Membrane Transport processus analysés par un système hautement parallèle Nanopore Chip à protéine unique Résolution

Résumé

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Résumé

Membrane transport des protéines au niveau de protéine unique échappe encore une analyse détaillée, si le substrat translocation est non-électrogénique. Des efforts considérables ont été faits dans ce domaine, mais les techniques permettant l'analyse automatisée de transport à haut débit en combinaison avec des techniques de bicouches lipidiques sans solvant requis pour l'analyse des transporteurs membranaires sont rares. Cette classe de transporteurs est toutefois crucial dans l'homéostasie cellulaire et donc une cible clé dans le développement de médicaments et de méthodologies pour acquérir de nouvelles connaissances désespérément besoin.

Le manuscrit présenté ici décrit la création et la manipulation d'un roman biopuce pour l'analyse des processus de transport de protéines membranaires médiation à la résolution du transporteur unique. La biopuce est composé de microcavités fermées par nanopores qui est hautement parallèle dans sa conception et peuvent être produits de qualité industrielle et de la quantité. liposomes Protein-hébergeant peuvent être directement appliquées àla surface de la puce formant des bicouches lipidiques pores transmembranaires auto-assemblées à l'aide de SSM-techniques (solide supporté membranes lipidiques). Pores transmembranaires parties de la membrane sont autonomes, fournissant l'interface substrat pour la translocation dans ou hors de l'espace de la cavité, qui peut être suivie par la lecture de fluorescence multispectral en temps réel. La mise en place de procédures normalisées d'exploitation (SOP) permet à la mise en place directe des bicouches lipidiques de protéines hébergeant sur la surface de la puce de pratiquement toutes les protéines de la membrane qui peut être reconstituée fonctionnellement. La seule condition préalable est la mise en place d'un système de lecture fluorescent pour les substrats de transport non électrogènes.

Les applications à haute teneur dépistage sont accomplishable par l'utilisation de microscopes automatisés fluorescents inversés d'enregistrement multiples puces en parallèle. Les grands ensembles de données peuvent être analysées en utilisant le logiciel d'analyse conçu sur mesure librement disponibles. Trois couleurs multiples spectrale fluorescentelecture permet en outre de discrimination de données impartiale dans différentes classes d'événements, ce qui élimine des résultats faussement positifs.

La technologie de la puce est actuellement basée sur SiO ₂ surfaces, mais fonctionnalisation supplémentaire en utilisant des surfaces de puces revêtues d' or est également possible.

Introduction

L'analyse des protéines membranaires est devenue d'un intérêt croissant pour la recherche fondamentale et pharmaceutique au cours des 20 dernières années. Le développement de nouveaux médicaments dépend de l'identification et de la caractérisation détaillée des nouvelles cibles, étant actuellement l'un des facteurs limitants. Le fait que 60% ​​de toutes les cibles médicamenteuses sont des protéines membranaires ^1, rend le développement de techniques pour élucider leur fonction la plus importante.

Dans le passé, des techniques pour l'étude des canaux électrogènes et les transporteurs ont été développés dans la multitude ^2-4. substrats non électrogènes en contraire présentent une tâche plus difficile. Ils sont cependant d' un intérêt particulier en tant que cibles de médicaments de choix, car ils contrôlent le flux de solutés et de nutriments à travers la membrane cellulaire et la fonction des récepteurs ⁵ clés en cascades de signalisation.

Des efforts considérables ont été mis dans le développement de techniques pour étudier la fonction des protéines de transport membranaire ^{6, 7.} Les systèmes utilisant des membranes sur support solide ont émergé comme des outils les plus prometteurs dans ce domaine ^8-10, y compris solides bicouches lipidiques supportées, bicouches captifs ^{11, 12,} membranes microblack lipidiques ^{13, 14} et natifs tableaux vésiculaires ^{15, 16} pour ne citer que quelques - uns. Certains d'entre eux sont même disponibles en configurations commerciales ^{17, 18.} Quelques exemples ont été publiés en combinant la capacité d'étudier les protéines membranaires simples d'une manière hautement parallèle ^{14, 19,} une condition préalable pour les applications de dépistage. Cependant, ces méthodes combler rarement de la recherche fondamentale à l'environnement industriel. Les difficultés se situent souvent dans la capacité du système à être automatisable, la production coûteuse et / ou d'une préparation laborieuse. Une approche overcoming tous les obstacles mentionnés ci-dessus est le but final.

La technique présentée ici a été développé pour étudier les canaux de membrane et des transporteurs in vitro dans un environnement contrôlé , le niveau de protéine unique ^20-22. Reconstitution des protéines membranaires purifiées en LUV est beaucoup plus établi que les approches comparables pour GUVs ^{23 - 26} ou lipides noir membranes ^27. Ils peuvent être directement appliqués sur la surface de la puce, où la formation de deux couches se déroule par l'intermédiaire d'un processus d'auto-assemblage. La conception à fond de verre de la puce nanoporeux (Fig. 1) permet pour la microscopie de l' air, ce qui permet l'automatisation simple du système. En combinaison avec une platine motorisée plusieurs puces peuvent être mesurées en même temps, chaque champ de vision contenant des milliers de cavités scellées pour l'analyse.

La figure 1. Conception de biopuces nanopore multiplexés. A) de silicium sur isolant (SOI) wafer est structuré par gravure ionique réactive. Environ 1.150 puces individuelles sont fabriquées à partir de chaque plaquette avec des propriétés identiques et de qualité. B) Chaque puce comprend 250.000 microcavités individuels avec des ouvertures nano. Barre d' échelle:. 200 um C) Chaque cavité est adressable par fluorescence multi-spectrale lecture. Un opaques blocs supérieurs de la couche les signaux fluorescents provenant du réservoir tampon, ce qui rend la biopuce compatible avec inversées microscopes à fluorescence. D) microscopie à force atomique (AFM) imagerie révèle disposés de manière uniforme des ouvertures de pores et la rugosité de la surface de la couche de dioxyde de silicium de 3,6 nm (n = 40) optimale pour la fusion des vésicules. Barre d' échelle: 5 um E) micro électronique à balayage.roscopie d'image (SEM) montre une coupe transversale à travers le nanopore permettant l'accès aux cavités femtolitre à l'intérieur de la puce de silicium. Ce chiffre a été réutilisé avec l' autorisation de ^21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Toute analyse des données est effectuée en utilisant freeware pour garantir un accès sans restriction pour les utilisateurs finaux. Les séries temporelles sont analysées en utilisant un logiciel de traitement d'images gratuit et d'un traitement par lots logiciel d'analyse de la courbe de génération personnalisée permettant et la corrélation directe de grands ensembles de données avec de multiples canaux fluorescents et des milliers de courbes.

La protéine de modèle utilisé dans ce protocole est le canal mécanosensible de protéines grande conductance (MscL) de canal dérivé de E. coli. Il fonctionne comme une soupape pour libérer un choc osmotique dans la nature, mais a été modifiée d'une manière telle que conçue rationnellement syntfonctionnalités HETIC peuvent covalente être fixés sur le côté des canaux d'étranglement. Via charge la répulsion de l'activateur lié de façon covalente (MTSET) le canal est déclenché pour ouvrir, créer une nano-valve. Les petites molécules comme les ions, l'eau, de petites protéines, mais aussi les petites fluorophores peuvent passer à travers le canal. Ici, la protéine est utilisée comme modèle pour démontrer la capacité du système pour détecter la translocation de la protéine à médiation.

