JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Resumen

Las bacterias anaerobias son mucho más numerosos aerobios en muchos nichos humanos, como el intestino, la boca y la vagina. Además, las infecciones anaeróbicas son comunes y con frecuencia de origen indígena. La capacidad de algunos patógenos anaeróbicos para invadir las células humanas les da medidas de adaptación para escapar de la inmunidad innata, así como para modular el comportamiento de la célula huésped. Sin embargo, lo que garantiza que las bacterias anaerobias son en vivo durante la investigación experimental de los eventos puede plantear desafíos. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas, es capaz de invadir una variedad de células no fagocíticas eucariotas. En este artículo se describe cómo con éxito la cultura y evaluar la capacidad de P. gingivalis para invadir las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se desarrollaron dos protocolos: uno para medir las bacterias que pueden invadir y sobrevivir con éxito dentro del huésped, y el otro para visualizar las bacterias que interactúan con las células huésped. Estas técnicas requieren el uso de un anaeRobic cámara para suministrar P. gingivalis con un ambiente anaeróbico para un crecimiento óptimo.

El primer protocolo se basa en el ensayo de protección a los antibióticos, que se utiliza en gran medida para estudiar la invasión de células huésped por bacterias. Sin embargo, el ensayo de protección de antibiótico es limitada; sólo las bacterias intracelulares que son cultivables tras el tratamiento antibiótico y la lisis de la célula huésped se miden. Para evaluar todas las bacterias que interactúan con las células huésped, tanto vivas y muertas, hemos desarrollado un protocolo que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar la interacción huésped-patógeno. Las bacterias se marcaron fluorescentemente con 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína acetoximetilo éster (BCECF-AM) y se utiliza para infectar las células eucariotas bajo condiciones anaeróbicas. Después de la fijación con paraformaldehído y permeabilización con 0,2% Triton X-100, las células huésped se etiquetan con TRITC faloidina y DAPI para etiquetar el citoesqueleto de la célula y el núcleo, respectivamente. Múltiple images tomadas en diferentes puntos focales (Z-pila) se obtienen para la visualización temporal-espacial de las bacterias. Los métodos utilizados en este estudio se pueden aplicar a cualquier anaerobio cultivable y cualquier tipo de célula eucariota.

Introducción

Las bacterias anaerobias colonizan casi todas las superficies del cuerpo humano. Aunque predominante en la flora de los tractos intestinales y genitourinarias, donde las concentraciones de oxígeno son bajos, sino que también existen en altos niveles en la piel, la boca, la nariz y la garganta 1. Las bacterias anaerobias son una causa común de infecciones endógenas y se aíslan con frecuencia de sitios enfermos. Sin embargo, debido a su naturaleza fastidioso, anaerobios pueden ser difíciles de aislar y cultivar. Los estudios que incluyen bacterias anaerobias deben realizarse bajo condiciones restringidas. Técnicas anaeróbica de cultivo modernos permiten a los investigadores para imitar la configuración anaeróbicas necesarias para estudiar muchas cepas de laboratorio anaeróbico o incluso aislados clínicos 2,3.

Bacterias anaerobias patógenas han desarrollado una relación dinámica y co-evolución con las células huésped en las que residen. La mayoría de los anaerobios son susceptibles a la destrucción por la respuesta inmune del huésped antes de llegar a infectiniveles sas. Sin embargo, algunas bacterias patógenas han desarrollado mecanismos para escapar de o subvertir el respuesta inmune del huésped. Logran este objetivo a través de mecanismos tales como la evasión de reconocimiento inmune, la neutralización de mediadores inmunes, alteración de la inmunidad celular, la invasión de las células huésped, y la alteración de inmune de señalización 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativas implicado en tanto oral como enfermedades extraorales, es un ejemplo de un patógeno bacteriano altamente adaptada capaz de causar cambios patógenos en el hospedador 5-7.

