JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Abstract

חיידקים אנאירוביים הרבה משיעור aerobes בהרבה נישות אנושיות כגון הבטן, פה, ונרתיק. יתר על כן, זיהומים אנאירוביים נפוצים ולעתים קרובות ממוצא ילידים. היכולת של כמה פתוגנים אנאירובי לפלוש תאים אנושיים נותנת להם אמצעי הסתגלות לברוח חסינות מולדת, כמו גם לווסת מארח התנהגות תא. עם זאת, על מנת להבטיח כי החיידקים אנאירוביים הם חיה במהלך החקירה ניסויית של האירועים יכולים להוות אתגר. Gingivalis Porphyromonas, anaerobe גראם שלילי, הוא מסוגל פולש מגוון של תאים שאינם phagocytic האיקריוטים. מאמר זה מתאר כיצד בהצלחה התרבות ולהעריך את היכולת של פ gingivalis לפלוש תאים אנושיים וריד טבור אנדותל (HUVECs). שני פרוטוקולים שפותחו: אחד למדוד חיידקים שהצלחה יכולה לפלוש ולשרוד בתוך המארח, והשני כדי להמחיש חיידקי אינטראקציה עם תאי מארח. טכניקות אלו מצריכות שימוש בanaerobic קאמרי לספק פ gingivalis עם סביבת אנאירובי לצמיחה אופטימלית.

הפרוטוקול הראשון מבוסס על assay הגנת האנטיביוטיקה, המשמש במידה רבה כדי ללמוד את הפלישה של תאי מארח על ידי חיידקים. עם זאת, assay הגנת האנטיביוטיקה הוא מוגבל; רק חיידקים תאיים שculturable הבא טיפול אנטיביוטי ותמוגה תא מארח נמדדים. כדי להעריך את כל חיידקי אינטראקציה עם תאי מארח, שני חיים ומתים, שפיתחנו פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון אינטראקציה מארח הפתוגן. חיידקים שכותרתו fluorescently עם 2 ', 7'-ביסה (2-carboxyethyl) -5- (ו- 6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl אסתר (BCECF-AM) ושימש להדביק תאים האיקריוטים בתנאים אנאירוביים. בעקבות תיקון עם paraformaldehyde וpermeabilization עם 0.2% Triton X-100, תאי מארח מסומנים עם phalloidin TRITC וDAPI לתייג שלד תא התא וגרעין, בהתאמה. הר"י מרובהGES נלקחה בנקודות שונות מוקד (Z-ערימה) מתקבלת להדמיה זמנית-מרחבי של חיידקים. שיטות ששמשו במחקר זה יכול להיות מיושמות על כל anaerobe לעיבוד חקלאי וכל סוג תא האיקריוטים.

Introduction

חיידקים אנאירוביים ליישב כמעט כל משטחים של הגוף האנושי. למרות דומיננטי בצמחייה של קטעי מעיים ומין ושתן שבו ריכוזי חמצן נמוכים, הם קיימים גם ברמות גבוהות על העור, פה, האף והגרון 1. חיידקים אנאירוביים הם גורם נפוץ של זיהומי אנדוגני ולעתים קרובות מבודדים מאתרים נגועים. עם זאת, בגלל אופיים האנין, אנאירוביים יכול להיות קשה לבודד ותרבות. מחקרים שכלל חיידקים אנאירוביים חייבים להיעשות בתנאים מוגבלים. טכניקות אנאירובי-תרבות מודרניות מאפשרות לחוקרים לחקות את הגדרות אנאירובי נדרשו ללמוד הרבה זני מעבדה אנאירובי או אפילו מבודד קליני 2,3.

חיידקים אנאירוביים פתוגניים פיתחו מערכת יחסים דינמיות ושיתוף אבולוציה עם תאי המארח שבו הם מתגוררים. רוב אנאירוביים רגישים להרג על ידי התגובה החיסונית המארח לפני שהגיע infectiרמות היחידות הארגוניות. עם זאת, כמה חיידקים פתוגניים פיתחו מנגנונים לברוח מאו לחתור תחת התגובה החיסונית המארח. הם להשיג מטרה זו באמצעות מנגנונים כגון התחמקות של הכרה חיסונית, נטרול של מתווכים חיסוניים, שינוי של חסינות תא בתיווך, פלישה של תאי מארח, ושינוי של חיסון איתות 4. Porphyromonas gingivalis, anaerobe גראם שלילי מעורב בשני אוראליים ו מחלות extraoral, הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים המותאם ביותר מסוגל לגרום שינויים פתוגניים במארח 5-7.