Protocole

1. Préparation du Grand vésicules unilamellaires (LUV)

1. Nettoyer un ballon à fond rond (10 ml de volume) avec de l'azote gazeux pour éliminer les particules de poussière. Rincer le ballon à fond rond avec de l'éthanol.
   Remarque: L'éthanol résiduel peut être tolérée et ne perturbe pas les étapes ultérieures.
2. Laver un 1 ml 4x seringue en verre avec du chloroforme, pour éliminer toute contamination. Ajouter 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml dans du chloroforme) dans le ballon à fond rond et à doper la solution de lipide DOPE avec une ^{ATTO 390} supplémentaire à une concentration finale de 0,1% en moles.
   Remarque: Au lieu de DOPE ^{ATTO 390} Autres lipides marqué par un fluorophore ou des colorants lipophiles peuvent également être utilisés, en fonction de sources d'excitation disponibles.
3. Raccorder le ballon à fond rond dans un évaporateur rotatif. Sécher le film lipidique pendant 40 min à 300 mbar, 30 ° C Température du bain d'eau C et la vitesse de rotation maximale, pour former un film homogène de lipides sur la paroi en verre du flacon.
4. Transfer le ballon à une pompe à vide poussé et sécher le film lipidique pendant encore 30 minutes à la température ambiante.
5. Ajouter 5 ml de tampon (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) et 8 perles de verre (diamètre 2,7 mm, l'éthanol lavé et séché) dans le ballon. Raccorder le ballon à l'évaporateur rotatif et tourner sans vide à 50 ° C à la vitesse maximale.
   Nota: Les perles de verre déplacer mécaniquement le film lipidique de la paroi de verre, ce qui conduit à (multilamellaire) la formation de vésicules. Après 45 min rotation la solution apparaît laiteux et aucun film lipidique résiduel devrait être visible au niveau des parois du ballon. Au lieu de perles de verre d'autres méthodes telles que la sonication le ballon dans un appareil à ultrasons à bain d'eau, tourbillonner le flacon ou le procédé de réhydratation légère sont également applicables.
6. Transférer le récipient sous gaz inerte (argon) dans un bain à ultrasons et de traitement par ultrasons pendant 4 min à température ambiante.
   Remarque: Les ondes de choc ultrasonores perturbent les liposomes, ce qui les rend unilamellaire.
7. Diviser la solution de LUVdans 1 ml aliquotes.
8. 5 effectuer des cycles de congélation / décongélation par congélation de la solution LUV dans de l'azote liquide, suivie d'une décongélation à 40 ° C dans un bain d'eau.
   Remarque: Ceci conduit à la rupture et le réarrangement spontané de liposomes individuels les uns avec les autres, conduisant à une augmentation de la taille.
9. Lors de la dernière étape magasin de congélation tous les échantillons à -80 ° C.
   Remarque: Les LUV seront stables pendant au moins 6 mois.

2. Protein Reconstitution

1. Décongeler 1 ml LUV aliquote sur la glace. Juste avant la reconstitution, extruder les liposomes 17x à travers une membrane filtrante en polycarbonate de 400 nm en utilisant une mini-extrudeuse.
   Note: les agrégats lipidiques seront supprimés et la distribution finale de taille homogène est atteint.
2. Déstabilisent LUV par addition de 4% de Triton X-100 (v / v) à une concentration finale de 0,25% (v / v) et on incube pendant 5 minutes à 50 ° C.
   Remarque: La quantité de liposomes utilisée dans cette étape dépend de la masse du purifié MscL ^{G 22 C utilisé (voir étape 2.3). Purifier MscL G 22 C (dérivé de E. coli) , comme décrit en détail dans le 28.}
3. Mélanger purifié MscL ^{G 22 C} et les liposomes détergents saturante à 01:20 (p / p) Taux et laisser incuber pendant 30 minutes supplémentaires à 50 ° C.
4. Pour l'élimination du détergent ajouter bio-billes dans du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) à la solution de protéine / liposomes, avec 16 mg (poids humide) Bio-beads par ml de détergent utilisé pour déstabiliser les liposomes l'étape 2.2.
5. Effectuer la dépose de détergent pendant une nuit (16 heures) à 4 ° C sur une plaque tournante.
   Remarque: Le mélange constant de la solution assure l'élimination optimale de détergent.
6. Après élimination du détergent protéoliposomes magasin à 4 ° C et à utiliser pour des expériences sur le même jour.

3. Dosage de l'activité

1. Pendant la protéine reconstitution prendre une aliquote de 100 pi de un détergentsolution de protéoliposome déstabilisé après l'étape 2.3 de finition.
2. Ajouter 1 volume de calcéine (30 mM) à la solution de protéine-liposome et incuber pendant 5 min supplémentaires à 50 ° C.
3. Retirer le détergent de la solution comme décrit à l'étape 02.04 à 02.06.
4. Après élimination du détergent en équilibre une colonne d'exclusion de taille (20 ml de volume de lit ou plus) avec du tampon Tris (3 x le volume du lit).
   Remarque: protéoliposome séparation peut être effectuée à la température ambiante, mais en gardant toujours l'échantillon à 4 ° C est conseillée pour assurer la meilleure activité de la protéine après fractionnement.
5. protéoliposomes séparés de la calcéine libre en appliquant la totalité aliquote (200 pi) dans la colonne d'exclusion de taille. Laisser le mélange à tremper dans la colonne, suivie d'une élution des protéoliposomes de la colonne via l'application de la mémoire tampon en continu sur le dessus à l'aide de l'écoulement par gravité. Observer la calcéine contenant protéoliposomes comme une bande orange discrète à l'avant d'élution. Collecter des fractions de 500 & #181; l respectivement.
   Remarque: calcéine colorant gratuit sera éluer après la fraction de protéoliposomes avec séparation complète.
6. Pipette 80 ul de chaque fraction sur une plaque de micro-puits pour fluorescent de lecture et d'identifier la fraction contenant la plus grande quantité de calcéine contenant protéoliposomes par émission de fluorescence. Détecter la fluorescence à 520 nm avec une excitation à 490 nm. Utiliser la fraction de protéoliposome avec le signal le plus élevé pour le dosage de l'activité suivante.
7. Mélanger 20 pi de la fraction contenant protéoliposome avec du tampon Tris-980 pi dans 1 ml de fluorescence cuvette.
8. Mesurer l'émission de fluorescence à 520 nm (excitation 490 nm) en utilisant un spectrofluorimètre. Enregistrez pendant 1 min, puis ajouter 25 ul de MTSET ([2- (triméthylammonium) éthyl] méthanethiosulfonate) à partir d'une solution mère (160 mM) et bien mélanger. Continuez à l'enregistrement au cours du mélange. Toujours préparer la solution mère frais directement avant utilisation.
   Remarque: Une fois résolu dans un tampon MTSET hydrolysers dans les 30 min et seront non réactif. MTSET peut être pesé et conservé aliquote de poudre sèche à -20 ° C jusqu'à utilisation.
   Remarque: Une fois activé , le canal ^C MscL ^{G 22} ouvre et libère la calcéine piégée, conduisant à une diminution de la concentration locale de la calcéine efflux lorsque les protéoliposomes et dequenching subséquente du colorant, ce qui entraîne une augmentation de l'émission de fluorescence.
9. Après l'émission de fluorescence a de nouveau atteint un plateau stable solubiliser les liposomes par addition de 50 ul de Triton X-100 (4% v / v).
   Remarque: Idéalement aucune augmentation de fluorescence en outre peut être observée, ce qui implique la protéine active dans tous les liposomes.

4. Distribution de la taille Mesure de LUV utilisation du suivi des Nano-particules

1. A noter que seuls les échantillons minimales du liposome ou protéoliposome solution sont nécessaires pour l'analyse de la distribution de taille en utilisant le système de suivi des nanoparticules. Diluer une solution de liposomes de 5 mg / ml Concentration des lipides 1: 5000 (v / v) dans un tampon (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) pour l'analyse à un volume final de 1 ml. Filtrez tous les tampons utilisés pour la dilution et la préparation de LUV avant et la reconstitution en utilisant une membrane de 0,2 um pour éliminer les particules en suspension, comme la poussière qui perturberait les mesures de distribution de la taille.
2. Laver le débit-chambre avec de l'eau ultra-pure.
3. Utiliser les marqueurs de surface pour focaliser le faisceau lumineux. Injecter environ 300 pi de l'échantillon de liposome dilué et fermer immédiatement la vanne de sortie pour arrêter l'écoulement à l'intérieur de la chambre d'écoulement, sans introduire de bulles d'air.
4. Réglez les paramètres de mise au point et la caméra obturateur / gain pour assurer signal de diffusion adéquate de l'échantillon pour la détection.
   Remarque: 20 - 80 signaux doivent être clairement visibles dans le champ de vision. Prévenir la surpopulation (> 80 signaux) que le logiciel ne sera pas en mesure de suivre les signaux individuels lorsque les chevauchements.
5. Allez à la "Capture" screen. Réglez le contrôle de la température à 25 ° C et la durée de capture à 90 secondes en utilisant les commandes du logiciel. Appuyez sur "Record" pour commencer l'enregistrement d'une série temporelle.
   Remarque: À la fin de la série de temps une nouvelle fenêtre ouvre.
6. Enregistrer la série temporelle dans le format donné (* .avi). Pour des raisons pratiques lors de l'analyse des lots enregistrer tous les fichiers dans un seul dossier.
7. Ouvrez la vanne de sortie et d'injecter encore 300 ul dans la chambre d'écoulement. Fermer le robinet et répétez les étapes de 4,3 à 4,6 fois.
8. Après avoir terminé tous les essais sur les échantillons de lavage de la chambre d'écoulement avec 5 ml d'eau ultra-pure. Allez à l'écran "Pre-Process". Réglez la température des paramètres d'étalonnage = 25 ° C et la viscosité = 0,91 pour le tampon Tris utilisé dans ce protocole.
9. Ouvrez la fenêtre de traitement par lots et de charger les séries chronologiques enregistrées (Advanced / Batch Process / File Set 1-3). Appuyez sur "GO" pour commencer l'analyse de la distribution de la taille.
   Remarque: les automati logiciels d'analysetiquement suit les particules individuelles et calcule leur diamètre en fonction de leur comportement de déplacement en utilisant les paramètres définis à l'étape 4.8.
   Remarque: L'analyse de la distribution de taille résultante enregistre automatiquement dans le même dossier que les fichiers de séries chronologiques.
10. En outre créer un fichier de rapport pour résumer les résultats (Export / Créer un rapport PDF).

5. Support Chip Préparation

1. Peser 1,0 g de MDX4 qualité médicale base élastomère et 0,1 g agent de MDX4 de durcissement dans un tube de 50 ml de réaction. Mélanger les soigneusement avec une barre de verre.
2. Mettre le tube dans un dessiccateur pendant 1 heure pour dégazer l'adhésif. utiliser ensuite dans un délai de 30 min pour la puce de collage, comme l'adhésif durcir et être trop difficile de travailler avec.
3. Pendant élastomère dégazage (étape 5.1) nettoyer une lame de verre objectif à fond avec du chloroforme pour éliminer toute contamination avant le collage de la puce. Rincer la lame avec 5 ml de chloroforme en utilisant une seringue en verre. Recueillir lechloroforme dans un récipient en dessous positionné. Après le lavage laisser glisser sec.
   Remarque: Effectuez cette étape sous une hotte. Alternative au chloroforme, d'autres solvants organiques tels que l'acétone peut également être utilisé.
4. Déposez une petite quantité de matériau de collage sur la vitre du couvercle à l'aide d'une pointe de pipette (pointes de cristal pour pipettes 10 pi). Rappelez-vous que les puces ont pour entrer dans le support de diapositives 8 chambre plus tard et doivent être placés sur la diapositive en conséquence.
5. Retirez délicatement une puce à la fois de la carte de tranche en utilisant de fines pinces de pointe et de déposer la puce sur la goutte de colle sur le couvercle en verre. Assurez-vous que le côté revêtu de la puce orientée vers le haut.
6. Poussez délicatement la puce sur le verre de couverture avec le dos d'un contondants pincettes PE. Pour veiller à ce que la colle est distribuée uniformément sous la puce, glisser délicatement la puce avant et en arrière. ÉTAPE CRITIQUE: Veiller à ce que les bulles d'air sont piégés sous la puce, comme il va perturber l'imagerie optiquedes cavités de puces plus tard. Assurez-vous également qu'aucun matériau adhésif contamine la surface de la puce.
7. Dessécher le verre de couverture finie pendant 2 heures à 65 ° C dans un séchoir de l'armoire.
   Nota: Les puces sont encore revêtus d'une couche protectrice provenant de leur fabrication qui doit être enlevé.
8. Pour retirer la couche de protection, effectuer une étape séquentielle de lavage au solvant. Lors de la cuisson des copeaux, préchauffer un bain d'eau à 54 ° C.
9. Placez 3 béchers en verre dans le bain d'eau, deux d'entre eux remplis avec de l'isopropanol et un rempli avec de l'acétone.
10. Insérez le couvercle en verre de la puce dans un porte-lame et le plonger dans le premier isopropanol plat rempli pendant 10 min. Ensuite les transférer à la boîte remplie d'acétone, incuber à nouveau pendant 10 minutes avant de le transférer à l'étape de lavage final au deuxième plat de l'isopropanol et on incube encore 10 min.
11. Retirez le support de diapositives de la vaisselle et laver soigneusement abondamment avec Ultrapure l'eau, suivie d'un séchage des copeaux avec un léger courant d'azote gazeux.
12. Décollage la feuille de stratification du collant-slide 8 puits et mettez-le en arrière sur le banc. Prenez soigneusement la lamelle et appuyez doucement sur le collant-slide avec les puces face aux puits. Laissez le fini support de puce reste pendant quelques minutes avant de l'utiliser.

6. Assay Préparation

Remarque: les puces Nanopore collés à un verre de couverture et séparés par un collant-slide 8 puits possèdent l'avantage, que plusieurs puces peuvent être traitées dans un seul essai expérimental, avec des puces étant complètement séparés les uns des autres.

1. Après la préparation du support de puce, rincer chaque puce avec de l'éthanol pur et sécher avec de l'azote gazeux, pour éliminer toutes les impuretés comme la poussière.
2. Nettoyer la surface de la puce avec de l'air, l'oxygène ou le plasma d'azote. En fonction du type de nettoyage plasma périodes de temps varient: effectuer un traitement par plasma d'oxygène pendant 1 min, l'air et nitrogen plasma pendant 5 min à 0,3 mbar à réglage de puissance de 80% (milieu de puissance RF ou élevé).
3. Après le nettoyage de plasma incuber les puces dans l'éthanol pur pendant 10-15 min pour assurer la cavité de mouillage.
4. éthanol d'échange par étapes pour le tampon par addition de 400 ul de tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration), suivie par le mélange de la solution sans introduire de bulles d'air et l'élimination ultérieure de 400 pi. Répéter cette procédure 12 fois, pour assurer l'élimination de l'éthanol.
   Remarque: L'éthanol serait nocif pour les liposomes et les bicouches lipidiques en suspension.
5. Tampon Tris dopant (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) avec 5 mM de _CaCl2 et 1 uM Oy647 colorant. Retirez complètement le tampon de lavage de la puce et ajouter immédiatement le tampon dopé à la puce. Note: Chips seront recouverts d'une couche tampon mince après le retrait du tampon de lavage, de sorte que la puce ne sont pas en contact direct avec l'air, assurant un mouillage constant des cavités et la surface de la puce.
6. Ajouter 1 mg / ml ou LUV PROTEO-LUV dans du tampon Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; stérilisée par filtration) à chaque puits.
   Remarque: Le volume final dans chaque puits est de 300 ul. Examiner les additions ultérieures du colorant de commande et le modificateur MTSET chimique lors de l'addition de tampon Tris dopé.
7. Pour lipides formation bicouche des pores transmembranaires sur la surface de la puce incuber la puce pendant 1 heure à température ambiante avec la solution de liposome. Ensuite , lavez chaque puce avec 4x 400 pi de tampon Tris Ca ^{2 +} -free.
8. Ajouter le colorant témoin à chaque puits, à une concentration finale de 5 uM. Les puces sont maintenant prêts pour le dosage de la translocation.

7. Essai de configuration

1. Monter le support de puce au microscope à épifluorescence (objectif de l'air 20X, longue distance de travail). Focus sur le rebord de la puce nanopore pour trouver plus facilement le plan focal des micro-cavités. Une fois que les cavités sont en discussion scanner le réseau de nanopores pour une région eau affiche ratio le plus élevé d'étanchéité.
   Note: Chaque microscope à épifluorescence inversé peut être utilisé pour effectuer des dosages de la puce. Selon le grossissement de l'objectif (20X - 60X de) le nombre de cavités dosées variera, avec jusqu'à 9.000 cavités dans un seul champ de vision avec un grossissement de 20x. objectifs d'air avec une longue distance de travail sont préférables. L'utilisation de inversées confocale microscopes à balayage laser (CLSM) est également possible, mais l'acquisition de l'image peut être le facteur limitant en raison de la faible profondeur de mise au point.
2. Optimiser l'éclairage de la puce.
   Remarque: Veiller à ce que les deux canaux de colorant ne dépassent pas la valeur maximale de l'échelle de gris, que les changements ne peuvent pas être respectées. Pour les expériences d'exportation ajuster l'illumination du colorant transloqué à 90% de la capacité maximale du signal. Réglez le colorant de contrôle dans des cavités ouvertes à 80-90% de la capacité maximale du signal pour détecter clairement toute étanchéité de la membrane qui fuit.
3. Une fois que tous les canaux sont ajustés commencer la série chronologique. Prenez des images toutes les 10-20 seC pendant 90 min.
   Note: Ceci est suffisant pour suivre également des événements spécifiques et non spécifiques efflux.
4. Initialize efflux du substrat fluorescent par l'addition de cysteine ​​spécifique, le composé chargé positivement MTSET à une concentration finale de 3 mM. Prévoyez au moins 5 min de l'expérience de l'exécution avant l'addition MTSET pour pouvoir plus tard établir un signal fluorescent stable de base avant de canaliser l'ouverture. Toujours préparer une solution MTSET frais directement avant l'utilisation.

Analyse 8. Données

1. Ouvrez le temps l'image de la série pile avec une version standard de ImageJ (Fichier / Importer / séquence d'images).
2. Si les canaux fluorescents sont empilés, diviser les canaux en piles individuelles pour chaque canal (image / Piles / Stack Images).
3. Dupliquer la première image du canal de substrat de translocation pour le retour sur investissement (régions d'intérêt) identification (image / Dupliquer).
4. Convertir l'image en une image binaire (image / Ajuster / Seuil). Assurerque l'algorithme utilisé représente des signaux pour toutes les cavités scellées sans chevauchement pixilation.
5. définir automatiquement des régions d'intérêt avec l'outil d'analyse de particules (Analyse / Analyse des particules). Définir une taille de particule minimale définie, pour éviter le bruit des particules. Cochez les options «exclure sur les bords" et "inclure des trous". Assurez-vous que ROIs résultant reflètent le modèle de réseau de microcavité. ROIs intercalée sont des artefacts, donc les supprimer. Enregistrer la liste de retour sur investissement.
   Remarque: le paramètre de mesure doit être réglé sur "zone" avant l'analyse des particules (Analyse / Set Mesures / Zone)
6. Ouvrez le plug-in Series Analyzer Time (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), qui redimensionne automatiquement toutes les ROIs à la même taille. Re-taille tout de ROIs existant à une largeur / hauteur de pixels 6x6 et forme ovale (série analyseur Minuteur / AutoROIProperties). Cochez l'option «Redimensionner ROIS existante". Enregistrer la liste de ROI redimensionnée résultant.
7. Ouvrez le gestionnaire de ROI(Analyse / Outils / Gestionnaire de ROI) et charger la liste de ROI redimensionnée pour chaque canal de la série chronologique (ROI Manger / Plus / Open). ROI sera superposée. Pour analyser le changement de signal pour chaque ROI démarrer l'outil de mesure multi (gestionnaire de ROI / Plus / Multi Measure), sélectionnez "Mesurer toutes les tranches" et "Une ligne par tranche" et commencer la mesure à plusieurs.
   Remarque: le paramètre de mesure doit être réglé sur "valeur moyenne grise» pour cette étape (Analyse / Mesures Set / Valeur moyenne gris)
8. Enregistrez la table résultant, ce qui donne la valeur de gris moyenne pour chaque ROI * .txt ou * .xls.
9. Importez l'analyse de retour sur investissement de chaque canal d'imagerie en NanoCalcFX via l'option "Importer un fichier". Set "Utiliser la première ligne pour nommer série". Définissez la taille de l'étape entre les images en fonction des périodes d'acquisition d'images de séries temporelles et choisissez la colonne correspondante et séparateur décimal.
10. Utilisez l'option "feuille multiple" pour corréler automatiquement les graphiques de la personne fluocanaux rescentes.
    Remarque: Les événements peuvent maintenant être analysées et classées en utilisant les informations fournies par l'information spectrale 3 couleurs.
11. Adapter les courbes sélectionnées en utilisant l'en construction fonction d'ajustement (en option) en forme.
    Remarque: L'efflux et l'afflux équation mise en œuvre est adaptée pour tous les événements de diffusion axée monoexponentielles et les limites d'ajustement peuvent être réglés. Les constantes de vitesse obtenus peuvent être tracés à l'aide de l'outil d'histogramme ou exportés pour affiner davantage de données.

Résultats

Les membranes de pores transmembranaires peuvent être facilement créées sur la surface de la puce de nanostructures d'une manière auto-assemblée. Toutefois, le processus sous-jacent est toujours délicate et influencée par de nombreux paramètres tels que la taille des liposomes, monodispersité de la population de liposomes, lamellarité, lipides et sel concentration et de surface chimique propriétés. La plupart de ces paramètres ont été soigneusement caractérisés et no...

Discussion

La technique présentée ici permet une analyse très parallèle de transport des protéines de la membrane. des systèmes protéiques de la membrane reconstituée peuvent être directement appliquées sur la biopuce, ce qui rend l'adaptation de la théorie, chaque transporteur membranaire ou canaux possibles. l'analyse de transport est seulement limité par la mise en place d'un système de lecture fluorescente, soit par changement direct de fluorescence (translocation des fluorophores ou des substrats marq...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
[2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.
1 ml gas-tight syringe	Hamilton	#1001
10 ml round flask	Schott Duran
2.7 mm glas beads	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube	Sarstedt	744304
Acetone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920	need to be activated before first use
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	store dark at -20 °C
Chloroform reagent grade	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	store dark at -20 °C
Ethanol absolute	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Single-use syringe	Braun	460 60 51V
Injekt-F single-use syringe	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)	Avanti Polar Lipids	5416016	store under inert gas at -20 °C
NaCl 99.5% p.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Germany)		available on request
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	store dark at -20 °C
Oy647	Luminartis (Münster/Germany)	OY-647-T-1mg	store dark at -20 °C
Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	column material for size exclusion chromatography
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		curing agent for chip fixation onto cover glass support
sticky-Slide 8-well	ibidi	80828	multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)
Three-way stopcock blue	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter	Roth	NH69.1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Büchi 461 water bath	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Membrane pump	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE microscope	Synentec		available on request
Pump control	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator bath Sonorex RK100H	Brandelin electronic	31200001107477
Vaccum pump RC5	Vaccubrand	1805400204
Water bath W13	Haake	002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	scientific image processing software
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets
NTA 2.3 Analytical Software	Nanosight		data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		temperature controle software for nanoparticle tracking microscope