Los bolsillos de la placa de biofilm devengan en profundas grietas que se forman entre los dientes y la mucosa gingival tejido pueden albergar bacterias anaerobias que están protegidos de oxígeno atmosférico 8. Estas bolsas periodontales sirven como un nicho para diversos patógenos anaerobios, tales como P. gingivalis 9. P. gingivalis es un patógeno piedra angular que es capaz de remodelacióning la comunidad microbiana oral en formas que promuevan el desarrollo y la progresión de las enfermedades periodontales 10. Produce un gran número de factores de virulencia que son activos contra un amplio espectro de proteínas del huésped y proporciona mecanismos para la evasión de las defensas del huésped 11. También es capaz de invadir células epiteliales, endoteliales, fibroblastos, y células del ligamento periodontal in vitro 12-14 in vivo 15. Al invadir con eficacia las células huésped, P. gingivalis puede escapar la inmunidad del huésped. Invasión eficaz de las células huésped no sólo permite la bacteria para escapar de las defensas del huésped sino que también sirve como un depósito para futuras re-infección, así como altera la célula huésped. Se necesitan estudios de los mecanismos moleculares implicados en la adhesión y la internalización de la bacteria por células huésped. La investigación en varios laboratorios se centra en la comprensión de los eventos moleculares asociados con la internalización de P. gingivalis por las células huéspedasí como los mecanismos utilizados para reprimir y secuestrar la respuesta inmune y sobrevivir a los mecanismos de defensa del huésped hostiles.

Hay muchos ensayos capaces de identificar y caracterizar los agentes patógenos que son capaces de invadir células huésped. Sin embargo, los estudios in vitro con patógenos anaeróbicos plantean muchos problemas experimentales para el investigador principalmente porque es difícil llevar a cabo estudios que se basan en instrumentos voluminosos en la ausencia de oxígeno. Esto se ve agravado por el hecho de que las células eucariotas requieren oxígeno para crecer y por lo tanto deben ser preparados por separado en incubadoras de cultivo de tejidos. Una forma de evitar estos obstáculos sería realizar los estudios con el oxígeno del aire, pero eso haría que el crecimiento de las bacterias anaerobias imposible. Otro método sería utilizar bacterias muertas por calor para infectar y estudiar las interacciones de la célula huésped. Sin embargo, existen diferencias entre las bacterias muertas por calor y viables que disminuyen la relevancia de la interacti huésped-patógenoel 16. Es fundamental para estudiar bacterias viables con la expresión inalterada la interacción con las células huésped; por lo tanto, métodos para el cultivo de P. se dan gingivalis en un entorno anaeróbico. También, dos protocolos rentables simples se demuestran para la evaluación de la capacidad de P. gingivalis a ser internalizado por las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC). El primer protocolo se basa en el ensayo de protección populares antibiótico. Aunque el ensayo es sencillo, se dan consideraciones al utilizar microorganismos anaerobios. El segundo protocolo requiere el uso de un microscopio de barrido fluorescente para visualizar la interacción e internalizado P. gingivalis. Cada ensayo tiene sus limitaciones y ventajas que se tratarán de proporcionar al investigador un esquema para el estudio de la invasión de bacterias anaerobias. Aunque el manuscrito actual estudia P. gingivalis y HUVECs, estos protocolos se pueden utilizar para muchas otras bacterias anaerobias, asíEn cuanto a otros tipos de células huésped.

Protocolo

Los siguientes protocolos se describen métodos para el cultivo y el estudio de la invasión por las especies anaerobias, P. gingivalis; sin embargo, estos protocolos pueden ser utilizados para una serie de patógenos anaerobios. Aunque se utilizan HUVECs, este protocolo puede ser utilizado para otras células eucariotas, tanto inmunes y no inmunes.

1. anaeróbico Cámara de uso y mantenimiento

Nota: P. gingivalis es un anaerobio sensible a los niveles normales de oxígeno encontrado en el aire ambiente. Un ambiente anaeróbico controlado es vital para el cultivo de P. gingivalis.

  1. Aquí, mantener una atmósfera artificial designado como gas anaeróbico mixta (80% N 2, 10% H 2, 10% de CO 2) en una cámara anaeróbica de vinilo (Figura 1A). Utilice una esclusa de aire (Figura 1B) para la transferencia de los artículos en el entorno del laboratorio a la cámara anaeróbica. La esclusa de aire opera manualmente, twpurga hielo con gas N2 antes de introducir el gas anaeróbico mixta.
  2. Utilice una columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno (Figura 1C) para la eliminación libre de mantenimiento del sulfuro de hidrógeno indeseable. Coloque un deshumidificador dentro de la cámara para eliminar el H 2 O creado por el catalizador y para evitar los aerosoles que facilitan la dispersión de la contaminación.
    Nota: El sulfuro de hidrógeno es un subproducto metabólico natural de muchas bacterias anaerobias y su acumulación es tóxico para las bacterias y puede resultar en el daño a la electrónica y disminuir el tiempo de vida de un catalizador.
  3. Utilice una caja de ventilador para hacer circular la atmósfera de la cámara a través de un catalizador de paladio, que elimina el oxígeno en presencia de hidrógeno (Figura 1D).
    Nota: Un atmosférica (HEPA) elimina la recirculación de contaminantes en el aire con un tamaño de 0,22 micras o más grandes.
  4. Bacterias anaerobias Cultura en una incubadora a 37 ° que se encuentra dentro del anaeróbicocámara. Utilizar técnicas asépticas estándar cuando se trabaja dentro de la cámara anaeróbica.

figure-protocol-2391
Figura 1. cámara anaeróbica de vinilo y sus componentes. (A) una cámara anaeróbica de vinilo sellada completamente de oxígeno atmosférico proporciona espacio de trabajo para dos personas a la vez (32 x 78 en in). Contiene una incubadora a 37 ° C (media de la espalda). (B) Una esclusa de aire se utiliza para la transferencia de los artículos en el entorno de laboratorio a la cámara anaeróbica. En la foto, una esclusa de aire automático operado a través de un controlador que puede ser programado para realizar automáticamente los procedimientos de vacío y purga necesarios para crear un ambiente anaerobio. (C) Un sulfuro de hidrógeno Columna Remoción proporciona la eliminación de gran capacidad sin necesidad de mantenimiento de sulfuro de hidrógeno indeseable. (D) Dos cajas de ventiladores catalizador soncolocado en toda la cámara anaeróbica para ayudar a circular la atmósfera de la cámara a través de catalizador de paladio, el cual, en presencia de hidrógeno, elimina el oxígeno. La cámara anaeróbica está configurado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación de bacterias anaerobias

Nota: P. gingivalis es aerotolerant y puede ser almacenado en condiciones aeróbicas pero no va a crecer en la presencia de oxígeno a niveles superiores a 6% 17,18. Una cámara anaeróbica es necesario para el cultivo apropiado de P. gingivalis y otras especies anaerobias (Figura 1). Se requiere capacitación adecuada y la educación sobre el uso de cámara anaeróbica antes de trabajar con microanaerobes 19.

  1. Equilibrar todos los medios líquidos y placas a Condit anaeróbicoiones durante al menos 12 horas antes de la experimentación para eliminar el oxígeno residual.
  2. Traslado P. gingivalis desde -80 ° C congelador para cámara anaeróbica, permiten deshielo.
  3. Streak P. gingivalis en placas de agar sangre tripticasa de soja (TSA II con 5% de sangre de oveja). Envuelva las placas en parafina y se almacena a 37 ° C en una incubadora anaeróbico durante 4-7 días.
  4. Inocular P. gingivalis en 3 ml de infusión de cerebro corazón (BHI) suplementado con hemina y menadiona, un enriquecidos medios líquidos no selectivos para el aislamiento y cultivo de anaerobios y microorganismos exigentes, utilizando bucles estériles.
    Nota: Para el almacenamiento a largo plazo, mezclar cultivos bacterianos preparados en BHI con glicerol o DMSO (concentración final 10 a 20%), y meterlo en un congelador a -80ºC.
  5. Preparar un cultivo iniciador de P. gingivalis haciendo una dilución 1:10 y permitiendo que las bacterias crecen hasta la fase semilogarítmica.

Nota: La densidad óptica de la bacsuspensión terial se determina y la concentración bacteriana para cada cepa ser examinado se ajusta. Para P. gingivalis una suspensión a una DO 660 de 0,7 corresponde a la fase semilogarítmica y ~ 7 x 10 8 células / ml. Las condiciones de crecimiento descritas en el protocolo anterior son específicos para P. gingivalis y pueden necesitar ser adaptado para otras cepas bacterianas.

3. Cultivo Celular Endotelial

Nota: Compra agruparon HUVECs primarias y cultivo en medio basal que contienen factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

  1. HUVECs de semillas en matraces T-75 en 2.5 x 10 5 células / matraz de 15 ml en los medios de comunicación VEGF.
    Nota: Consulte la viabilidad a través de una dilución 1: 1 con 4,0% de azul de tripano. Las células con una membrana comprometida retendrá azul tripán, aparecerá blanco células sanas con membranas intactas cuando se observa bajo un microscopio óptico binocular. CounT 100 células, asegúrese de que más del 80% de las células son viables 20.
  2. Reemplace los medios cada 2 días con pre-calentado medios VEGF fresca hasta que las células alcanzan ~ 80% de confluencia.
  3. Lavar las células una vez con PBS pre-calentado. Libera a las células del matraz T75 mediante incubación con 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 min seguido de una solución neutralizante 2 ml de tripsina.
  4. Recoger HUVECs en suspensión en un tubo cónico de 50 ml. Lavar las células adicionales de T-75 frascos con PBS y transferir a 50 ml tubos cónicos.
  5. Células centrifugar a 200 xg durante 10 min.
  6. Aspirar el sobrenadante, suspender el sedimento celular en 10 ml de medio de VEGF pre-calentado.
  7. Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células similar.
  8. Calcular la cantidad de suspensión celular para agregar a cualquier placa de 6 pocillos (400.000 / pocillo) o una placa de 12 pocillos con cubreobjetos (50.000 / pocillo). HUVECs estará listo para la experimentación el día siguiente.

4. Supervivencia ensayo de invasión / Interacción(Enchapado)

Nota: Al realizar este ensayo, se preparan dos placas de 6 pocillos de células endoteliales sembradas a 400.000 células / pocillo. Una placa se usa para evaluar las bacterias unidas a y internalizados por células huésped. La otra placa dará cuenta de bacterias intracelulares. La placa de 6 pocillos permite triplicados de dos muestras que se realizan en un solo experimento. Para una descripción de este protocolo por favor refiérase al diagrama de flujo ensayo de supervivencia (Figura 2).

  1. Preparar las bacterias anaerobias como se describió anteriormente (véase la sección 1) hasta que alcancen un crecimiento semilogarítmica (OD 660 0,5-0,7).
  2. Bacterias centrifugar a 5000 xg durante 10 min.
    Nota: Si centrífuga es cámara anaeróbica exterior, llevar muestras de bacterias en un tubo de 15 ml cerrado herméticamente, envuelva la tapa con parafilm para evitar la fuga de oxígeno.
  3. Coloque granulado P. gingivalis atrás en la cámara, se descarta el sobrenadante. Lavar con PBS, las bacterias de pellets de nuevo antes de la resuspensión de VEGF mídia. Preparar suspensiones para todas las cepas bacterianas a ensayar a una DO 660 de 0,7 que corresponde a la fase semilogarítmica (~ 7 x 10 8 células / ml). Las bacterias están ahora listos para la infección.
  4. Transferencia de placas de 6 pocillos que contienen HUVECs de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Retire los medios de comunicación y lavar tres veces con PBS anaeróbico. Añadir 2 ml de medio anaeróbico VEGF a cada pocillo y colocar las placas a 37 ° C en la incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar la temperatura para la infección.
    Nota: Las bacterias de la placa sobre placas de agar sangre para garantizar las utilizadas para la infección son homogéneos y no contaminada tras la infección.
  5. Infectar células huésped con bacterias a una multiplicidad de infección (MOI: bacterias anfitrionas) de 100: 1.
    Nota: el número de células HUVEC se determina mediante la realización de una prueba de exclusión tripano en un solo pozo antes de la infección. El número de células bacterianas se determina mediante densidad óptica (por ejemplo, OD de 0,5 x 5 = 10 8 células / ml). segundoconcentración acterial se ajusta a MOI adecuado basado en la concentración HUVECs 21.
  6. Colocar placas de 6 pocillos con HUVECs infectadas en incubadora anaeróbica y permiten que las bacterias interactúan con las células huésped durante 30 min.
  7. Preparar saponina en BHI (1,0% w / v) dentro de la cámara anaeróbica y filtrar a través de un filtro de 0,2 micras.
  8. La supervivencia de ambas bacterias adheridas y internalizados.
    1. Retire las placas de la incubadora, los medios de aspirado, lavado tres veces con PBS y anaeróbico añaden 2 ml filtran 1,0% saponina (preparado como se describe en el paso 4.8). Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped.
    2. Raspar el fondo de cada pocillo con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer una dilución 1: 1 en BHI.
    3. Proceda a realizar diluciones seriadas de la muestra. Dependiendo de las especies bacterianas y concentración, ajuste diluciones en serie. Comience con 1: 100 o 1: 1000 diluciones.
    4. Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Wrap tél placas en parafina y el lugar en la incubadora anaeróbica a 37 ° C.
    5. Después de siete días de incubación a 37 ° C, retirar las placas y contar unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando una caja de luz para contar manualmente colonias.
      Nota: UFC se enumeran. Para cantidades más grandes de UFC, las imágenes pueden ser tomadas y los programas informáticos se pueden utilizar para facilitar el recuento de UFC.
  9. La supervivencia de las bacterias internalizadas.
    1. Retire las placas de la incubadora. Lavar tres veces con PBS anaerobio y añadir 2 ml de medios suplementados con VEGF antibióticos (300 g / ml de gentamicina y 400 g / ml de metronidazol).
    2. Incubar durante 1 hora. Asegúrese de probar los antibióticos por lo que son 100% eficaz en matar la cepa bacteriana deseado y asegurarse de que no penetran en las células huésped 22,23.
    3. Aspirar los medios de comunicación, añadir 2 ml de filtrada 1,0% saponina. Incubar durante 15 min para permitir la lisis de la célula huésped.
    4. Raspe parte inferior de cada well con rascador de células. Recoger la mezcla de células de cada pocillo y hacer dilución 1: 1 en BHI.
    5. Preparar diluciones seriadas de la muestra (1: 100, 1: 1000).
    6. Placa 200 l de la dilución deseada sobre placas de agar sangre. Envuelva las placas en parafina y colocar en la incubadora anaeróbico.
    7. Después de siete días de incubación a 37 ° C eliminar los platos y contar UFC.

figure-protocol-12988
Figura 2. Representación esquemática de un protocolo utilizado para la supervivencia de las bacterias anaerobias con células eucariotas. Ambos ensayos para una supervivencia total de bacterias y la supervivencia de las bacterias internalizadas se pueden realizar al mismo tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. La internalización de bacterias en Host CeLLS (fluorescente Microscopy)

Nota: P. gingivalis se etiqueta con 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (y-6) carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM). BCECF-AM es un colorante de la membrana permeable no fluorescente; su conversión a BCECF fluoresceína a través de la acción de esterasas intracelulares puede indicar la viabilidad celular. P. gingivalis se etiqueta con el BCECF-AM colorante y luego se usa para infectar células eucariotas. Después de la infección, las células se fijan y se marcaron con DAPI y TRITC-faloidina. La mancha DAPI se utiliza para teñir el núcleo de la célula eucariota también etiquetar núcleo de la célula bacteriana, que proporciona una contramedida para identificar bacterias no viables que pueden no metabólicamente pegue BCECF-AM. Las células huésped se destacan con TRITC-phalloidin, un tinte rojo actina.

  1. Cubreobjetos autoclave. Añadir asépticamente cubreobjetos a placas de 12 pocillos antes de la siembra de células endoteliales a 5 x 10 4 células / pocillo. (Preparado días antes de experimento)
  2. tienen células endoteliales preparadas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares en placas de 12 pocillos como se describió anteriormente.
  3. Preparar bacterias anaeróbicas que crecen a mediados de la fase de registro (OD 660 = 0,5 a 0,7) como se describe en el apartado 1.
  4. Bacterias Lavar 2 veces con PBS anaerobio por centrifugación a 5000 xg y se suspende el sedimento en PBS a 5-7 x 10 8 células / ml.
  5. Añadir 20 l de 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml de suspensión bacteriana (5-7 x 10 8 células / ml) a una concentración final de BCECF-AM de 2 mM.
  6. Incubar a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad.
  7. Placas de transferencia con las células endoteliales sembradas en 18 mm (# 1.5) de espesor cubreobjetos circulares de cultivo de tejidos incubadora en la cámara anaeróbica. Lavar con PBS y el intercambio con los medios de comunicación VEGF anaeróbico.
    Nota: Verifique que HUVEC están sanos bajo un microscopio óptico. HUVECS debe ser ~ 80% de confluencia, la morfología debe ser comparable a los fabricantes.
  8. Centrifugar etiquetados bacterias en5.000 xg durante 10 min para eliminar residual colorante BCECF-AM. Suspender en 2 ml de medio VEGF anaeróbico.
  9. Infectar células huésped con bacterias marcadas en MOI de 100: 1 (bacterias: host).
  10. Incubar en cámara anaeróbica a 37 ° C durante 30 min.
  11. Después de la infección las células de lavado con PBS tres veces y fijar en recién preparada 4,0% de paraformaldehído durante 10 min.
    Nota: Después de fijar las células, el experimento puede llevarse a cabo fuera de la cámara anaeróbica.
  12. Wash cubreobjetos con PBS tres veces.
  13. Añadir 1 ml de 0,2% Triton X-100 durante 10 min.
  14. Wash cubreobjetos con PBS tres veces.
  15. Añadir 50 l de TRITC faloidina (50 g / ml) a cubreobjetos durante 45 min.
  16. Lave cubreobjetos tres veces, retirar de la placa de 12 pocillos y el lugar en un portaobjetos con medio de montaje-set blanda que contiene DAPI. Selle los lados con esmalte de uñas.
    Nota: Las diapositivas se puede conservar durante un par de meses en la oscuridad. Evitar exposición a la luz para evitar la foto-blanqueo.
  17. Ver diapositivasutilizando un microscopio confocal.
    1. En este caso, utilizar un sistema de 34 canales espectrales (detector de red de 32 canales y dos detectores PMT lado, además de un detector de luz transmitida) configurado en torno a un AxioObserver (invertida) de pie con una etapa de XY motorizado. El sistema cuenta con cinco rayos láser: diodo azul (405 nm), varias líneas de argón (458, 488, 514 nm), el diodo verde (561 nm), HeNe rojo (633 nm) y un láser pulsado nm 440. Equipa un sistema de imágenes de vida de fluorescencia con 2 detectores híbridos GaAsP (para FRET Flim).
    2. Detectar la fluorescencia de DAPI y TRITC en un canal utilizando un filtro de doble banda con longitudes de onda de excitación de 340-380 nm y 540-560 nm, y un filtro de emisión de 435 a 485 nm y 570 a 590 nm, respectivamente. Detectar fluorescencia de BCECF-AM utilizando un filtro con excitación longitud de onda de 440 a 500 nm y un filtro de emisión de 510 a 590 nm.
      Nota: Los controles para BCECF-AM se debe hacer en cada cepa bacteriana siendo estudiado para garantizar el etiquetado adecuado de bacterias viables. Primero validar que nonviabbacterias le son DAPI-positivas y BCECF negativo. En segundo lugar, asegúrese de que las bacterias vivas pueden metabolizar BCECF-AM en BCECF fluoresceína. Concentraciones variables de las bacterias o BCECF-AM tinte pueden necesitar ser probado para el etiquetado óptimo.

Resultados

Protocolos mencionados anteriormente fueron utilizados en el estudio de la interacción huésped-patógeno entre P. gingivalis y las células endoteliales. P. gingivalis W83 y P. gingivalis V3150 que porta una deleción de PG0228 se utilizaron en el estudio. El PG0228 se prevé para codificar una proteína que puede alterar los niveles de ARN y proteínas, lo que puede afectar en última instancia interacción de P. gingivalis con células huésped. Para investigar el efecto ...

Discusión

Todos los métodos anteriores se pueden utilizar para diseñar ensayos específicos para evaluar la interacción de las bacterias anaeróbicas con células eucariotas. Sin embargo, hay varias consideraciones para realizar con éxito los experimentos. Primero están los cepas microbianas para ser utilizados en un estudio.

Es crucial en la comparación de dos cepas tanto con el ensayo de supervivencia así como por análisis de microscopía de que están en fases de crecimiento similares y alc...

Divulgaciones

Authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.

Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type BCoy Laboratory ProductsModel 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep BloodBBL221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
Gentamicin Sulfate SaltSigma-AldrichG-1264
MetronidazoleSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloidin Sigma-AldrichP1951
18 mm Circular CoverslipsElectron Microscopy Sciences72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200

Referencias

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Infecci nN mero 106bacterias anaerobiasPorphyromonas gingivalisLa invasi nla supervivenciala interacci n hu sped pat genobacterias intracelularesel apego

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados