Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Zusammenfassung

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Zusammenfassung

Membranproteintransport auf dem einzelnen Proteinebene ausweicht noch detaillierte Analyse, wenn das transloziert Substrat nicht elektrogener ist. Erhebliche Anstrengungen wurden in diesem Bereich, sondern Techniken ermöglicht automatisierte Hochdurchsatz-Transport-Analyse in Kombination mit lösemittelfreien Techniken Lipid-Doppelschicht für die Analyse von Membrantransportern sind erforderlich selten. Diese Klasse von Transportern ist jedoch von entscheidender Bedeutung in der Zelle Homöostase und daher ein zentrales Ziel in der Medikamentenentwicklung und Methoden neue Erkenntnisse dringend benötigt zu gewinnen.

Die hier präsentierten Handschrift beschreibt den Aufbau und die Handhabung eines neuartigen Biochips für die Analyse von Membranprotein-vermittelte Transportprozesse auf Einzel transporter Auflösung. Der Biochip besteht aus Mikrokavitäten durch Nanoporen eingeschlossen, die stark parallel in seiner Gestaltung und kann in Industriequalität und Menge hergestellt werden. Protein-tragende Liposomen können direkt angewendet werdendie Chipoberfläche bilden selbstorganisierende poren Spanning Lipid-Doppelschichten SSM-Techniken (feste Lipidmembranen unterstützt). Pore-Spanning Teile der Membran sind freistehend, Bereitstellen der Schnittstelle für das Substrat Translokation in den oder aus dem Hohlraum, die durch multispektrale Fluoreszenzanzeige in Echtzeit verfolgt werden können. Die Einrichtung von Standard Operating Procedures (SOPs) ermöglicht die einfache Einrichtung von Protein-tragenden Lipid-Doppelschichten auf der Chipoberfläche praktisch jeder Membranprotein, das funktionell wiederhergestellt werden kann. Einzige Voraussetzung ist die Schaffung eines Fluoreszenzlesesystem für Nicht-elektrogener Transportgründen.

High-Content-Screening-Anwendungen sind erfüllbar durch den Einsatz von automatisierten inversen Fluoreszenzmikroskope mehrere Chips parallel aufzuzeichnen. Große Datenmengen können mit dem frei verfügbaren anwendungsspezifische Analyse-Software analysiert werden. Drei-Farben-Mehrspektrale FluoreszenzAuslesen erlaubt darüber hinaus für unvoreingenommene Daten Diskriminierung in verschiedenen Ereignisklassen, falsch positive Ergebnisse zu beseitigen.

Die Chip - Technologie basiert derzeit auf SiO ₂ -Oberflächen, aber weitere Funktionalisierung goldbeschichteten Spanflächen ist ebenfalls möglich.

Einleitung

Die Analyse von Membranproteinen ist von Interesse in den letzten 20 Jahren für die Grund- und pharmazeutischen Forschung erhöht werden. Die Entwicklung neuer Medikamente ist abhängig von der Identifizierung und detaillierte Charakterisierung neuer Ziele, die derzeit einer der limitierenden Faktoren zu sein. Die Tatsache , dass etwa 60% aller drug targets sind Membranproteine ^​​1, macht die Entwicklung von Techniken , um ihre Funktion wichtigsten aufzuklären.

^{4 -} In der Vergangenheit wurden in ² Vielzahl entwickelten Techniken für die Untersuchung von elektrogenen Kanäle und Transporter. Nicht elektrogener Substrate im Gegensatz eine schwierige Aufgabe darstellen. Sie sind jedoch von besonderem Interesse als Hauptangriffspunkte für Medikamente, da sie den Fluss von gelösten Stoffen und Nährstoffen durch die Zellmembran und die Funktion als Schlüsselrezeptoren in Signalkaskaden ⁵ steuern.

Beträchtliche Anstrengungen wurden in die Entwicklung von t gesetztechniques die Funktion von Membrantransportproteinen ^{6, 7} zu untersuchen. ^10, darunter auch feste unterstützten Lipid - Doppelschichten, tethered Bilayer ^{11, 12,} microblack Lipidmembranen ^{13, 14} und nativen Vesikel - Arrays ^{15, 16} ein paar zu nennen ^- Systeme festen Träger unter Verwendung von Membranen wurden als vielversprechendsten Instrumente auf diesem Gebiet ⁸ entstanden. Einige von ihnen sind sogar als Handelsaufbauten ^{17, 18.} Einige Beispiele wurden veröffentlicht Kombination die Fähigkeit einzelne Membranproteine ​​in einer hochparallelen Weise ¹⁴ zu ^{studieren, 19,} Voraussetzung für Screening - Anwendungen. Allerdings überbrücken diese Methoden nur selten aus der Grundlagenforschung zur industriellen Umfeld. Die Schwierigkeiten liegen oft in der Fähigkeit des Systems, automatisierbar zu sein, die kostenintensive Herstellung und / oder aufwendige Vorbereitung. Ein Ansatz overcoming alle oben erwähnten Hindernisse ist das Endziel.

Die Technik , die hier vorgestellt wurde entwickelt Membrankanäle und Transporter in vitro in einer kontrollierten Umgebung auf dem einzelnen Protein - Ebene ²⁰ zu studieren ^{- 22.} Die Rekonstitution von gereinigten Membranproteinen in LUVs ist viel mehr etabliert als vergleichbare Ansätze für GUVs ^23-26 oder schwarzen Lipidmembranen ^27. Sie können direkt auf die Chipoberfläche aufgebracht werden, in dem Doppelschichtbildung erfolgt über eine Selbstorganisationsprozess stattfindet. Der Glasboden Design des nanoporösen Chip (Fig. 1) ermöglicht eine Luft Mikroskopie, die die einfache Automatisierung des Systems ermöglicht. In Kombination mit einer motorisierten Stufe kann mehrere Chips gleichzeitig gemessen werden, wobei jedes Sichtfeld Tausende von abgedichteten Hohlräumen zur Analyse enthält.

Abbildung 1. Design von gemultiplexten Nanopore Biochips. A) A silicon-on-insulator (SOI) Wafers durch reaktives Ionenätzen strukturiert. Ungefähr 1.150 einzelne Chips werden von jedem Wafer hergestellt mit identischen Eigenschaften und Qualität. B) Jeder Chip umfasst 250.000 einzelne Mikrokavitäten mit Nano - Öffnungen. Maßstabsbalken:. 200 & mgr; m C) Jeder Hohlraum ist adressierbar über multispektrale Fluoreszenz ausgelesen. Eine undurchsichtige Deckschicht blockiert die Fluoreszenzsignale aus dem Pufferspeicher, so dass der Biochip kompatibel mit invertierten Fluoreszenzmikroskop. D) Rasterkraftmikroskopie (AFM) Bildgebung Porenöffnungen und Oberflächenrauhigkeit der Siliziumdioxid - Schicht von 3,6 nm gleichmäßig angeordnet enthüllt (n = 40) optimal für Vesikelfusion. Maßstabsbalken:. 5 um E) Rasterelektronen microscopy (SEM) Aufnahme zeigt einen Querschnitt durch die Nanopore die den Zugang zu den Femtoliter Hohlräume innerhalb des Siliziumchips. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis wiederverwendet werden von ^21. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Alle Datenanalyse wird mit Freeware durchgeführt uneingeschränkten Zugriff für Endanwender zu gewährleisten. Zeitreihen sind mit dem kostenlosen Bildverarbeitungssoftware analysiert und eine benutzerdefinierte Build-Kurvenanalyse-Software ermöglicht die Stapelverarbeitung und einfache Korrelation von großen Datensätzen mit mehreren Fluoreszenzkanälen und Tausende von Kurven.

Das Modellprotein in diesem Protokoll wird die mechanosensitive Kanal von großer Leitfähigkeit (MscL) Kanalproteins von E. abgeleitet coli. Es fungiert als ein Ventil in der Natur osmotischen Schock freizusetzen, wurde aber derart modifiziert, dass synt rational entworfenhetic Funktionalitäten können kovalent an die Kanäle Einschnürung Seite angebracht werden. Via Ladungs ​​Abstoßung des kovalent gebundenen Aktivator (MTSET) der Kanal ausgelöst wird, zu öffnen, die Schaffung eines Nano-Ventil. Kleine Moleküle, wie Ionen, Wasser, kleine Proteine, aber auch kleine Fluorophore können durch den Kanal zu durchdringen. Hierbei wird das Protein als ein Modell verwendet, um die Fähigkeit des Systems zu demonstrieren Protein-vermittelte Translokation zu detektieren.

Protokoll

1. Herstellung von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs)

1. Reinigen Sie einen Rundkolben (10 ml Volumen) mit Stickstoffgas alle Staubpartikel zu entfernen. Spülen Sie den Rundkolben mit Ethanol.
   Hinweis: Rest Ethanol toleriert werden kann und stört nicht den nachfolgenden Schritten.
2. Waschen Sie eine 1-ml-Glasspritze 4x mit Chloroform, um eine Kontamination zu entfernen. 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml in Chloroform) , um den Rundkolben und DOPE die Lipidlösung mit einer zusätzlichen DOPE ^{ATTO 390} bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Mol-%.
   Anmerkung: Anstelle von DOPE ^{ATTO 390} anderen Fluorophor markierte Lipide oder lipophile Farbstoffe können auch verwendet werden, abhängig von der verfügbaren Anregungsquellen.
3. Schließen Sie den Rundkolben an einem Rotationsverdampfer. Trocknen des Lipidfilms für 40 min bei 300 mbar, 30 ° C Wasserbadtemperatur und die maximale Rotationsgeschwindigkeit, um eine homogene Lipidfilm an der Glaswand des Kolbens zu bilden.
4. Transfer der Kolben auf einer Hochvakuumpumpe und trocken der Lipidfilm für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
5. 5 ml Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) und 8 Glasperlen (2,7 mm Durchmesser, Ethanol gewaschen und getrocknet) in den Kolben. Der Kolben wird an dem Rotationsverdampfer und drehen ohne Vakuum bei 50 ° C bei maximaler Geschwindigkeit.
   Hinweis: Glasperlen, die Lipidfilm von der Glaswand mechanisch verdrängen, was zu (multilamellare) Vesikelbildung. Nach 45 min Rotation erscheint die Lösung milchig und kein Restlipidfilm sollte an den Kolbenwänden sichtbar sein. Anstelle von Glasperlen andere Methoden wie Beschallen der Kolben in einem Wasserbad sonifier, Verwirbelung der Kolben oder die sanfte Rehydrierung Verfahren sind ebenfalls anwendbar.
6. Übertragen, der Kolben wird unter Schutzgas (Argon) in ein Ultraschallbad und beschallen für 4 min bei Raumtemperatur.
   Anmerkung: Die Ultraschall-Stoßwellen, die Liposomen stören, sie unilamellar machen.
7. Teilen Sie die LUV-Lösungin 1 ml Aliquots.
8. Führen Sie 5 Frost / Tau-Zyklen durch die LUV Lösung Einfrieren in flüssigem Stickstoff, gefolgt von in einem Wasserbad bei 40 ° C aufgetaut.
   Anmerkung: Dies führt miteinander und spontaner Umlagerung einzelner Liposomen zu bersten, was zu einer Größenzunahme.
9. Bei der letzten Gefrierschritt speichern alle Proben bei -80 ° C.
   Anmerkung: Die LUVs für mindestens 6 Monate stabil sein.

2. Protein Rekonstitution

1. Auftauen 1 ml LUV aliquoten auf Eis. Unmittelbar vor der Rekonstitution extrudieren Liposomen 17x durch ein 400 nm Polycarbonat-Filtermembran einen Mini-Extruder.
   Hinweis: Lipid-Aggregate werden entfernt und die abschließende homogene Größenverteilung erreicht wird.
2. Destabilisieren LUVs durch Zugabe von 4% Triton X-100 (v / v) bis zu einer Endkonzentration von 0,25% (v / v) und bei 50 ° C für 5 min inkubiert.
   Anmerkung: Die Menge der Liposomen in diesem Schritt verwendet wird, hängt von der Masse des gereinigten MscL ^{G 22 C (siehe Schritt 2.3). Reinige MscL G 22 C (abgeleitet von E. coli) , wie im Detail in 28 beschrieben.}
3. Mischungs gereinigt MscL ^{G 22 C} und waschmittel gesättigten Liposomen um 1:20 (w / w) -Verhältnis und Inkubation für weitere 30 min bei 50 ° C.
4. Zur Entfernung des Detergens bio-beads in Tris-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) an das Protein / Liposom-Lösung, mit 16 mg (Naßgewicht) bio-Kügelchen pro & mgr; l Detergens verwendet Liposomen zu destabilisieren in Schritt 2.2.
5. Führen Sie Waschmittel Entfernung über Nacht (16 h) bei 4 ° C auf einer rotierenden Platte.
   Hinweis: Die ständige Durchmischung der Lösung optimal Detergensentfernung gewährleistet.
6. Nach Entfernung des Detergens store Proteo bei 4 ° C und für die Experimente am gleichen Tag.

3. Aktivitätstest

1. Während Protein Rekonstitution nehmen eine 100-ul-Aliquot von Detergens-destabilisiert Proteoliposoms Lösung nach 2,3 Schritt beenden.
2. 1 Volumen von Calcein (30 mM) an das Protein-Liposom-Lösung und Inkubation weitere 5 min bei 50 ° C.
3. Entfernen Detergens aus der Lösung, wie in Schritt von 2,4 bis 2,6.
4. Nach Entfernung des Detergens eine Größenausschluss-Säule (20 ml Bettvolumen oder mehr) mit Tris-Puffer (3x das Bettvolumen) ins Gleichgewicht.
   Hinweis: Proteoliposom Trennung kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, jedoch ist die Probe zu halten konstant bei 4 ° C empfohlen wird am besten Proteinaktivität nach der Fraktionierung zu gewährleisten.
5. Separate Proteo von freiem Calcein durch das gesamte Aliquot Anwendung (200 ul) zu der Grßenausschlußsäule. Lassen Sie die Mischung in die Kolonne zu tränken, gefolgt von der Elution der Proteo aus der Kolonne über eine kontinuierliche Puffer Anwendung auf mit Schwerkraftfluss. Beachten Sie die Calcein Proteo als diskrete orange Bande in der Elution Vorderseite enthält. Sammeln Fraktionen von 500 & #181; l auf.
   Hinweis: Free Calceinfarbstoff nach dem Proteoliposoms Fraktion mit vollständigen Trennung eluieren.
6. Pipette 80 ul jeder Fraktion auf einem Mikrowell-Platte für fluoreszierende Auslesen und die Fraktion identifiziert die höchste Menge an Calcein enthaltenden Proteo über Fluoreszenzemission enthält. Erkennen Fluoreszenz bei 520 nm mit einer Anregung bei 490 nm. Verwenden Sie die Proteoliposoms Fraktion mit dem höchsten Signal für den folgenden Aktivitätstest.
7. Mix 20 ul der Proteoliposom enthaltenden Fraktion mit 980 & mgr; l Tris-Puffer in einer 1 ml Küvette Fluoreszenz.
8. Messung der Fluoreszenzemission bei 520 nm (Anregung 490 nm) unter Verwendung eines Spektrofluorometers. Nehmen Sie für 1 min und fügen Sie dann 25 ul MTSET ([2- (Trimethylammonium) ethyl] Methanthiosulfonat) aus einer Stammlösung (160 mM) und gut mischen. Halten Sie bei der Aufnahme während des Mischens. Immer bereiten die Stammlösung frisch direkt vor dem Gebrauch.
   Hinweis: Wenn in Puffer MTSET Hydrolyze gelösts innerhalb von 30 min und nicht reaktiv sein. MTSET kann bei -20 ° C bis zur Verwendung und gehalten als trockenes Pulver aliquoten abgewogen werden.
   Hinweis: Wenn der aktiviert MscL ^{G 22 C} - Kanal öffnet und das eingeschlossene Calcein, zu einer lokalen Konzentrationsabnahme des Calcein führt , wenn die Proteo und anschließende Dequenching des Farbstoffes ablauf, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzemission.
9. Nachdem die Fluoreszenzemission ein stabiles Plateau wieder, solubilisieren die Liposome durch Zugabe von 50 & mgr; l Triton X-100 (4% v / v) erreicht hat.
   Hinweis: Im Idealfall kann keine Erhöhung weiteren Fluoreszenz beobachtet werden, was bedeutet, aktives Protein in jedem Liposom.

4. Größenverteilung Messung von LUVs mit Nano-Partikel-Tracking

1. Beachten Sie, dass nur minimale Proben der Liposomen oder Proteoliposoms Lösung für Größenverteilung Analyse notwendig sind, mit Hilfe der Nanopartikel-Tracker. Verdünnen, um eine Liposom-Lösung von 5 mg / ml Lipidkonzentration 1: 5000 (v / v) in Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) zur Analyse auf ein Endvolumen von 1 ml. Filter alle Puffer für die Verdünnung verwendet und vor LUV Herstellung und Rekonstitution unter Verwendung eines 0,2 um Membran schwebeteilchenfrei wie Staub zu entfernen, die Größenverteilung Messungen stören würden.
2. Waschen Sie die Flusskammer mit ultrareinem Wasser.
3. Verwenden Sie die Oberflächenmarker auf dem Lichtstrahl zu fokussieren. Injizieren etwa 300 & mgr; l der verdünnten Liposomenprobe und sofort schließen Sie das Austrittsventil die Strömung innerhalb der Strömungskammer zu stoppen, ohne die Einführung alle Luftblasen.
4. Stellen Sie den Fokus und Kamera-Auslöser / Gain-Einstellungen, um eine angemessene Streuung Signal der Probe für den Nachweis gewährleisten.
   Hinweis: 20 - 80 Signale sollten in dem Sichtfeld deutlich sichtbar sein. Verhindern Überfüllung (> 80 Signale), da die Software nicht in der Lage sein, einzelne Signale zu verfolgen, wenn überlappen.
5. Gehen Sie auf die "Aufnahme" screen. Stellen Sie den Temperaturregler auf 25 ° C und die Aufnahmedauer auf 90 Sekunden die Software-Steuerung verwendet wird. Drücken Sie auf "Record" zu starten Aufnahme einer Zeitserie.
   Hinweis: Nach Abschluss der Zeitreihe ein neues Fenster öffnet sich .
6. Speichern Sie die Zeitreihen im vorgegebenen Format (* .avi). Aus praktischen Gründen bei der Chargenanalyse alle Dateien in einem einzigen Ordner speichern.
7. Öffnen Sie das Austrittsventil und injizieren weitere 300 & mgr; l in die Strömungskammer. Schließen Sie das Ventil und wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,6 zweimal.
8. alle Probenläufe waschen Sie die Flusskammer mit 5 ml Reinstwasser Nach Abschluss. Gehen Sie auf die "Pre-Process" Bildschirm. Stellen Sie die Kalibrierungsparameter Temperatur = 25 ° C und Viskosität = 0,91 für den Tris-Puffer in diesem Protokoll verwendet.
9. Öffnen Sie die Batch-Prozessfenster und laden Sie die aufgezeichneten Zeitreihen (Advanced / Batch-Prozess / Set File 1-3). Drücken Sie auf "GO", um die Größenverteilung Analyse starten.
   Hinweis: Um die analytische Software automamatisch verfolgt die einzelnen Partikel und deren Durchmesser auf ihrem Bewegungsverhalten basierend berechnet 4.8 unter Verwendung der in Schritt eingestellten Parameter.
   Hinweis: Die resultierende Größenverteilung Analyse speichert automatisch in den gleichen Ordner wie die Zeitreihen - Dateien.
10. Zusätzlich wird eine Report-Datei erstellen, um die Ergebnisse zusammenzufassen (Export / Bericht erstellen PDF).

5. Chiphalter Vorbereitung

1. Wiegen 1,0 g MDX4 medizinischer Qualität Elastomerbasis und 0,1 g MDX4 Härtungsmittels in ein 50 ml Reaktionsröhrchen. Mischen Sie beide gründlich mit einem Glasstab.
2. Setzen Sie den Schlauch in einem Exsikkator für 1 h zum Entgasen der Klebstoff. verwenden Sie es anschließend innerhalb von 30 Minuten für die Chip-Verklebung, da der Klebstoff härtet und zu hart zu arbeiten.
3. Während Elastomer Entgasung (Schritt 5.1) reinigen Sie eine objektive Glasobjektträger gründlich mit Chloroform keine Kontaminationen vor Chip-Bonden zu entfernen. Spülen Sie die Folie mit 5 ml Chloroform mit einer Glasspritze. Sammeln Sie dieChloroform in einem darunter liegenden Becher. Nach dem Waschen die Folie trocknen lassen.
   Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter einer Abzugshaube. Alternativ zu Chloroform, andere organische Lösungsmittel wie Aceton, können ebenfalls verwendet werden.
4. Abzuscheiden, eine kleine Menge des Klebematerials auf das Deckglas eine Pipettenspitze (Kristallspitzen 10 ul Pipetten) verwendet wird. Denken Sie daran, dass die Chips in die 8-Kammer Diahalter passen müssen später auf und müssen entsprechend auf der Folie platziert werden.
5. zu einer Zeit, einen Chip von der Waferplatte mit feiner Spitze Pinzette und legen den Chip auf der Klebstofftropfen auf dem Deckglas vorsichtig entfernen. Sicherzustellen, dass die beschichtete Seite des Chip nach oben zeigt.
6. Schieben Sie den Chip auf dem Deckglas mit der Rückseite einer stumpfen Pinzette PE. Um sicherzustellen, dass der Leim gleichmäßig unter dem Chip ausgegeben wird, schieben Sie vorsichtig den Chip hin und her. Kritischste Schritt: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen unter dem Chip eingefangen werden, wie es optische Bildgebung störender Chip später Hohlräume. Achten Sie auch darauf, dass kein Klebematerial der Chipoberfläche verunreinigen.
7. Desiccate die fertige Deckglas für 2 Stunden bei 65 ° C in einem Trockenschrank.
   Note: Chips werden immer noch mit einer Schutzschicht ausgehend von ihrer Herstellung überzogen , die entfernt werden muss.
8. Um die Schutzschicht zu entfernen, führen eine sequentielle Lösungsmittel Waschschritt. Bei der Härtung von Chips vorzuwärmen, einem Wasserbad auf 54 ° C.
9. Platz 3 Glasbecher in das Wasserbad, zwei von ihnen gefüllt mit Isopropanol und einem mit Aceton gefüllt.
10. Stecken Sie die Chipdeckglas in einen Diahalter und versenken sie in die erste Isopropanol gefüllt Gericht für 10 min. übertragen sie anschließend an das Aceton gefüllt Gericht, brüten wieder für 10 Minuten, bevor es für den letzten Waschschritt in die zweite Isopropanol Schale und Inkubation weitere 10 min zu übertragen.
11. Entfernen Sie den Diahalter aus der Schale und vorsichtig waschen ausgiebig mit Ultrapure Wasser, gefolgt von der Chips mit einem sanften Stickstoffgasstrom zu trocknen.
12. Take-off der Lamellenblechart aus dem 8-gut klebrig-Rutsche und legte sie zurück auf die Bank. Vorsichtig die Abdeckschlitten abholen und vorsichtig auf die klebrige Schlitten mit den Chips drücken Sie die Vertiefungen gegenüber. Lassen Sie den Chiphalter Rest fertig für ein paar Minuten vor dem Gebrauch.

6. Assay Vorbereitung

Hinweis: Nanopore Chips auf einem Deckglas geklebt und getrennt durch eine 8-Well-sticky-Slide besitzen den Vorteil, dass mehrere Chips in einem einzigen Versuchslauf angegangen werden, mit Chips vollständig voneinander getrennt sind.

1. Nach dem Chiphalter Vorbereitung gründlich jeden Chip mit reinem Ethanol und Föhnen mit Stickstoffgas, alle Verunreinigungen wie Staub zu entfernen.
2. Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Luft, Sauerstoff oder Stickstoff-Plasma. Je nach Art der Plasmareinigungszeitperioden variieren: Sauerstoff-Plasmabehandlung für 1 min, Luft und nit auszuführenRogen Plasma für 5 min bei 0,3 mbar bei 80% Leistungseinstellung (HF-Leistungs mittel oder hoch).
3. Nach der Plasmareinigung bebrüten Chips in reinem Ethanol für 10-15 min Hohlraum Benetzung zu gewährleisten.
4. Stepwise Austausch Ethanol Puffer 400 ul Tris-Puffer Zugabe von (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert), gefolgt von der Einführung ohne Luftblasen und die anschließende Entfernung von 400 & mgr; l der Lösung gemischt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang 12 Mal, um Ethanol Entfernung zu gewährleisten.
   Hinweis: Ethanol würde für Liposomen und suspendierte Lipid-Doppelschichten schädlich sein.
5. Dope Tris - Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) mit 5 mM CaCl ₂ und 1 uM Oy647 Farbstoff. Entfernen Sie vollständig aus dem Chip des Waschpuffers und sofort den dotierten Puffer zu dem Chip hinzuzufügen. Hinweis: Die Chips werden mit einer dünnen Pufferschicht nach dem Waschpuffer Entfernung abgedeckt werden, so dass der Chip nicht in direkten Kontakt mit der Luft ist, eine konstante Benetzung der Hohlräume und der Chipoberfläche zu gewährleisten.
6. 1 mg / ml oder LUVs proteo-LUVs in Tris-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0; sterilfiltriert) in jede Vertiefung.
   Hinweis: Das Endvolumen in jedem Napf 300 & mgr; l ist. Betrachten wir nachfolgende Ergänzungen des Steuer Farbstoff und dem chemischen Modifikator MTSET während dotierten Tris-Puffer hinaus.
7. Für poren Spanning Lipiddoppelschichtbildung auf der Chipoberfläche des Chips für 1 h bei Raumtemperatur mit der Liposom-Lösung inkubieren. Danach waschen jeden Chip mit 4x 400 ul Ca ^{2 +} -freien Tris - Puffer.
8. Fügen Sie den Steuer Farbstoff zu jeder Vertiefung mit einer Endkonzentration von 5 uM. Die Chips sind nun bereit für die Translokation Assay.

7. Assay-Setup

1. Montieren Sie den Chiphalter zum Epifluoreszenzmikroskope (20X Luft Ziel, lange Arbeitsabstand). Konzentrieren Sie sich auf den Rand des Nanopore Chip leichter die Brennebene der Mikrohohlräume finden. Sobald die Hohlräume im Fokus scannen die Nanopore Array für eine Region thbei Displays Dichtungsverhältnis am höchsten.
   Hinweis: Jeder invertierte Epifluoreszenzmikroskop verwendet werden kann, um Chip-Assays durchzuführen. Je nach Zielsetzung Vergrößerung (20X - 60X) die Anzahl der Kavitäten untersucht wird variieren, mit bis zu 9,000 Hohlräume in einem einzigen Sichtfeld 20-facher Vergrößerung verwendet wird. Air Ziele mit einem langen Arbeitsabstand bevorzugt. Die Verwendung von invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope (CLSM) ist ebenfalls möglich, aber die Bildaufnahme kann der begrenzende Faktor aufgrund der begrenzten Tiefe des Fokus sein.
2. Optimieren Sie die Chip-Beleuchtung.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass beide Farbstoffkanäle nicht die maximale Grauwert überschreiten, da Änderungen nicht beobachtet werden können. Für den Export Experimente anpassen Beleuchtung des transloziert Farbstoff auf 90% der maximalen Signalkapazität. Passen Sie die Vergleichs-Farbstoff in offenen Hohlräumen auf 80-90% der maximalen Signalkapazität eindeutig jede undichte Membran Abdichtung erkennen.
3. Sobald alle Kanäle eingestellt, um die Zeitreihe starten. Nehmen Sie Bilder alle 10-20 sec für 90 min.
   Hinweis: Dies ist ausreichend, um ebenfalls spezifische und unspezifische Ausströmen Ereignisse folgen.
4. Initialisieren Efflux des fluoreszierenden Substrats durch die Zugabe von Cystein-specific, positiv geladene Verbindung MTSET bis zu einer Endkonzentration von 3 mM. Lassen Sie mindestens 5 min Versuchslaufzeit vor MTSET zusätzlich in der Lage zu sein, später auf eine stabile Fluoreszenzsignal Basis etablieren vor Öffnung zu kanalisieren. Immer MTSET Lösung frisch direkt vor dem Gebrauch vorzubereiten.

8. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die Zeitreihen-Bildstapel mit einer Standard-Version von ImageJ (Datei / Import / Bildsequenz).
2. Wenn Fluoreszenzkanäle gestapelt sind, teilen Sie die Kanäle in einzelnen Stapel für jeden Kanal (Bild / Stacks / Stack Bilder).
3. Duplizieren Sie das erste Bild des Translokation Substratkanals für ROI (Regions of Interest) Identifikation (Bild / Duplizieren).
4. Wandeln Sie das Bild in ein binäres Bild (Bild / Anpassen / Threshold). Dafür sorgendass der verwendete Algorithmus Signale für alle versiegelten Hohlräumen zeigt ohne pixilation überlappen.
5. Automatisch Regionen mit dem Partikelanalysetool Interesse definieren (Analyse / Analysieren Teilchen). Definieren Sie eine minimale Partikelgröße definiert, um Partikelrauschen zu vermeiden. Überprüfen Sie die Optionen "ausschließen auf Kanten" und "umfassen Löcher". Stellen Sie sicher, dass resultierende ROIs die Mikroresonator-Feldmuster zu reflektieren. Interjacent ROIs sind Artefakte, sie deshalb zu entfernen. Speichern Sie die ROI-Liste.
   Hinweis: Messparameter auf "Bereich" vor Partikelanalyse eingestellt werden muss (Analyse / Set Messungen / Area)
6. Öffnen Sie die Time Series Analyzer-Plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), die alle ROIs automatisch auf die gleiche Größe skaliert. Re-size alle vorhandenen ROIs auf eine Breite / Höhe von 6x6 Pixeln und ovale Form (Timer Series Analyzer / AutoROIProperties). Aktivieren Sie die Option "Größe ändern bestehende ROIS". Speichern Sie die Größe verändert ROI-Liste.
7. Öffnen Sie den ROI-Manager(Analyse / Tools / ROI-Manager) und laden Sie die Größe verändert ROI-Liste für jeden Kanal der Zeitreihe (ROI Manger / Mehr / Open). ROIs wird überlagert werden. Zur Analyse der Signaländerung für jeden ROI starten Sie das Multi Werkzeug messen (ROI Manager / Mehr / Multi Measure), wählen Sie "Messen Sie alle Scheiben" und "Eine Zeile pro Scheibe" und starten Sie das Multi Maßnahme.
   Hinweis: Messparameter eingestellt werden muss, um "bedeuten Grauwert" für diesen Schritt (Analyse / Set Messungen / Mittlerer Grauwert)
8. Speichern Sie die Tabelle, die mittlere Grauwert für jeden ROI in * .txt oder * .xls Format zu geben.
9. Importieren Sie die ROI-Analyse jeder Bildgebungs Kanal in NanoCalcFX über den "Datei importieren" Option. Stellen Sie "Verwenden Sie erste Zeile Serie für die Benennung". Stellen Sie die Schrittweite zwischen den Bildern nach den Serie Bildaufnahmeperioden Zeit und wählen Sie die entsprechende Spalte und Dezimaltrennzeichen.
10. Verwenden Sie die "Mehrfachblatt" Option, um automatisch die Graphen der einzelnen Fluo korrelierenrescent Kanäle.
    Hinweis: Die Ereignisse können nun analysiert und klassifiziert die durch die 3-Farben-spektrale Information enthaltenen Informationen verwenden.
11. Fit ausgewählte Kurven, die die Build-in-Fit-Funktion (Fit-Option) verwenden.
    Hinweis: Die implementierte Ausströmen und Einströmen Gleichung eignet sich für alle monoexpotentielles diffusionsgetriebene Ereignisse und fit Grenzen gesetzt werden können. Daraus resultierende Geschwindigkeitskonstanten können mit dem Histogramm-Tool oder exportiert für die weitere Datenveredelung aufgetragen werden.

Ergebnisse

Pore-Spanning Membranen können leicht auf der Oberfläche nanostrukturierten Chip in einer selbstorganisierenden Weise erstellt werden. Doch der zugrunde liegende Prozess ist noch zart und von vielen Parametern wie Liposomgröße, Monodispersität der Liposomen-Population, Lamellarität, Lipid- und Salz-Konzentration und chemischen Oberflächeneigenschaften beeinflusst. Die meisten dieser Parameter sind in dem obigen Protokoll sorgfältig charakterisiert und standardisiert. Andere Param...

Diskussion

Die hier vorgestellte Technik ermöglicht eine hochparallele Analyse von Membranproteintransport. Rekonstituierten Membranprotein-Systeme können direkt auf dem Biochip aufgebracht werden, so dass die Anpassung der theoretisch jeder Membrantransporter oder möglichen Kanal. Transport-Analyse wird durch die Einrichtung eines fluoreszierenden Auslesesystem, entweder durch direkte Fluoreszenzänderung (Translokation von Fluorophore oder fluoreszenzmarkierte Substrate) oder indirekte Fluoreszenzänderung (pH-sensitiven Farb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
[2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate	Toronto Research Chemicals Inc.	T792900	MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer.
1 ml gas-tight syringe	Hamilton	#1001
10 ml round flask	Schott Duran
2.7 mm glas beads	Roth	N032.1
2-Propanole	Roth	9866.5
30 cm Luer-Lock Extension Tube	Sarstedt	744304
Acetone	Roth	5025.5
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920	need to be activated before first use
CaCl2 Dihydrat	Roth	HN04.3
Calcein	Sigma	C0875	store dark at -20 °C
Chloroform reagent grade	VWR Chemicals	22711324
DOPEATTO390	ATTO-TEC	AD 390-165	store dark at -20 °C
Ethanol absolute	Sigma-Aldrich	32205
Injekt Single-use syringe	Braun	460 60 51V
Injekt-F single-use syringe	Braun	91 66 017V
Keck clips	Schott	KC29
L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy)	Avanti Polar Lipids	5416016	store under inert gas at -20 °C
NaCl 99.5% p.a.	Roth	3957.2
Nanopore E100 wafer/chips	Micromotive (Mainz/Germany)		available on request
Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm	Whatman	800282
Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)	life Technologies	D-7173	store dark at -20 °C
Oy647	Luminartis (Münster/Germany)	OY-647-T-1mg	store dark at -20 °C
Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm	Roth	P 818.1
Sephadex G-50	Sigma-Aldrich	G5080	column material for size exclusion chromatography
Silastic MDX4-4210	Dow Corning		curing agent for chip fixation onto cover glass support
sticky-Slide 8-well	ibidi	80828	multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder)
Three-way stopcock blue	Sarstedt	744410001
Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality	Roth	5429.2
Triton-X 100	Roth	6683.1
Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter	Roth	NH69.1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Büchi 461 water bath	Büchi
Büchi Rotavapor RE 111	Büchi
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer	Varian
LiposoFast Mini Extruder	Avestin
Membrane pump	Vaccubrand	15430
Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope	Malvern / Nanosight	LM 14C
NyONE microscope	Synentec		available on request
Pump control	Vaccubrand	CVC 2II
Sonicator bath Sonorex RK100H	Brandelin electronic	31200001107477
Vaccum pump RC5	Vaccubrand	1805400204
Water bath W13	Haake	002-9910
Plasma Cleaner PDC-37G	Harrick Plasma	PDC-37G
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ImageJ	Open Source	http://imagej.nih.gov/ij/	scientific image processing software
NanoCalcFX	Freeware	http://sourceforge.net/projects/nanocalc/	data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets
NTA 2.3 Analytical Software	Nanosight		data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope
NTA 2.3 Temperature Comms	Nanosight		temperature controle software for nanoparticle tracking microscope