כיסים של שלט biofilm נצברו בנקיקים עמוקים שנוצרו בין השיניים וחניכיימיים הרקמה רירית יכול נמל חיידקים אנאירוביים שמוגנים מחמצן אטמוספרי 8. כיסי חניכיים אלו משמשים כנישה לפתוגנים אנאירובי שונים, כגון פ gingivalis 9. פ gingivalis הוא הפתוגן אבן הראשה כי הוא מסוגל לשפץing קהילת חיידקי הפה בדרכים שיקדמו התפתחות והתקדמות של מחלות חניכיים 10. היא מייצרת מספר רב של גורמים ארסי הפועלים נגד קשת רחבה של חלבוני מארח ומספק מנגנונים להתחמקות של הגנות מארח 11. הוא גם מסוגל לפלוש לאפיתל, אנדותל, fibroblastic, ותאי רצועת חניכיים במבחנה 12-14 וin vivo 15. על ידי יעילות פולש תאי מארח, פ gingivalis יכול לברוח חסינות מארח. פלישה אפקטיבית של תאי מארח מאפשרת לא רק החיידק לברוח הגנות מארח, אלא גם משמשת כמאגר לזיהום מחדש בעתיד, כמו גם משנה את התא המארח. מחקרים של המנגנונים המולקולריים המעורבים בהדבקה והפנמה של החיידק על ידי תאי מארח יש צורך. בהבנת האירועים המולקולריים הקשורים בהפנמה של פ מחקר במספר מעבדות מתמקד gingivalis על ידי תאי המארחכמו גם את המנגנונים המשמשים לדיכוי ולחטוף את התגובה החיסונית ולשרוד את מנגנוני הגנת מארח העוינים.

יש מבחני רבים מסוגלים לזהות ולאפיין פתוגנים המסוגלים פולש תאי מארח. עם זאת, מחקרים במבחנה עם פתוגנים אנאירובי מציבים בעיות ניסיוניות רבות לחוקר בעיקר משום שקשה לבצע מחקרים המסתמכים על מכשירים מגושמים בהיעדר חמצן. זה מורכב על ידי העובדה שתאים האיקריוטים דורשים חמצן כדי לגדול, וכך צריך להיות מוכנות בנפרד בחממות בתרבית רקמה. דרך אחת למנוע מכשולים כזה תהיה לבצע מחקרים בחמצן באטמוספרה, אבל זה יהפוך את הצמיחה של חיידקים אנאירוביים בלתי אפשרית. שיטה נוספת תהיה להשתמש חיידקים נהרגו חום להדביק וללמוד אינטראקציות מארח תאים. עם זאת, קיימים הבדלים בין חיידקים נהרגו חום ובת קיימא שיקטינו את הרלוונטיות של interacti מארח הפתוגןב -16 ב. היא מרכזית ללמוד חיידקי קיימא עם ביטוי ללא שינוי באינטראקציה עם תאי מארח; לכן, שיטות לculturing פ gingivalis בהגדרת אנאירובי מקבל. כמו כן, שני פרוטוקולים חסכוניים פשוטים הם הפגינו להערכת יכולתה של פ gingivalis להיות מופנם על ידי תאים אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVECs). הפרוטוקול הראשון מבוסס על assay הגנת האנטיביוטיקה הפופולרי. למרות assay הוא פשוט, ניתנים שיקולים בעת שימוש במייקרו-אורגניזמים אנאירובי. הפרוטוקול השני דורש שימוש במיקרוסקופ סריקת ניאון כדי לחזות אינטראקציה והפנים פ gingivalis. לכל assay מגבלות ויתרונות שיידונו לספק חוקר מתווה ללימוד הפולשנות של חיידקים אנאירוביים. למרות שכתב היד הנוכחית לומדת פ gingivalis וHUVECs, פרוטוקולים אלה יכולים לשמש להרבה חיידקים אנאירוביים אחרים גם כןכעבור סוגים אחרים של תאי מארח.

Protocol

הפרוטוקולים הבאים יתארו את השיטות לculturing ולומד את הפלישה של מיני אנאירובי, פ gingivalis; עם זאת, פרוטוקולים אלה עשויים לשמש למספר פתוגנים אנאירובי. למרות HUVECs משמש, פרוטוקול זה יכול לשמש לתאים האיקריוטים אחרים שני חיסוניים ואינם חסינים.

1. אנאירובית קאמרי שימוש ותחזוקה

הערה: פ gingivalis הוא anaerobe רגיש לרמות נורמליות של חמצן נתקלו באוויר הסביבה. סביבת אנאירובי מבוקרת היא חיונית לטיפוח של פ gingivalis.

  1. כאן, לשמור על אווירה מלאכותית המיועדת כגז אנאירובי מעורב (80% N 2, 10% H 2, 10% CO 2) בתא אנאירובי ויניל (איור 1 א). השתמש במנעל אוויר (איור 1) להעברת פריטים מסביבת המעבדה לתא אנאירובי. מנעל האוויר פועל באופן ידני, TWהקאה קרח עם גז 2 N לפני החדרת גז אנאירובי המעורב.
  2. השתמש בעמודת הסרת מימן הגופרתי (איור 1 ג) להסרת ללא תחזוקה של המימן גופרתי לא רצוי. הנח מסיר לחות בתוך התא כדי להסיר H 2 O שנוצר על ידי הזרז ולהימנע מתרסיסים המאפשרים את התפשטות הזיהום.
    הערה: מימן גופרי הוא תוצר לוואי טבעי חילוף חומרים של חיידקים אנאירוביים רבים וההצטברות שלה היא רעילה לחיידקים ויכולה לגרום נזק לאלקטרוניקה ולהקטין את משך החיים של זרז.
  3. השתמש בתיבת אוהד להפיץ אווירה של החדר באמצעות זרז פלדיום, אשר מסיר חמצן בנוכחות של מימן (1D איור).
    הערה: מסנן הסירקולציה המחודשת באטמוספרה (HEPA) מסיר חומרים מזהמים הנישאים באוויר עם גודל של 0.22 מיקרומטר או גדולים יותר.
  4. חיידקים אנאירוביים תרבות בחממה 37 ° C שממוקם בתוך אנאירוביתָא. להשתמש בטכניקות אספטיים סטנדרטיים כאשר עובדים בתוך חדר אנאירובי.

figure-protocol-2105
איור 1. קאמרי ויניל אנאירוביים ומרכיביו. (א) תא אנאירובי ויניל האטום לחלוטין מחמצן אטמוספרי מספק סביבת עבודה לשני אנשים בכל פעם (32 בx 78 ב). הוא מכיל חממה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס (חזרה באמצע). (ב) מנעל אוויר משמש להעברה של פריטים מסביבת המעבדה לתא אנאירובי. בתמונה היא מנעל אוויר אוטומטי המופעל באמצעות בקר שניתן לתכנת לבצע באופן אוטומטי נהלי הוואקום וטיהור דרושים כדי ליצור סביבת אנאירובי. טור ההסרה (C) מימן גופרתי מספק הסרת קיבולת גבוהה ללא תחזוקה של מימן גופרתי לא רצוי. (ד) שתי קופסות אוהד זרז הןלהציב ברחבי תא אנאירובי כדי לעזור להפיץ את האווירה בחדר באמצעות זרז פלדיום, אשר, בנוכחות של מימן, חמצן מסיר. תא אנאירובי מוגדר על פי הוראות יצרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. הכנה של חיידקים אנאירוביים

הערה: פ gingivalis הוא aerotolerant ויכול להיות מאוחסן בתנאים אירוביים אבל זה לא יגדל בנוכחות החמצן ברמות גבוהות יותר מ -6% 17,18. תא אנאירובי הוא הכרחי לטיפוח הנכון של פ gingivalis ומינים אחרים אנאירובי (איור 1). הכשרה מתאימה וחינוך על שימוש תא אנאירובי נדרש לפני העבודה עם microanaerobes 19.

  1. לאזן את כל התקשורת הנוזלית וצלחות לקונדיט אנאירובייונים עבור שעות לפחות 12 לפני ניסויים כדי להסיר חמצן שיורית.
  2. העבר את פ gingivalis מהמקפיא -80 ° C לחדר אנאירובי, בוא הפשרה.
  3. פס פ gingivalis על צלחות אגר דם סויה trypticase (TSA השני עם 5% דם כבשים). לעטוף צלחות בparafilm וחנות על 37 מעלות צלזיוס בחממת אנאירובי ל4-7 ימים.
  4. לחסן פ gingivalis ל -3 עירוי לב מיליליטר מוח מרק (BHI) בתוספת hemin וMenadione, תקשורת נוזלית הלא סלקטיבי מועשר לבידוד והתרבות של אנאירובי ומיקרואורגניזמים אנינים, באמצעות לולאות סטרילי.
    הערה: אחסון לטווח ארוך, לערבב תרבויות חיידקים מוכנות בBHI עם גליצרול או DMSO (10-20% ריכוז סופי) ומקום במקפיא C -80 °.
  5. הכן תרבות המתנע של פ gingivalis על ידי ביצוע דילול 1:10 ומאפשר לחיידקים לגדול עד שלב אמצע יומן.

הערה: הצפיפות האופטית של Bacההשעיה terial נקבעה וריכוז החיידקים עבור כל זן להיבדק מותאם. לפ gingivalis השעיה בOD 660 של 0.7 מקבילה שלב אמצע יומן-ו~ 7 x 10 8 תאים / מיליליטר. תנאי גידול מתוארים בפרוטוקול לעיל הנן ספציפיים לפ gingivalis וייתכן שיצטרך להיות מותאם לזני חיידקים אחרים.

3. תרבית תאי האנדותל

הערה: הרכישה נקוותה HUVECs ראשוני ותרבות במדיום בסיסי המכיל גורמי כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על פי הוראות יצרן.

  1. HUVECs זרע בT-75 צלוחיות על 2.5 x 10 5 תאים / בקבוק 15 מיליליטר בתקשורת VEGF.
    הערה: בדוק כדאיות באמצעות דילול 1: 1 עם 4.0% trypan כחולים. תאים עם קרום בסכנה ישמור trypan כחול, תאים בריאים עם קרומים שיופיעו לבנים כאשר מתחת למיקרוסקופ אור משקפת. CounT 100 תאים, להבטיח כי מעל 80% מתאי קיימא 20.
  2. החלף תקשורת כל 2 ימים עם תקשורת VEGF הטרי מראש התחמם עד תאים להגיע ~ 80% confluency.
  3. שטוף תאים פעם עם PBS מראש חימם. לשחרר תאים מהבקבוק T75 ידי דוגרים עם 2 מיליליטר טריפסין- EDTA (0.25%) במשך 5 דקות ואחריו פתרון נטרול 2 מיליליטר טריפסין.
  4. לאסוף HUVECs התלוי בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לשטוף את כל תאים נוספים מT-75 צלוחיות עם PBS ולהעביר ל -50 מיליליטר צינורות חרוטי.
  5. תאי צנטריפוגה XG 200 במשך 10 דקות.
  6. הסר supernatant, להשעות תא גלולה ב 10 מיליליטר תקשורת VEGF המחומם מראש.
  7. לקבוע את ריכוז תאים באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירת תאים דומה.
  8. חישוב סכום של השעיה תא להוסיף לאו צלחת 6-היטב (400,000 / טוב) או צלחת 12 גם עם coverslips (50,000 / טוב). HUVECs יהיה מוכן לניסויים למחרת.

4. הישרדות assay פלישה / אינטראקציה(ציפוי)

הערה: בעת ביצוע assay זה, להכין את שני 6-גם צלחות של תאי האנדותל שנזרעו ב400,000 תאים / טוב. צלחת אחת תשמש להעריך חיידקים מצורפים והפנימו על ידי תאי מארח. הצלחת אחרת תביא בחשבון חיידקים תאיים. 6-גם הצלחת מאפשרת לtriplicates של שתי דגימות שיש לבצע בניסוי אחד. לקווי מתאר של פרוטוקול זה מתייחס בבקשה לתרשים הזרימה assay ההישרדות (איור 2).

  1. הכן חיידקים אנאירוביים כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 1) עד שהם מגיעים צמיחת אמצע יומן (OD 660 0.5-0.7).
  2. חיידקי צנטריפוגה ב XG 5000 במשך 10 דקות.
    הערה: אם צנטריפוגה הוא תא אנאירובי מחוץ, לבצע דגימות חיידקים בצינור 15 מיליליטר סגור היטב, לעטוף את הכובע עם parafilm כדי למנוע דליפת חמצן.
  3. מניחים פ pelleted gingivalis בחזרה בחדר, להשליך supernatant. לשטוף עם PBS, חיידקי גלולה שוב לפני resuspending בVEGFקוטר. הכן השעיות לכל זני החיידקים שנבדקו בOD 660 של 0.7 אשר תואמים את שלב אמצע יומן (~ / 7 x 10 8 תאי מיליליטר). החיידקים מוכנים לזיהום עכשיו.
  4. 6-גם צלחות העברה המכילות HUVECs מתרבית רקמת חממה לתא אנאירובי. הסר תקשורת לשטוף שלוש פעמים עם PBS אנאירובי. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת VEGF אנאירובי היטב כל אחד ולמקם את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בחממת אנאירובי במשך 20 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה לזיהום.
    הערה: חיידקי פלייט על צלחות אגר דם על מנת להבטיח את אלה המשמשים להדבקה הם הומוגנית ולא מזוהם על זיהום.
  5. להדביק תאי מארח עם חיידקים בריבוי של זיהום (חיידקי משרד הפנים: מארח) של 100: 1.
    הערה: מספר תאי HUVEC נקבע על ידי ביצוע בדיקת הדרת trypan על גם אחת לפני ההדבקה. מספר תא חיידק נקבע באמצעות צפיפות אופטית (למשל, OD של 0.5 = 5 x 10 8 תאים / מיליליטר). Bריכוז acterial מותאם למשרד פנים נכונים המבוסס על ריכוז HUVECs 21.
  6. מניחים 6-גם צלחות עם HUVECs הנגוע לתוך חממת אנאירובי ולאפשר לחיידקים לתקשר עם תאי מארח למשך 30 דקות.
  7. הכן saponin בBHI (1.0% w / v) בתוך חדר אנאירובי ולסנן דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
  8. הישרדות של שני חיידקים מצורפים והפנימו.
    1. הסר צלחות מן החממה, התקשורת לשאוב, לשטוף שלוש פעמים עם אנאירובי PBS ולהוסיף 2 מיליליטר מסונן 1.0 saponin% (שהוכן כמתואר בשלב 4.8). דגירה במשך 15 דקות כדי לאפשר תמוגה תא מארח.
    2. לגרד תחתון של כל אחד גם עם מגרד תא. לאסוף את תערובת תא מכל טוב ולעשות דילול 1: 1 בBHI.
    3. המשך לעשות דילולים סדרתי של המדגם. בהתאם למין וריכוז חיידקים, להתאים דילולים סדרתי. התחל עם 1: 100 או 1: 1,000 דילולים.
    4. פלייט 200 μl של דילול רצוי על צלחות אגר דם. לא לעטוףהוא צלחות בparafilm ומקום בחממת אנאירובי על 37 מעלות צלזיוס.
    5. בעקבות שבעה ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, להסיר את הצלחות ולספור יחידות מושבה להרכיב (CFUs) באמצעות תיבת אור לספור ידני מושבות.
      הערה: CFUs מנוי. לכמויות גדולות יותר של CFUs, תמונות ניתן לקחת ותוכנת מחשב יכול לשמש כדי להקל על הספירה של CFUs.
  9. הישרדות של חיידקים הפנימו.
    1. הסר צלחות מן החממה. לשטוף שלוש פעמים עם אנאירובי PBS ולהוסיף 2 מיליליטר תקשורת VEGF עם (300 מיקרוגרם / מיליליטר של גנטמיצין ו -400 מיקרוגרם / מיליליטר של metronidazole) בתוספת אנטיביוטיקה.
    2. דגירה עבור שעה 1. הקפד לבדוק את האנטיביוטיקה כך שהם 100% יעילים בחיסול זן החיידקים הרצוי ולוודא שהם לא לחדור לתאי מארח 22,23.
    3. תקשורת לשאוב, להוסיף 2 מיליליטר של saponin 1.0% מסוננים. דגירה במשך 15 דקות כדי לאפשר תמוגה תא מארח.
    4. לגרד תחתית כל well עם מגרד תא. לאסוף את תערובת תא מכל טוב ולעשות 1: 1 דילול בBHI.
    5. הכן דילולים סידוריים של המדגם (1: 100, 1: 1,000).
    6. פלייט 200 μl של דילול רצוי על צלחות אגר דם. לעטוף צלחות בparafilm ומקום בחממת אנאירובי.
    7. לאחר שבעה ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס להסיר צלחות ולספור CFUs.

figure-protocol-11643
איור 2. ייצוג סכמטי של פרוטוקול המשמש להישרדות של חיידקים אנאירוביים עם תאים האיקריוטים. שני מבחני להישרדות חיידקים כוללת והישרדות של חיידקים הפנימו יכולים להתבצע באותו הזמן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. הפנמה של חיידקים לCe מארחLLS (פלורסנט מיקרוסקופית)

הערה: פ gingivalis מתויג עם 2 ', 7'-ביסה (2-Carboxyethyl) -5- (ו- 6) -Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl אסתר (BCECF-AM). BCECF-AM הוא צבע קרום חדיר לא פלורסנט; המרתו לBCECF והעמסת באמצעות הפעולה של esterases תאיים יכולה להצביע על כדאיות תא. פ gingivalis מתויג עם צבע BCECF-AM ולאחר מכן השתמש כדי להדביק תאים האיקריוטים. בעקבות זיהום, תאים הם קבועים ומסומנים עם DAPI וTRITC-phalloidin. כתם DAPI משמש להכתים את גרעין התא האיקריוטים גם לתייג גרעין תא חיידק, אשר מספק נגדי מידה לזהות חיידקים שאינם בת-קיימא שלא יכול מטבולית BCECF-AM ידבק. תאי מארח מודגשים עם TRITC-phalloidin, צבע אקטין אדום.

  1. coverslips החיטוי. סביבה נקיה מחיידקים להוסיף coverslips לצלחות 12-היטב לפני זריעת תאי אנדותל בשעת 5 x 10 4 תאים / טוב. (יום הוכן לפני הניסוי)
  2. יש לי תאי האנדותל שהוכנו על 18 מ"מ (# 1.5 עובי) coverslips העגול בלוחות 12 גם כמתואר לעיל.
  3. הכן חיידקים אנאירוביים גדלו שלב אמצע יומן (OD 660 = 0.5-0.7) כאמור בסעיף 1.
  4. חיידקים לשטוף 2X עם אנאירובי PBS על ידי צנטריפוגה בXG 5000 והשעיית גלולה PBS ב 5-7 x 10 8 תאים / מיליליטר.
  5. הוסף 20 μl של 0.2 מ"מ BCECF-AM 2 מיליליטר של השעיה חיידקים (5-7 x 10 8 תאים / מיליליטר) לריכוז סופי של BCECF-AM של 2 מיקרומטר.
  6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
  7. העברת צלחות עם תאי האנדותל שנזרעו על 18 מ"מ (# 1.5 עובי) coverslips חוזר מתרבית רקמת חממה לתוך תא אנאירובי. לשטוף עם PBS וחילופים עם תקשורת VEGF אנאירובי.
    הערה: ודא שHUVECs בריא תחת מיקרוסקופ אור. HUVECs צריך להיות ~ 80% ומחוברות, מורפולוגיה צריכה להיות דומות ליצרנים.
  8. חיידקי צנטריפוגה שכותרתו בXG 5000 במשך 10 דקות כדי להסיר צבע BCECF-AM שייר. להשעות 2 מיליליטר תקשורת VEGF אנאירובי.
  9. להדביק תאי מארח עם חיידקים שכותרתו במשרד הפנים של 100: 1 (חיידקים: מארח).
  10. דגירה בתא אנאירובי על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  11. לאחר תאים לשטוף זיהום עם PBS פעמים שלוש ולתקן בparaformaldehyde 4.0% מוכנים טרי במשך 10 דקות.
    הערה: לאחר תיקון תאים, ניסוי יכול להתנהל מחוץ לתא אנאירובי.
  12. לשטוף coverslips עם PBS פעמים שלוש.
  13. הוסף 1 מיליליטר של 0.2% Triton X-100 במשך 10 דקות.
  14. לשטוף coverslips עם PBS פעמים שלוש.
  15. הוסף 50 μl של phalloidin TRITC (50 מיקרוגרם / מיליליטר) לcoverslips במשך 45 דקות.
  16. לשטוף coverslips שלוש פעמים, להסיר מהצלחת והמקום 12 גם בשקופית עם הרכבה בינונית רך-סט המכילים DAPI. לאטום את הצדדים עם לק.
    הערה: שקופיות יכולות להיות מאוחסנות במשך כמה חודשים בחושך. הימנע מחשיפה לאור, כדי למנוע צילום הלבנת.
  17. צפה בשקופיותבאמצעות מיקרוסקופ confocal.
    1. כאן, משתמש במערכת 34 ערוץ רפאים (גלאי מערך 32 ערוצים ושני גלאי PMT הצד, בתוספת גלאי אור מועבר) המוגדרת סביב AxioObserver (הפוך) עומד עם שלב XY ממונע. המערכת כוללת חמישה לייזרים: דיודה הכחולה (405 ננומטר), (ננומטר 458, 488, 514) רב-קו ארגון, דיודה הירוקה (561 ננומטר), HeNe האדום (633 ננומטר) וליזר פעם ננומטר 440. לצייד מערכת הדמיה לכל החיים הקרינה עם 2 גלאי Gaasp היברידיים (לסריג-FLIM).
    2. זיהוי הקרינה מDAPI וTRITC בערוץ אחד באמצעות מסנן להקה כפולה עם אורכי גל עירור של 340-380 ננומטר ו540-560 ננומטר, ומסנן פליטה של ​​435-485 ננומטר ו570-590 ננומטר, בהתאמה. זיהוי הקרינה מBCECF-AM באמצעות מסנן עם גל עירור של 440-500 ננומטר ומסנן פליטה של ​​510-590 ננומטר.
      הערה: בקרה לBCECF-AM צריך להיעשות בכל זן חיידקים הנלמד כדי להבטיח תיוג נכון של חיידקי קיימא. ראשית לאמת nonviab שחיידקי le הם DAPI חיוביים ושלילי BCECF. שנית, להבטיח כי חיידקים חיים יכולים לעכל BCECF-AM לBCECF והעמסת. ריכוזים משתנה של החיידקים או צבע BCECF-AM ייתכן שיהיו הצורך להיבדק לתיוג אופטימלי.

תוצאות

פרוטוקולים שתוארו לעיל שמשו בלימוד האינטראקציה מארח הפתוגן בין פ gingivalis ותאי האנדותל. פ gingivalis W83 ופ gingivalis V3150 ביצוע מחיקה של PG0228 שימש במחקר. PG0228 צפוי לקודד חלבון שעשוי לשנות את הרמות של RNA וחלבונים, אשר עשוי להשפיע בסופו של אינטראקציה של פ gingivalis עם תא?...

Discussion

כל השיטות הנ"ל יכולות לשמש כדי לתכנן מבחני ספציפיים על מנת להעריך את האינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאים האיקריוטים. עם זאת, יש כמה שיקולים לבצע בהצלחה את הניסויים. הם ראשון זני חיידקים לשימוש במחקר.

זה חיוני בהשוואה של ש?...

Disclosures

Authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.

Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type BCoy Laboratory ProductsModel 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep BloodBBL221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
Gentamicin Sulfate SaltSigma-AldrichG-1264
MetronidazoleSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloidin Sigma-AldrichP1951
18 mm Circular CoverslipsElectron Microscopy Sciences72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200

References

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106Gingivalis Porphyromonas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved