multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)
Three-way stopcock blue	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter	Roth	NH69.1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Büchi 461 water bath	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Membrane pump	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE microscope	Synentec		available on request
Pump control	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator bath Sonorex RK100H	Brandelin electronic	31200001107477
Vaccum pump RC5	Vaccubrand	1805400204
Water bath W13	Haake	002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	scientific image processing software
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets
NTA 2.3 Analytical Software	Nanosight		data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		temperature controle software for nanoparticle tracking microscope