Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Özet

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Özet

transloke substrat olmayan electrogenic ise tek bir protein düzeyinde membran proteini taşıma hala detaylı analizler kaçıyor. Kaydadeğer çaba bu alanda yapılmış, ancak zar taşıyıcıları analizi için gerekli olan solvent içermeyen çift katlı lipid teknikleri ile birlikte otomatik yüksek verimli taşıma analizi sağlayan teknikler nadirdir. taşıyıcıların Bu sınıf, ancak hücre homeostazında önemli ve bu nedenle ilaç geliştirme ve yeni anlayışlar kazanmak için metodolojiler önemli bir hedef umutsuzca ihtiyaç olduğunu.

Burada sunulan el yazması tek taşıyıcı çözünürlükte membran proteini aracılı taşıma süreçlerinin analizi için yeni bir Biochip kurulmasını ve kullanımını açıklar. biyoçip tasarımında oldukça paraleldir ve endüstriyel cins ve miktarda üretilebilir nanopores çevrelediği, mikro boşlukların üst oluşmaktadır. Protein Barınma lipozomlar doğrudan uygulanabilirSSM-teknikleri kullanarak kendini monte gözenek kapsayan çift katlı lipit katmanını oluşturan yonga yüzeyi (katı lipid membranlar desteklenir). membran parçaları, müstakil içine veya gerçek zamanlı multi-spektral floresan okuma ile takip edilebilir kavite alanı, dışarı substrat translokasyonu için arayüz sağlıyor Gözenek kapsayan. standart operasyon prosedürleri (SOP) kurulması işlevsel yeniden olabilir hemen hemen her membran proteini çip yüzeyinde protein barındıran lipit tabakalarının kolay kurulmasını sağlar. tek ön şart olmayan electrogenic taşıma yüzeyler için bir floresan okuma-out sistemi kurulmasıdır.

Yüksek içerik tarama uygulamaları paralel olarak birden fazla fiş kayıt otomatik ters floresan mikroskop kullanılarak accomplishable vardır. Büyük veri kümeleri serbestçe kullanılabilir özel tasarlanmış bilgisayar programları kullanılarak analiz edilebilir. Üç renkli çoklu spektral floresanOkuması ayrıca yanlış pozitif sonuçlar ortadan kaldırarak, farklı olay sınıflarına tarafsız veri ayrımcılık sağlar.

Chip teknolojisi şu anda SiO ₂ yüzeylere göre, ama altın kaplamalı yonga yüzeyleri kullanılarak daha fonksiyonlandırmalar da mümkündür edilir.

Giriş

membran proteinlerinin analizi son 20 yılda temel ve ilaç araştırmaları için artan ilgi haline gelmiştir. yeni ilaçların geliştirilmesi halen kısıtlayan faktörlerden biri olan tanımlanması ve yeni hedefler detaylı karakterizasyonu bağlıdır. Tüm ilaç hedefleri yaklaşık% 60 zar proteinleri ¹ olması, tekniklerin geliştirilmesi fonksiyonları önemli aydınlatmak için yapar.

^{4 -} Geçmişte, electrogenic kanalları ve taşıyıcıları çalışma teknikleri ² sayıda geliştirilmiştir. Aksine olmayan electrogenic yüzeyler daha zorlu bir görev sunuyoruz. Onlar kaskadlar ⁵ sinyal kilit reseptörler olarak hücre zarı ve fonksiyonu üzerinde çözünen ve besin akışını kontrol gibi onlar, ancak ana ilaç hedefleri olarak özel bir öneme sahiptir.

Önemli çaba t gelişimi girmiştirtekniki membran transport proteinleri ^{6, 7} işlevini incelemek için. Birkaç isim katı desteklenen lipid bilayers, gergin bilayers ^{11, 12,} microblack lipit membranlar ^{13, 14} ve yerli vezikül dizileri ^{15, 16} olmak üzere ^{10, -} Katı destekli membranlar kullanılarak Sistemleri bu alanda ⁸ olarak en umut verici araçlar ortaya çıkmıştır. Bazıları ticari kurulumları ^{17, 18} hatta mevcuttur. Bazı örnekler son derece paralel bir şekilde ^{14, 19,} tarama uygulamaları için bir ön koşul olarak, tek zar proteinleri çalışma yeteneği birleştiren yayınlanmıştır. Ancak, bu yöntemler nadiren endüstriyel ortamlarda temel araştırma köprü. güçlükler çoğu otomatikleştirilebilir için sistemin özelliği, yüksek maliyetli üretim ve / veya zahmetli hazırlanmasında uzanmaktadır. Bir yaklaşım oYukarıda açıklanan tüm engelleri aşılabilir nihai amaçtır.

^{22 -} Burada sunulan teknik tek bir protein düzeyinde ²⁰ kontrollü bir ortamda in vitro membran kanalları ve taşıyıcıları incelemek için geliştirilmiştir. ²⁶ ya da siyah lipit membranlar ^{27 -} luvs içine saflaştırılmış membran proteinlerinin Sulandırma daha GUVs ²³ karşılaştırılabilir yaklaşımlara göre kurulmuştur. Direkt olarak iki katmanlı oluşum şeklinde kendini montaj işlemi ile gerçekleşiyor yonga yüzeyi, uygulanabilir. Nano-gözenekli çip (Şek. 1) ve cam alt tasarım sistemi basit otomasyon izin hava mikroskopi için izin verir. motorlu bir sahne ile birlikte çoklu cips analiz için mühürlü boşlukların binlerce içeren görüş her alanı ile aynı anda ölçülebilir.

Şekil 1. Çoklanmış nanopore bioçipler tasarımı. A) silikon üzerinde yalıtkan (SOI) gofret reaktif iyon dağlama ile yapılandırılmıştır. Yaklaşık 1,150 ayrı cips aynı özellikleri ve kalite. B) Her çip nano delikler ile 250.000 bireysel, mikro içermektedir her gofret imal edilmektedir. Ölçek çubuğu:. 200 mikron C) Her oyuk multi-spektral floresan okuma-out üzerinden adreslenebilir. Ters floresan mikroskobu. D) Atomik kuvvet mikroskobu ile biyoçip uyumlu hale bir şeffaf üst tabaka blokları tampon hazneden floresan sinyalleri (AFM) görüntüleme eşit (gözenek açıklıkları ve 3.6 nm silikon dioksit tabakasının yüzey pürüzlülüğü düzenlenmiş ortaya koymaktadır n = vezikül füzyon 40) optimum. Ölçek çubuğu:. 5 mikron E) Taramalı elektron mikrofonfloroskop (SEM) görüntüsü silikon çip içinde femtoliter boşluklara erişim sağlayan nano-gözeneklere enine kesitini göstermektedir. Bu rakam ²¹ izni ile yeniden yapıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tüm veri analizi, son kullanıcılar için sınırsız erişim sağlamak için ücretsiz kullanarak gerçekleştirilir. Zaman serisi ücretsiz görüntü işleme yazılımları ve özel bir yapı eğrisi analiz yazılımı sağlayan toplu işleme ve eğrilerin çoklu floresan kanalları ve binlerce büyük veri kümelerinin basit korelasyon kullanılarak analiz edilmektedir.

Bu protokolde kullanılan model proteini E. türetilen büyük iletkenlik (MSCL) kanal proteinin mechanosensitive kanal E. coli. Doğada ozmotik şok serbest bırakmak için bir valf olarak davranır, fakat rasyonel SYNT tasarlanmış bir şekilde değiştirildiinfographie işlevleri kovalent kanal daralma tarafına monte edilebilir. Nano-valf oluşturarak kanal açmak için tetiklenir kovalent bağlı aktivatör (MTSET) şarj-itme Via. iyonları, su, küçük proteinler, aynı zamanda küçük fluorophores gibi küçük moleküller kanalından nüfuz edebilir. Burada, bir protein, protein aracılı translokasyon algılamak üzere yeteneğini göstermek için bir model olarak kullanılır.

Protokol

Büyük tek tabakalı veziküller 1. Hazırlama (LUVler)

1. toz parçacıkları çıkarmak için azot gazı ile bir tabanı yuvarlak bir şişe (10 ml hacim) temizleyin. etanol ile tabanı yuvarlak bir şişe durulayın.
   Not: Kalıntı etanol tolere edilebilir ve daha sonraki adımlar rahatsız etmez.
2. Herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için, kloroform ile 1 ml cam şırınga 4x yıkayın. Yuvarlak tabanlı bir şişeye 4 mi SoyPC20, kloroform (25 mg / ml) ilave edin ve 0.1 mol% 'bir son konsantrasyona kadar ilave DOPE ^{ATTO 390} lipid çözeltisi katkı yapılmasını.
   Not: yerine DOPE ^{ATTO 390} diğer fluoroforla işaretlenmiş lipidlerin ya da lipofilik boyalar da kullanılabilir, uygun uyarım kaynağa göre değişir.
3. bir döner buharlaştırıcı yuvarlak tabanlı şişeye bağlayın. Şişenin cam duvar üzerinde homojen bir lipid film meydana getirmek üzere, 300 mbar, 30 ° C su banyosu sıcaklığı ve maksimal bir dönme hızı ile 40 dakika için bir lipid film kurutun.
4. transfer, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüksek vakumlu bir pompa ve kuru lipit film bir şişe.
5. ve şişeye 8 cam boncuk (2.7 mm çap, etanol ile yıkandı ve kurutuldu) 5 ml tampon (steril filtre edildi, 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.0) eklenir. döner buharlaştırıcı için şişeyi bağlayın ve maksimum hızda 50 ° C'de vakum olmadan döndürün.
   Not: Cam boncuk mekanik (çok katmanlı) vezikül oluşumuna yol açan, cam duvarından lipit filmi yerinden. 45 dk dönme sonra çözelti sütlü görünür ve hiçbir kalıntı lipid filmi şişesi duvarları görünür olmalıdır. Bunun yerine cam boncuklar balon ya da hafif rehidrasyon yöntemi vorteks, bir su banyosu Sonifier şişenin sonike gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
6. oda sıcaklığında 4 dakika boyunca bir ultrason banyosunda sonikasyon atıl gaz (argon) altında bir şişeye aktarın.
   Not: ultrason şok, bunları tek katmanlı hale lipozomlar bozabilir.
7. LUV çözüm bölmek1 mL alikotlara.
8. sıvı nitrojen içinde LUV çözeltisi dondurularak 5 donma / çözülme devrelerine gerçekleştirmek, bir su banyosu içinde 40 ° C 'de çözülme eklenmiştir.
   Not: Bu boyut, bir artışa yol açan, yırtılabilir ve birbirleri ile tek tek lipozomlar kendiliğinden yeniden düzenleme yol açar.
9. son donma adım mağazasında -80 ° C'de tüm örnekler.
   Not: luvs en az 6 ay süreyle stabil olacaktır.

2. Protein Sulandırma

1. buz üzerinde 1 ml LUV kısım Çözülme. Doğrudan rekonstitüsyondan önce, küçük bir ekstrüder kullanılarak 400 nm'lik bir polikarbonat filtre zarı içinden lipozomlar 17x a'ya.
   Not: lipit agregaları kaldırılır ve son homojen boyut dağılımı ulaşılır.
2. % 0.25 nihai konsantrasyona kadar% 4 Triton X-100 (v / v) ilavesi ile luvs destabilize (h / h) ve 50 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
   Not: Bu aşamada kullanılan lipozomların miktarı saflaştınlmış MsCl ^G 22 ^{° C} (adım 2.3) kullanılır. ²⁸ detaylı olarak tarif edildiği gibi (E-koliden türetilen) MsCl ^{G 22 C} saflaştınlır.
3. Oranı (ağırlık / ağırlık): 1:20 MsCl ^{G 22 C} ve deterjan ile doymuş lipozomlar saflaştırılmış ve 50 ° C'de 30 dakika daha inkübe karıştırılır.
4. Deterjan uzaklaştırılması için Tris tamponu içinde biyo-boncuklar ilave (20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.0, steril filtre edilmiş) protein / lipozom çözeltisine, 16 mg (ıslak ağırlık) biyo-boncuklar başına lipozomlar destabilize için kullanılan deterjan ul 2.2 adım.
5. dönen bir plaka üzerinde 4 ° C'de gece boyunca deterjan kalıntısı (16 saat) uygulayın.
   Not: çözeltinin sabit karıştırma optimum deterjan kaldırılmasını sağlar.
6. 4 ° C 'de, deterjan çıkarma deposu proteoliposomes sonra aynı gün deney için kullanımı.

3. Aktivite Deneyi

1. Protein sulandırma sırasında -deterjan- bir 100 ul tablet almakadımı 2.3 bitirdikten sonra destabilize proteoliposome çözüm.
2. Protein-lipozom çözeltisine kalsein 1 hacim (30 mM) ilave edilir ve 50 ° C'de ilave edilip 5 dakika inkübe edilir.
3. 2.6 - adım 2.4 de tarif edildiği gibi solüsyondan deterjan çıkarın.
4. Deterjan çıkarılmasından sonra Tris tamponu (yatak hacmi 3x) ile bir boyut-eksklüzyon kolonu (20 ml yatak hacmi ya da daha fazla) dengelenmesi.
   Not: Proteoliposome ayrılması, ancak fraksiyonasyon sonra en iyi protein aktivitesini sağlamak için tavsiye edilir, 4 ° C'de sürekli olarak numune tutma, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.
5. Boyut dışlama kolonundan tamamını kısım (200 ul) uygulanarak serbest kalsein ayırın proteoliposomes. Karışım, yer çekimi akımı kullanılarak üzerine sürekli tampon uygulaması ile sütundan proteoliposomes tasfiye edilir, sütuna bekletin. elüsyon önünde ayrı bir turuncu bant olarak proteoliposomes içeren kalsein gözlemleyin. 500 & # fraksiyonlarını toplamak181 sırasıyla l.
   Not: Ücretsiz Calcein boya tam ayrılma ile proteoliposome fraksiyonu sonra Zehir.
6. Pipet için bir mikro-plaka üzerine her fraksiyonun 80 ul floresan okunur ve floresan emisyonu ile kalsein ihtiva proteoliposomes en yüksek miktarda içeren fraksiyonu tanımlar. 490 nm'de eksıtasyonla 520 nm'de floresans algılama. Aşağıdaki aktivite deneyi için, en yüksek sinyal proteoliposome bölümünü kullanır.
7. 1 ml'lik bir flüoresan küvet içinde 980 | il Tris tamponu ile proteoliposome içeren fraksiyon 20 ul karıştırın.
8. Bir spektroflorometre kullanılarak 520 nm (uyarma 490 nm) floresan emisyon ölçün. 1 dakika için kayıt ve daha sonra bir stok çözeltisinden (160 mm) arasında MTSET 25 ul ([2- (trimetilamonyum) etil] methanethiosulfonate) ekleyin ve iyice karıştırın. Karıştırma sırasında kayıt tutmak. Daima doğrudan Kullanmadan önce taze stok solüsyon hazırlanır.
   Not: Tampon MTSET hidroliz çözülmesi kez30 dakika içinde, S ve reaktif olmayan olacaktır. MTSET tartılmış ve kullanılana kadar -20 ° C'de kuru bir toz kısım tutulabilir.
   Not: Bir kez MsCl ^{G 22 C} Kanal floresans emisyonunun bir artışa neden olur, proteoliposomes ve boya daha sonra dequenching effluxing zaman kalseinin lokal konsantrasyonu azalmaya yol tutulmuş kalsein açılır ve serbest bırakır aktif.
9. floresans emisyon daha kararlı bir platoya eriştikten sonra, 50 ul Triton X-100 eklenmesi ile lipozomlar çözünür (% 4 v / v).
   Not: İdeal daha fazla floresan artış görülebilir, her lipozom aktif protein ima.

Nano-parçacık Takip Kullanma luvs 4. Boyut Dağılımı Ölçümü

1. lipozom veya proteoliposome çözeltinin çok az örnekleri nanopartikül izleyici kullanarak boyutu dağılımı analizi için gerekli olduğuna dikkat edin. 5 mg / m arasında bir lipozom solüsyonu ile seyreltilirl lipid konsantrasyonu 1: 5000 (hacim / hacim) tampon maddesi (20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.0; steril filtre) 1 ml'lik bir nihai hacme kadar analiz için. boyut dağılımı ölçümleri rahatsız olur toz gibi herhangi bir asılı parçacıklar kaldırmak için bir 0.2 mikron membran kullanılarak seyreltme ve önceki LUV hazırlanması ve Sulandırma için kullanılan tüm tamponları Filtresi.
2. Ultra saf su ile akış odasının yıkayın.
3. ışık demeti odaklanmak için yüzey belirteçleri kullanın. seyreltilmiş lipozom örnek yaklaşık 300 ul enjekte edilir ve derhal hava kabarcıkları tanıtma olmadan, akış odasının içine akışını durdurmak için çıkış vanasını kapatın.
4. tespiti için numune yeterli saçılma sinyalini sağlamak için odak ve kamera deklanşör / kazanç ayarlarını yapın.
   Not: 20 - 80 sinyalleri görüş alanında açıkça görünür olmalıdır. Yazılım örtüşen tek tek sinyalleri izlemek mümkün olmayacak gibi aşırı kalabalık (> 80 sinyalleri) önleyin.
5. "Yakalama" scr giteen. 25 ° C'ye kadar bir sıcaklık kontrolü ve yazılım kontrolleri kullanarak 90 saniye yakalama süresini ayarlayın. Basın "Kayıt" Bir zaman serisi kaydetmeye başlamak için.
   Not: Yeni bir pencere açılır zaman serisi tamamlayan.
6. Verilen formatta zaman serisini kaydetmek (* .avi). Toplu analizi sırasında pratik nedenlerden dolayı, tek bir klasördeki tüm dosyaları kaydedin.
7. çıkış vanasını açın ve akış odasına başka 300 ul enjekte edilir. vanasını kapatın ve tekrar 4.3 adımları - iki kez 4.6.
8. tamamladıktan sonra tüm numune çalışır 5 ml ultra saf su ile akış odası yıkayın. "Pre-Süreci" ekranına gidin. Bu protokolde kullanılan Tris tamponu için kalibrasyon parametreleri sıcaklık = 25 ° C ve viskozitesi = 0.91 ayarlayın.
9. Toplu işlem penceresini açın ve kaydedilen zaman serileri (İleri / Toplu İşlem / Set Dosya 1-3) yükleyin. Basın boyutu dağılımı analizi başlamak için "GO".
   Not: Analitik yazılım automatiCally tek parçacıkları izler ve adım 4.8 ayarlanan parametreler kullanılarak onların hareket davranışlarına göre kendi çapını hesaplar.
   Not: Elde edilen boyut dağılımı analizi zaman serisi dosyaları aynı klasöre otomatik olarak kaydeder.
10. Ayrıca sonuçlar (İhracat / Rapor PDF Oluştur) özetlemek için bir rapor dosyası oluşturun.

5. Çip Tutucu Hazırlık

1. 50 ml'lik bir reaksiyon tüpüne MDX4 tıbbi sınıf elastomer baz ve 0.1 g MDX4 sertleştirici madde 1.0 g tartılır. Bir cam çubuk ile iyice hem karıştırın.
2. gaz çıkışına 1 saat yapıştırıcı için bir desikatöre içine tüp koyun. Yapışkan sertleşmesine ve çalışmak için çok zor olacak gibi sonradan, yonga yapıştırma için 30 dakika içinde kullanabilirsiniz.
3. elastomer gaz alma (adım 5.1) sırasında çip bağ önce kirlilikler giderilmelidir kloroform ile iyice objektif bir cam slayt temizleyin. kloroform 5 mi cam şırınga kullanılarak slayt durulayın. toplamakalttan bir konuma bir beher içinde kloroform. Yıkadıktan sonra slayt kurumaya bırakın.
   Not: davlumbaz altında bu adımı gerçekleştirin. kloroform alternatif, aseton gibi diğer organik çözücüler de kullanılabilir.
4. bir pipet ucu (10 ul pipetler için kristal ipuçları) kullanılarak cam üzerine yapıştırma malzeme küçük bir miktar. cips daha sonra 8 odacıklı slayt tutucuya sığabilecek ve buna göre slaytta yerleştirilmesi gerekir unutmayın.
5. Dikkatle ince uçlu cımbız kullanarak gofret kurulu bir seferde bir çip kaldırmak ve kapak camına yapıştırıcı damla çip yatırmak. çipin kaplamalı tarafı yukarı baktığından emin olun.
6. Yavaşça künt PE cımbız arka kapak camına çip itin. tutkal çip altında eşit dağıtıldığı emin olmak için dikkatlice ileri ve geri çip kaydırın. KRİTİK ADIM: optik görüntüleme rahatsız edecek şekilde, hiçbir hava kabarcığı çip altında sıkışıp emin olunDaha sonra çip boşlukların. Ayrıca hiçbir yapıştırıcı malzeme yonga yüzeyi kirlenmektedir emin olun.
7. Bir kabin kurutucu içinde 65 ° C 'de 2 saat süre ile işlenmiş cam kapak ile kurutun.
   Not: Patates cipsi çıkarılmış gereken bunların üretimi ile ilgili bir koruyucu tabaka menşeli ile kaplanır.
8. koruyucu tabaka kaldırmak için, sıralı bir çözücü yıkama adımı gerçekleştirmek. cips kürlenme sırasında, 54 ° C'de bir su banyosu ısıtın.
9. su banyosu içine 3 cam bardak, ikisi izopropanol ile doldurulmuştur ve bir aseton ile doldurulmuştur yerleştirin.
10. Bir slayt tutucunun içine çip kapak cam yerleştirin ve 10 dakika boyunca ilk izopropanol dolu çanak içine daldırın. Daha sonra, aseton dolu çanak transfer ikinci izopropanol çanak son yıkama aşaması için aktarmadan önce, 10 dakika süreyle tekrar inkübe ve başka bir 10 dakika kuluçkalayın.
11. çanak slayt tutucu çıkarın ve dikkatlice Ultrapur ile yoğun yıkayınazot gazı hafif bir akımı ile fiş ardından kurutma e su.
12. 8-de yapışkan-slayt laminasyon sayfasını-çıkar ve bankta geriye koydu. Dikkatle kapak slayt pick up ve yavaşça kuyular bakan çipleri ile yapışkan slayt üzerine basın. Kullanmadan önce birkaç dakika için bitmiş çip tutucu dinlendirin.

6. Testinin Hazırlanması

Not: Nanopore cips parası sahip bir kapak cam yapıştırılmış ve 8 de yapışkan slayt ile ayrılmış, birden fazla cips cips tamamen birbirinden ayrılmış olması ile, tek bir deneysel vadede ele alınabilir.

1. çip tutucu hazırlanmasından sonra, saf etanol ile her çip durulayın ve toz gibi herhangi bir kirlilikler giderilmelidir için, azot gazı ile kuru darbe.
2. hava, oksijen veya azot plazma ile yonga yüzeyi temizleyin. plazma temizleme zaman aralıkları türüne bağlı olarak değişiklik gösterir: 1 dk, hava ve sirke oksijen plazma işlemi gerçekleştirmek% 80 güç ayarında 0,3 mbar (RF güç orta veya yüksek) 5 dakika boyunca Rogen plazma.
3. Plazma Temizlikten sonra kavite ıslanmasını sağlamak için 10-15 dakika süreyle saf etanol içinde cips kuluçkaya yatmaktadır.
4. Tris tampon 400 ul ilave edilerek tampon için Aşamalı kuru etanol (20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.0; steril filtre), hava kabarcıkları ve 400 ul daha sonra kaldırma tanıtımı olmadan çözeltisi karıştırılarak eklenmiştir. Etanol kaldırılmasını sağlamak için, bu prosedürü 12 kez tekrarlayın.
   Not: Etanol lipozomlar ve asma lipit bilayers için zararlı olacaktır.
5. 5 mM _CaCl2, 1 uM Oy647 boya ile DOPE Tris tamponu (steril filtre edildi, 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.0). Tamamen çip yıkama tamponu çıkarın ve hemen çipe katkılı tampon ekleyin. Not: çip boşlukların sabit bir ıslatma ve yonga yüzeyi sağlamak, hava ile doğrudan temas halinde değildir cips, yıkama tamponu çıkarıldıktan sonra ince bir tampon film ile kaplı olacaktır.
6. Tris tampon maddesi içinde 1 mg / ml luvs veya proteolitik-luvs ekleme (20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 8.0, steril filtre edildi) her.
   Not: her bir nihai hacmi 300 ul. katkılı Tris tampon ekleme esnasında kontrol boyası ve kimyasal modifiye MTSET sonraki eklenen düşünün.
7. yüzey alanına gözenek kapsayan lipid iki katmanlı oluşum için lipozom solüsyonu ile oda sıcaklığında 1 st için çip inkübe edin. Daha sonra Ca ^{2 +} içermeyen Tris tamponu 4x 400 ul her çip yıkayın.
8. 5 uM değerinde bir nihai konsantrasyona sahip her bir göze kontrol boyası ekleyin. cips artık translokasyon tahlil için hazırız.

7. Deney Kurulumu

1. Epifloresans mikroskobu (20X hava hedefi, uzun çalışma mesafesi) için çip tutucu monte edin. daha kolay mikro-boşlukların odak düzlemini bulmak için nanopore çip jant odaklanın. boşluklar odak kez bir bölge inci için nanopore dizi taramakgörüntüler en yüksek oranı sızdırmazlık.
   Not: her ters epifloresans mikroskobu çip tahlilleri yapmak için kullanılabilir. objektif büyütme bağlı olarak (20X - 60X) tahlil boşlukların sayısı 20X büyütme kullanarak görünümü tek bir alanda fazla 9.000 boşlukları olan, değişecektir. uzun bir çalışma mesafesi hava hedefleri tercih edilir. ters konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılması da mümkündür, ancak görüntü elde etme nedeniyle odak sınırlı derinliğe sınırlayıcı bir faktör olabilir.
2. çip aydınlatma optimize edin.
   Not: değişiklikler gözlenir edilemez olarak, hem boya kanalları maksimum gri skala değeri aşmamasını emin olun. ihracat deneyler için maksimum sinyal kapasitesinin% 90 transloke boyanın aydınlatma ayarlayın. açıkça herhangi sızdıran membran sızdırmazlık saptamak için maksimum sinyal kapasitesinin% 80-90 açık boşluklarında kontrol boyası ayarlayın.
3. Bir kez tüm kanallar zaman seri başlatmak ayarlanır. fotoğraf çekmek her 10-20 se90 dakika bekletilmiştir.
   Not: Bu aynı şekilde belirli ve belirsiz akış olayları takip etmek yeterlidir.
4. sistein özgü ilavesiyle fluoresan alt-tabakanın akışını başlatma pozitif 3 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar bileşiği MTSET ücret. Daha sonra açılış kanala bazal önce istikrarlı bir floresan sinyal kurabilmek için MTSET eklenmesinden önce deney çalışma zamanının en az 5 dakika bekleyin. Her zaman kullanmadan önce taze doğrudan MTSET solüsyon hazırlanır.

8. Veri Analizi

1. ImageJ standart versiyonu (Dosya / İthalat / Görüntü Sırası) ile zaman serisi görüntü yığını açın.
2. floresan kanallar yığılmış, her kanala (Görüntüler Resim / Yığınları / Stack) için ayrı ayrı yığınlar halinde kanal bölünmüş.
3. ROI için translokasyon substrat kanalının ilk görüntü (ilgi bölgeleri) kimlik (Görüntü / Çoğaltılmış) çoğaltın.
4. bir ikili görüntüde (Resim / ayarla / Eşik) görüntü dönüştürün. sağlamakBu kullanılan algoritma pixilation örtüşen olmadan tüm yalıtımlı boşluk sinyallerini göstermektedir.
5. Otomatik parçacık analizörü aracı ile ilgi alanları define (Parçacık Analiz / Analiz). parçacık gürültü önlemek için, tanımlanmış bir asgari parçacık boyutu tanımlayın. "Kenarları hariç" seçeneklerini kontrol edin ve "delikleri bulunmaktadır". Ortaya çıkan ROI microcavity dizisi deseni yansıtan emin olun. Bitişik ROI nedenle bunları kaldırmak, eserler vardır. ROI listesini kaydedin.
   Not: Ölçüm parametre ayarlanmalıdır parçacık analizi (/ Ayar Ölçümler / Alan Analiz) önce "alan" için
6. Zaman Serisi Analiz plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), aynı boyuta otomatik olarak tüm İB'leri boyutlandırır açın. Yeniden boyut 6x6 piksel ve oval şekil (Zamanlayıcı Serisi Analiz / AutoROIProperties) bir genişlik / yükseklik için mevcut tüm ROI. "Mevcut İB'leri yeniden boyutlandırma" seçeneğini işaretleyin. Ortaya çıkan resized ROI listesini kaydedin.
7. YG yöneticisini açın(ROI Yöneticisi / Diğer / Aç) (Araçlar / ROI Müdürü / Analiz) ve zaman serisi her kanal için yeniden boyutlandırıldı ROI listesi yüklenemedi. ROI süperpoze edilecektir. "Tüm dilimleri ölçün" ve "dilim başına bir satır" ve başlangıç ​​çoklu ölçü birimini seçin, Çoklu Ölçü aracını (ROI Yöneticisi / Diğer / Çoklu Ölçü) her başlattığınızda ROI için sinyal değişikliği analiz etmek.
   Not: Ölçüm parametresi (/ / Set Ölçümleri analiz gri Ortalama değer) Bu aşama için "gri ortalama değer" olarak ayarlanmış olması gerekir
8. * .txt Veya * .xls formatında her ROI için ortalama gri değer vererek, ortaya çıkan tabloyu kaydedin.
9. "İthalat Dosyası" seçeneği ile NanoCalcFX içine her görüntüleme kanalının ROI analizi alın. Set "serisi adlandırma için ilk satırını kullanın". Zaman serisi görüntü elde etme sürelerine göre görüntüler arasında adım boyutunu ayarlayın ve ilgili sütun ve ondalık ayırıcı seçin.
10. otomatik olarak bireysel fluo grafiklerini korelasyon "çoklu tabaka" seçeneğini kullanınrescent kanalları.
    Not: olaylar şimdi analiz ve 3 renk spektral bilgi verdiği bilgiler kullanılarak sınıflandırılabilir.
11. yap-fit ​​fonksiyonu (fit seçeneği) kullanılarak seçilen eğrileri uygun.
    Not: Tüm monoexponential difüzyon odaklı olaylar ve fit sınırları ayarlanabilir uygulanan akış ve akını denklemi uygundur. Elde edilen hız sabitleri histogram aracını kullanarak çizilen ya da daha fazla veri arıtma için ihraç edilebilir.

Sonuçlar

Gözenek kapsayan zarlar kolayca kendi kendine monte şekilde nano yapılı çip yüzeyinde oluşturulabilir. Ancak altta yatan süreç hala hassas ve lipozom boyutu, lipozom nüfus, lameller, lipid-ve tuz konsantrasyonu ve kimyasal yüzey özelliklerinin monodispersiteye gibi birçok parametrede tarafından etkilenir. Bu parametrelerin çoğu dikkatle, özelliği yukarıdaki protokol standardize edilmiştir. Ancak her yeni hazırlanması sırasında kontrol edilmelidir Diğer parametrel...

Tartışmalar

Burada sunulan teknik membran proteini ulaşım son derece paralel analiz sağlar. Sulandırılmış membran proteini sistemleri doğrudan teorik her zar taşıyıcı uyarlanmasını yapmadan veya olası kanala, Biochip uygulanabilir. Taşıma analizi sadece doğrudan floresans değişimi (fluorophores translokasyon veya floresan etiketli substratlar) ya da dolaylı olarak floresans değişimi (pH'a duyarlı boyalar, sekonder enzimatik reaksiyonlar) yoluyla, bir flüoresan okuması sisteminin kurulması ile sınırl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
[2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.
1 ml gas-tight syringe	Hamilton	#1001
10 ml round flask	Schott Duran
2.7 mm glas beads	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube	Sarstedt	744304
Acetone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920	need to be activated before first use
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	store dark at -20 °C
Chloroform reagent grade	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	store dark at -20 °C
Ethanol absolute	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Single-use syringe	Braun	460 60 51V
Injekt-F single-use syringe	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)	Avanti Polar Lipids	5416016	store under inert gas at -20 °C
NaCl 99.5% p.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Germany)		available on request
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	store dark at -20 °C
Oy647	Luminartis (Münster/Germany)	OY-647-T-1mg	store dark at -20 °C
Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	column material for size exclusion chromatography
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		curing agent for chip fixation onto cover glass support
sticky-Slide 8-well	ibidi	80828	multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)
Three-way stopcock blue	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter	Roth	NH69.1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Büchi 461 water bath	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Membrane pump	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE microscope	Synentec		available on request
Pump control	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator bath Sonorex RK100H	Brandelin electronic	31200001107477
Vaccum pump RC5	Vaccubrand	1805400204
Water bath W13	Haake	002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	scientific image processing software
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets
NTA 2.3 Analytical Software	Nanosight		data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		temperature controle software for nanoparticle tracking microscope