Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Abstract

البكتيريا اللاهوائية يفوق بكثير الجرام aerobes في العديد من منافذ الإنسان مثل القناة الهضمية والفم والمهبل. وعلاوة على ذلك، والتهابات اللاهوائية شائعة وكثيرا من السكان الأصليين. قدرة بعض الكائنات الممرضة اللاهوائية لغزو الخلايا البشرية يعطيها تدابير التكيف للهروب المناعة الفطرية وكذلك لتعديل سلوك الخلية المضيفة. ومع ذلك، وضمان أن البكتيريا اللاهوائية هي حية أثناء التحقيق التجريبي للأحداث قد تشكل تحديات. اللثوية Porphyromonas، واللاهوائية سلبية الغرام، غير قادرة على غزو مجموعة متنوعة من الخلايا غير البلعمية حقيقية النواة. توضح هذه المقالة كيفية بنجاح الثقافة وتقييم قدرة P. اللثوية لغزو الخلايا البشرية الوريد السري البطانية (HUVECs). وقد وضعت بروتوكولين: واحدة لقياس البكتيريا التي يمكن أن تغزو بنجاح والبقاء على قيد الحياة داخل المضيف، والآخر لتصور البكتيريا تتفاعل مع الخلايا المضيفة. هذه التقنيات تتطلب استخدام وسيلة anaerobic غرفة لتزويد P. اللثوية مع بيئة اللاهوائية للنمو الأمثل.

ويستند البروتوكول الأول على فحص حماية المضادات الحيوية، التي تستخدم إلى حد كبير لدراسة غزو الخلايا المضيفة عن طريق البكتيريا. ومع ذلك، وفحص حماية مضاد حيوي غير محدود؛ تقاس فقط البكتيريا داخل الخلايا التي هي زروع بعد العلاج بالمضادات الحيوية وتحلل الخلية المضيفة. لتقييم جميع البكتيريا تتفاعل مع الخلايا المضيفة، سواء الحية والميتة، وضعنا البروتوكول الذي يستخدم المجهر الفلورسنت لدراسة التفاعل المضيف الممرض. وصفت البكتيريا fluorescently مع 2 "، 7'-التسويات الدولية (2-carboxyethyl) -5- (و6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl استر (BCECF-AM) واستخدامها لتصيب الخلايا حقيقية النواة تحت الظروف اللاهوائية. بعد تثبيت مع امتصاص العرق وpermeabilization مع 0.2٪ تريتون X-100، وصفت الخلايا المضيفة مع TRITC phalloidin ودابي لتسمية الهيكل الخلوي الخلية والنواة، على التوالي. متعددة معهد العالم العربيويتم الحصول على غيس التي اتخذت في نقاط الاتصال المختلفة (Z-كومة) لتصور الزمانية المكانية من البكتيريا. الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة يمكن تطبيقها على أي اللاهوائية الصالحة وأي نوع من الخلايا حقيقية النواة.

Introduction

البكتيريا اللاهوائية استعمار تقريبا جميع أسطح جسم الإنسان. على الرغم من أن السائد في النباتات في مساحات المعوية والبولي التناسلي حيث تركيزات الأكسجين منخفضة، كانت موجودة أيضا عند مستويات مرتفعة على الجلد والفم والأنف، والحلق 1. البكتيريا اللاهوائية هي سبب شائع للالتهابات الداخلية وكثيرا ما معزولة عن المواقع المصابة. ومع ذلك، بسبب طبيعتها الحساسية، يمكن اللاهوائية يكون من الصعب عزل والثقافة. الدراسات التي تنطوي على البكتيريا اللاهوائية ويجب أن يتم في ظل ظروف مقيدة. تقنيات اللاهوائية الثقافة الحديثة تسمح للباحثين لتقليد إعدادات اللاهوائية اللازمة لدراسة العديد من السلالات المختبر اللاهوائي أو حتى العزلات السريرية 2،3.

وقد وضعت البكتيريا اللاهوائية المسببة للأمراض علاقة دينامية والتطور المشترك مع الخلايا المضيفة التي يقيمون فيها. معظم اللاهوائية عرضة للقتل من قبل الاستجابة المناعية قبل الوصول infectiمستويات الأوس. ومع ذلك، فقد وضعت بعض البكتيريا المسببة للأمراض آليات للهروب من أو تخريب الاستجابة المناعية. انهم تحقيق هذا الهدف من خلال آليات مثل التهرب من الاعتراف المناعة، وتحييد وسطاء المناعة، تغيير مناعة خلوية، غزو الخلايا المضيفة، وتغيير في مأمن مما يشير إلى 4. Porphyromonas اللثوية، واللاهوائية سلبية الغرام المتورطين في كل من الفم و الأمراض خارج الفم، مثال واحد من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية تكييفها للغاية قادرة على التسبب في تغييرات المسببة للأمراض في البلد المضيف 5-7.

جيوب بيوفيلم البلاك تراكمت في الشقوق العميقة التي تشكلت بين الأسنان والأنسجة المخاطية اللثة يمكن أن تؤوي البكتيريا اللاهوائية التي يتم حمايتها من الأكسجين في الغلاف الجوي 8. هذه الجيوب اللثوية بمثابة المتخصصة لمختلف العوامل الممرضة اللاهوائية، مثل P. اللثوية 9. P. اللثوية هو الممرض حجر الزاوية التي هي قادرة على إعادة تشكيلهاجي المجتمع الميكروبية عن طريق الفم بطرق تعزز تطور وتقدم أمراض اللثة 10. وتنتج عدد كبير من العوامل الفوعة التي تنشط ضد طائفة واسعة من البروتينات المضيفة ويوفر آليات التهرب من دفاعات المضيف (11). بل هو أيضا قادرة على غزو طلائي، البطانية، الأرومة الليفية، وخلايا الرباط اللثة في المختبر 12-14 والحية 15. من خلال غزو فعالية الخلايا المضيفة، P. اللثوية يمكن الهروب الحصانة المضيف. الغزو الفعال للخلايا المضيفة لا يسمح للبكتيريا للهروب دفاعات المضيف ولكن أيضا بمثابة خزان للفي المستقبل إعادة العدوى، وكذلك يغير الخلية المضيفة. هناك حاجة لدراسات الآليات الجزيئية المشاركة في التصاق واستيعاب البكتريا عن طريق الخلايا المضيفة. وتركز البحث في العديد من المختبرات على فهم الأحداث الجزيئية المرتبطة استيعاب P. اللثوية من قبل الخلايا المضيفةفضلا عن الآليات المستخدمة لقمع واختطاف الاستجابة المناعية والبقاء على قيد الحياة معادية آليات دفاع المضيف.

هناك العديد من فحوصات قادرة على تحديد وتوصيف مسببات الأمراض التي هي قادرة على غزو الخلايا المضيفة. ومع ذلك، في الدراسات المختبرية مع مسببات الأمراض اللاهوائية تشكل العديد من المشاكل التجريبية للباحث أساسا لأنه من الصعب إجراء دراسات التي تعتمد على أدوات ضخمة في غياب الأكسجين. ويضاف إلى ذلك حقيقة أن الخلايا حقيقية النواة تتطلب الأوكسجين في النمو، وبالتالي يجب أن تكون مستعدة بشكل منفصل في حاضنات زراعة الأنسجة. وثمة طريقة لتجنب مثل هذه العقبات تتمثل في إجراء الدراسات تحت الأوكسجين في الغلاف الجوي، ولكن هذا من شأنه أن يجعل نمو البكتيريا اللاهوائية مستحيلا. وثمة طريقة أخرى تتمثل في استخدام البكتيريا قتلوا الحرارة لنقل العدوى ودراسة التفاعلات الخلية المضيفة. ومع ذلك، توجد اختلافات بين البكتيريا قتلوا الحرارة وقابلة للحياة أن يقلل من أهميتها من interacti المضيف الممرضفي 16. فمن المركزي لدراسة البكتيريا قادرة على البقاء مع التعبير دون تغيير التفاعل مع الخلايا المضيفة؛ وبالتالي، طرق زراعة P. يتم إعطاء اللثوية في بيئة لا هوائية. أيضا، وقد أثبت بروتوكولين فعالة من حيث التكلفة بسيطة لتقييم قدرة P. اللثوية على أن يكون داخليا من قبل خلايا الإنسان السري الوريد البطانية (HUVECs). ويستند البروتوكول الأول على شعبية مقايسة حماية المضادات الحيوية. على الرغم من أن الفحص واضح وصريح، يتم إعطاء الاعتبارات عند استخدام الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية. يتطلب البروتوكول الثاني استخدام المجهر الضوئي فلوري لتصور التفاعل والمنضوية P. اللثوية. كل تجربة لها حدودها والمزايا التي سيتم مناقشتها لتوفير الباحث الخطوط العريضة لدراسة الغزو من البكتيريا اللاهوائية. على الرغم من أن المخطوطة الحالية دراسات P. اللثوية وHUVECs، هذه البروتوكولات يمكن استخدامها للعديد من البكتيريا اللاهوائية أخرى أيضاكما لأنواع أخرى من الخلايا المضيفة.

Protocol

سوف البروتوكولات التالية تصف طرق زراعة ودراسة غزو الأنواع اللاهوائية، P. اللثوية. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه البروتوكولات لعدد من مسببات الأمراض اللاهوائية. على الرغم من أن تستخدم HUVECs، يمكن استخدام هذا البروتوكول للخلايا حقيقية النواة الأخرى على حد سواء المناعية وغير المناعية.

1. اللاهوائية غرفة استخدام وصيانة

ملاحظة: P. اللثوية هو اللاهوائية حساسية لمستويات طبيعية من الأكسجين واجه في الهواء المحيط. A البيئة اللاهوائية التي تسيطر عليها أمر حيوي لزراعة P. اللثوية.

  1. هنا، والحفاظ على جو الاصطناعي تسمى الغاز اللاهوائي المختلط (80٪ N 2، 10٪ H 2، 10٪ CO 2) في غرفة الفينيل اللاهوائية (الشكل 1A). استخدام غرفة معادلة الضغط (الشكل 1B) لنقل عناصر من البيئة المختبر إلى غرفة اللاهوائية. غرفة معادلة الضغط تعمل يدويا، TWتطهير الجليد مع N 2 الغاز قبل إدخال الغاز اللاهوائي مختلطة.
  2. استخدام عمود إزالة كبريتيد الهيدروجين (الشكل 1C) لإزالة صيانة خالية من كبريتيد الهيدروجين غير مرغوب فيه. ضع مزيل الرطوبة داخل الغرفة لإزالة H 2 O التي أنشأتها المحفز وتجنب الهباء الجوي التي تسهل انتشار التلوث.
    ملاحظة: كبريتيد الهيدروجين هو نتيجة ثانوية الأيض الطبيعي للكثير من البكتيريا اللاهوائية وتراكمه غير سامة للبكتيريا، ويمكن أن يؤدي إلى تلف الأجهزة الإلكترونية ويقلل من عمر محفز.
  3. استخدام مربع مروحة تعميم جو الغرفة من خلال حافزا البلاديوم، الذي يزيل الأكسجين في وجود الهيدروجين (1D الشكل).
    ملاحظة: إعادة تدوير الغلاف الجوي (HEPA) مرشح يزيل الملوثات المحمولة جوا بحجم 0.22 ميكرون أو أكبر.
  4. البكتيريا اللاهوائية الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية الموجود داخل اللاهوائيةغرفة. استخدام تقنيات العقيم القياسية عند العمل داخل غرفة اللاهوائية.

figure-protocol-2247
الشكل 1. اللاهوائية الفينيل غرفة ومكوناته. (A) A اللاهوائية غرفة الفينيل مغلقة تماما من الأكسجين في الغلاف الجوي توفر مساحة عمل لشخصين في وقت واحد (32 في العاشر 78 في). أنه يحتوي على مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية (العودة وسط). يستخدم (B) غرفة معادلة الضغط لنقل العناصر من بيئة معملية إلى غرفة اللاهوائية. في الصورة هو القفل التلقائي تعمل من خلال وحدة تحكم التي يمكن برمجتها لتنفيذ الإجراءات فراغ وتطهير اللازمة لخلق بيئة اللاهوائية تلقائيا. (C) وكبريتيد الهيدروجين إزالة عمود يوفر إزالة قدرة عالية صيانة خالية من كبريتيد الهيدروجين غير مرغوب فيه. (D) اثنين من صناديق حافزا مشجعا لوضعت في جميع أنحاء الغرفة اللاهوائية للمساعدة في تعميم جو الغرفة من خلال حافزا البلاديوم، والتي، في وجود الهيدروجين، ويزيل الأكسجين. تم تعيين غرفة اللاهوائية حتى وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إعداد البكتيريا اللاهوائية

ملاحظة: P. اللثوية غير متحمل للهواء ويمكن تخزينها في ظروف هوائية ولكنها لن تنمو في وجود الأكسجين عند مستويات أعلى من 6٪ 17،18. دائرة اللاهوائية ضروري لزراعة السليمة للP. اللثوية والأنواع الأخرى اللاهوائية (الشكل 1). مطلوب التدريب المناسب والتعليم على استخدام غرفة اللاهوائي قبل العمل مع microanaerobes 19.

  1. تتوازن جميع وسائل الإعلام السائلة واللوحات كونديت اللاهوائيةأيونات لا يقل عن 12 ساعة قبل التجريب لإزالة الأكسجين المتبقي.
  2. نقل P. اللثوية من -80 ° C الفريزر لغرفة اللاهوائية، والسماح ذوبان الجليد.
  3. خط P. اللثوية على لوحات أجار الصويا الدم trypticase (TSA II مع 5٪ الأغنام الدم). التفاف لوحات في parafilm وتخزينها في 37 درجة مئوية في حاضنة اللاهوائية ل4-7 أيام.
  4. تطعيم P. اللثوية إلى 3 مل الدماغ القلب ضخ (BHI) مرق تستكمل مع هيمن وميناديون، غنية وسائل الإعلام السائلة غير انتقائية للعزلة وثقافة اللاهوائية والكائنات الحية الدقيقة الحساسية، وذلك باستخدام الحلقات معقمة.
    ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، ومزيج الثقافات البكتيرية أعدت في BHI مع الجلسرين أو DMSO (10-20٪ تركيز النهائي) ووضعه في الثلاجة -80 درجة مئوية.
  5. إعداد الثقافة بداية من P. اللثوية بجعل 1:10 تخفيف والسماح للبكتيريا لتنمو حتى مرحلة السجل منتصف.

ملاحظة: كثافة ضوئية من شهادة البكالوريايتم تحديد تعليق البكتيرية ويتم ضبط تركيز بكتيرية لكل سلالة لفحصها. لP. اللثوية تعليق على OD 660 من 0.7 يتوافق مع المرحلة السجل منتصف و~ 7 × 10 8 خلية / مل. ظروف النمو هو موضح في البروتوكول أعلاه هي محددة لP. اللثوية وربما تحتاج إلى أن تتكيف لسلالات بكتيرية أخرى.

3. غشائي خلية الثقافة

ملاحظة: شراء تجميع HUVECs الابتدائي والثقافة في المتوسط ​​القاعدية التي تحتوي على عوامل النمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

  1. HUVECs البذور في T-75 قوارير عند 2.5 × 10 5 خلية / مل قارورة في 15 الإعلام VEGF.
    ملاحظة: تحقق الجدوى عبر 1: 1 تخفيف مع 4.0٪ التريبان الأزرق. الخلايا مع غشاء خطر ستحتفظ التريبان الأزرق، والخلايا السليمة مع الأغشية سليمة تظهر بيضاء عندما ينظر تحت المجهر ضوء مجهر. اشعرر 100 خلية، تأكد من أن أكثر من 80٪ من الخلايا قابلة للبقاء 20.
  2. استبدال وسائل الاعلام كل يوم 2 مع ما قبل تحسنت وسائل الإعلام VEGF الطازجة حتى تصل خلايا ~ 80٪ confluency.
  3. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت. تحرير الخلايا من القارورة T75 التي يحتضنها مع 2 مل التربسين-EDTA (0.25٪) لمدة 5 دقائق تليها 2 مل التربسين حل تحييد.
  4. جمع HUVECs علقت في أنبوب مخروطي 50 مل. تغسل أي خلايا إضافية من T-75 قوارير مع برنامج تلفزيوني ونقل إلى 50 مل أنابيب مخروطية.
  5. خلايا الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. إزالة طاف، تعليق بيليه خلية في 10 مل سائل الإعلام VEGF قبل تحسنت.
  7. تحديد تركيز الخلية باستخدام عدادة الكريات أو ما شابه ذلك جهاز العد الخلية.
  8. حساب كمية من خلية إلى تعليق إضافة إلى أي لوحة 6 جيدا (400،000 / جيد) أو لوحة 12-جيدا مع coverslips (50000 / جيد). سوف HUVECs تكون على استعداد لإجراء التجارب في اليوم التالي.

4. البقاء على قيد الحياة الفحص الغزو / التفاعل(تصفيح)

ملاحظة: عند إجراء هذا الاختبار، وإعداد صفيحتين 6 جيدا من الخلايا البطانية المصنف في 400،000 خلايا / جيد. وسوف تستخدم واحدة لوحة لتقييم البكتيريا التي تعلق على والمنضوية بواسطة الخلايا المضيفة. سوف لوحة أخرى تمثل البكتيريا داخل الخلايا. لوحة 6 جيدا يسمح ليثلث من عينتين التي يتعين القيام بها في تجربة واحدة. للمخطط من هذا البروتوكول يرجى الرجوع إلى مخطط بقاء فحص (الشكل 2).

  1. إعداد البكتيريا اللاهوائية كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 1) حتى وصولها إلى نمو سجل في منتصف (OD 660 0،5-0،7).
  2. البكتيريا الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان الطرد المركزي هو غرفة اللاهوائية الخارجية، تحمل العينات البكتيرية في مغلقة بإحكام أنبوب 15 مل، والتفاف غطاء مع parafilm لمنع تسرب الأوكسجين.
  3. وضع مكعبات P. اللثوية مرة أخرى في الغرفة، ونبذ طاف. يغسل مع PBS، بيليه البكتيريا مرة أخرى قبل إعادة التعليق في VEGF ليديا. إعداد التعليق لجميع السلالات البكتيرية التي سيتم اختبارها في OD 660 من 0.7 الذي يتوافق مع المرحلة السجل منتصف (~ 7 × 10 8 خلية / مل). البكتيريا هي الآن جاهزة للعدوى.
  4. نقل 6 لوحات جيدا تحتوي على HUVECs من نسيج الثقافة الحاضنة إلى غرفة اللاهوائية. إزالة وسائل الاعلام ويغسل ثلاث مرات مع PBS اللاهوائية. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام VEGF اللاهوائي إلى كل بئر ووضع لوحات عند 37 درجة مئوية في حاضنة اللاهوائية لمدة 20 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة للعدوى.
    ملاحظة: البكتيريا لوحة على لوحات أجار الدم للتأكد من تلك التي استخدمت للعدوى متجانسة وغير ملوثة على العدوى.
  5. تصيب الخلايا المضيفة مع البكتيريا في عدد وافر من العدوى (البكتيريا وزارة الداخلية: المضيف) 100: 1.
    ملاحظة: يتم تحديد عدد الخلايا HUVEC عن طريق إجراء اختبار استبعاد التريبان على بئر واحدة قبل الإصابة. يتم تحديد عدد الخلايا البكتيرية عن طريق الكثافة الضوئية (على سبيل المثال، OD 0.5 = 5 × 10 8 خلية / مل). بيتم ضبط تركيز acterial إلى وزارة الداخلية المناسبة استنادا إلى تركيز HUVECs 21.
  6. وضع 6 لوحات جيدة مع HUVECs المصاب إلى حاضنة لاهوائية وتسمح للبكتيريا للتفاعل مع الخلايا المضيفة لمدة 30 دقيقة.
  7. إعداد سابونين في BHI (1.0٪ ث / ت) داخل غرفة اللاهوائية وتصفية من خلال 0.2 ميكرون التصفية.
  8. بقاء كل من البكتيريا تعلق والمنضوية.
    1. إزالة لوحات من الحاضنة، ووسائل الإعلام نضح، ويغسل ثلاث مرات مع اللاهوائية PBS وإضافة تصفيتها 2 مل 1.0٪ سابونين (أعد كما هو موضح في الخطوة 4.8). احتضان لمدة 15 دقيقة للسماح تحلل الخلية المضيفة.
    2. كشط الجزء السفلي من كل بئر مع مكشطة الخلية. جمع الخليط خلية من كل بئر وجعل 1: 1 في تخفيف BHI.
    3. المضي قدما لجعل التخفيفات التسلسلي للعينة. اعتمادا على الأنواع البكتيرية والتركيز، وضبط التخفيفات التسلسلية. عرض من 1: 100 أو 1: 1000 التخفيفات.
    4. لوحة 200 ميكرولتر من التخفيف المطلوب على لوحات أجار الدم. التفاف رانه لوحات في parafilm ووضعه في الحاضنة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية.
    5. وبعد سبعة أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، وإزالة لوحات والاعتماد مستعمرة (CFUs) باستخدام ضوء مربع لحساب المستعمرات يدويا.
      ملاحظة: يتم تعداد CFUs. لكميات أكبر من CFUs، يمكن أن تؤخذ الصور ويمكن استخدام برامج الكمبيوتر لتسهيل تعداد CFUs.
  9. بقاء البكتيريا المنضوية.
    1. إزالة لوحات من الحاضنة. يغسل ثلاث مرات مع اللاهوائية PBS وإضافة وسائط 2 مل VEGF مع تستكمل المضادات الحيوية (300 ميكروغرام / مل من جنتاميسين و 400 ميكروغرام / مل من ميترونيدازول).
    2. احتضان لمدة 1 ساعة. يجب التأكد من اختبار المضادات الحيوية بحيث تكون فعالة بنسبة 100٪ في قتل سلالة بكتيرية المطلوبة والتأكد من أنها لا تخترق الخلايا المضيفة 22،23.
    3. وسائل الاعلام نضح، إضافة 2 مل من تصفيتها 1.0٪ سابونين. احتضان لمدة 15 دقيقة للسماح تحلل الخلية المضيفة.
    4. كشط الجزء السفلي من كل أهلا وسهلالتر مع مكشطة الخلية. جمع الخليط خلية من كل بئر وجعل 1: 1 في تخفيف BHI.
    5. إعداد التخفيفات التسلسلي للعينة (1: 100، 1: 1000).
    6. لوحة 200 ميكرولتر من التخفيف المطلوب على لوحات أجار الدم. التفاف لوحات في parafilm ووضعه في الحاضنة اللاهوائية.
    7. بعد سبعة أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية إزالة لوحات والاعتماد CFUs.

figure-protocol-12570
الشكل 2. تمثيل تخطيطي للبروتوكول يستخدم لبقاء البكتيريا اللاهوائية مع الخلايا حقيقية النواة. كلا المقايسات لبقاء البكتيري الكلي وبقاء البكتيريا المنضوية لا يمكن أن يؤديها في نفس الوقت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. تدخيل البكتيريا في سي المضيفLLS (نيون الميكروسكوب)

ملاحظة: P. هو المسمى اللثوية مع 2 "، 7'-التسويات الدولية (2-Carboxyethyl) -5- (و6) -Carboxyfluorescein، Acetoxymethyl استر (BCECF-AM). BCECF-AM هو صبغة غير الفلورسنت نفاذية الغشاء. تحويل لBCECF فلوريسئين عن طريق عمل esterases الخلايا يمكن أن تشير إلى بقاء الخلية. P. هو المسمى اللثوية مع BCECF-AM صبغ وتستخدم بعد ذلك لتصيب الخلايا حقيقية النواة. بعد الإصابة، يتم إصلاح الخلايا وصفت مع دابي وTRITC-phalloidin. فإن وصمة عار دابي تستخدم لصبغ نواة الخلية حقيقية النواة أيضا تسمية نواة الخلية البكتيرية، والتي توفر التدبير مضادة للتعرف على البكتيريا غير قابلة للحياة لا يمكن أيضي يلتصق BCECF-AM. ويسلط الضوء على الخلايا المضيفة مع TRITC-phalloidin، والأكتين صبغة حمراء.

  1. coverslips الأوتوكلاف. جو معقم و مطهر إضافة coverslips لوحات 12-جيدا قبل البذر الخلايا البطانية في 5 × 10 4 خلايا / جيد. (اليوم إعداد قبل التجربة)
    2. هل لديك الخلايا البطانية التي أعدت حول 18 ملم (1.5 # سمك) coverslips دائرية في لوحات 12-جيدا كما هو موضح أعلاه.
  2. إعداد البكتيريا اللاهوائية نمت لمرحلة سجل منتصف (OD 660 = 0،5-0،7) كما هو موضح في القسم 1.
  3. البكتيريا غسل 2X مع اللاهوائية PBS بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج وتعليق بيليه في برنامج تلفزيوني في 5-7 × 10 8 خلية / مل.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من 0.2 ملي BCECF-AM إلى 2 مل من تعليق البكتيرية (5-7 × 10 8 خلية / مل) إلى التركيز النهائي من BCECF-AM من 2 ميكرومتر.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  6. لوحات نقل مع الخلايا البطانية المصنف على 18 ملم (1.5 # سمك) coverslips دائرية من نسيج الثقافة الحاضنة في غرفة اللاهوائية. يغسل مع برنامج تلفزيوني وتبادل مع وسائل الإعلام VEGF اللاهوائي.
    ملاحظة: تحقق من أن HUVECs يتمتعون بصحة جيدة تحت المجهر الضوئي. يجب أن يكون HUVECS ~ 80٪ متموجة، وينبغي أن يكون التشكل مماثلة لمصنعي.
  7. الطرد المركزي المسمى البكتيريا في5000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة المتبقي BCECF-AM الصبغة. تعليق في 2 مل اللاهوائي وسائل الإعلام VEGF.
  8. تصيب الخلايا المضيفة مع البكتيريا وصفت في وزارة الداخلية من 100: 1 (البكتيريا: المضيف).
  9. احتضان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. بعد غسل الخلايا العدوى مع PBS ثلاث مرات وإصلاح في طازجة 4.0٪ امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: بعد تحديد الخلايا، ويمكن إجراء التجربة خارج الغرفة اللاهوائية.
  11. غسل coverslips مع PBS ثلاث مرات.
  12. إضافة 1 مل من 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة.
  13. غسل coverslips مع PBS ثلاث مرات.
  14. إضافة 50 ميكرولتر من TRITC phalloidin (50 ميكروغرام / مل) إلى coverslips لمدة 45 دقيقة.
  15. غسل coverslips ثلاث مرات، وترفع من لوحة 12-جيدا وتوضع على شريحة مع لينة مجموعة متوسطة المتصاعدة التي تحتوي دابي. ختم الجانبين مع طلاء الأظافر.
    ملاحظة: الشرائح يمكن تخزينها لبضعة أشهر في الظلام. تجنب التعرض للضوء لمنع الصور وتبييض.
  16. عرض الشرائحباستخدام المجهر متحد البؤر.
    1. هنا، استخدم نظام 34 قناة الطيفية (32 قناة للكشف عن مجموعة واثنين من أجهزة الكشف عن الجانب PMT، بالإضافة إلى كاشف الضوء المرسل) تكوين حول وجود AxioObserver (مقلوب) الوقوف مع مرحلة XY بمحركات. النظام لديه خمسة الليزر: الصمام الثنائي الأزرق (405 نانومتر)، متعدد الخطوط الأرجون (458، 488، 514 نانومتر)، الصمام الثنائي الأخضر (561 نانومتر)، أحمر الحنة (633 نانومتر) و440 ليزر نابض نانومتر. تجهيز عمر نظام التصوير الإسفار مع 2 كشف GaAsP الهجين (لالحنق-فليم).
    2. كشف مضان من دابي وTRITC في قناة واحدة باستخدام فلتر مزدوج النطاق مع موجات الإثارة من 340-380 نانومتر و 540 حتي 560 نانومتر، وتصفية الانبعاثات من 435-485 نانومتر، و570-590 نانومتر على التوالي. كشف مضان من BCECF-AM باستخدام فلتر مع الطول الموجي الإثارة من 440-500 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 510-590 نانومتر.
      ملاحظة: ضوابط لBCECF-AM يجب القيام به على كل سلالة بكتيرية التي تجري دراستها لضمان وضع العلامات المناسبة من البكتيريا قادرة على البقاء. أولا التحقق من أن nonviabلو البكتيريا دابي إيجابية وسلبية BCECF. ثانيا، ضمان أن البكتيريا الحية يمكن ايض BCECF-AM في فلوريسئين BCECF. قد تحتاج إلى اختبار لوصفها الأمثل تركيزات مختلفة من البكتيريا أو BCECF-AM الصبغة.

النتائج

تم استخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه في دراسة التفاعل المضيف الممرض بين P. اللثوية والخلايا البطانية. P. اللثوية W83 وP. استخدمت اللثوية V3150 يحمل حذف PG0228 في الدراسة. ومن المتوقع أن PG0228 لترميز البروتين الذي قد يغير مستويات RNA والبروتينات، والتي قد تؤ?...

Discussion

كل الطرق المذكورة أعلاه يمكن استخدامها لتصميم فحوصات محددة لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك، هناك العديد من الاعتبارات اللازمة لإجراء التجارب بنجاح. هي أول السلالات الجرثومية لاستخدامها في الدراسة.

Disclosures

Authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.

Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type BCoy Laboratory ProductsModel 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep BloodBBL221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
Gentamicin Sulfate SaltSigma-AldrichG-1264
MetronidazoleSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloidin Sigma-AldrichP1951
18 mm Circular CoverslipsElectron Microscopy Sciences72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200

References

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106 Porphyromonas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved