Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Zusammenfassung

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Zusammenfassung

Anaerobe Bakterien weit zahlenmäßig überlegen Aerobier in vielen menschlichen Nischen wie dem Darm, Mund und Vagina. Darüber hinaus sind anaerobe Infektionen häufig und oft indigener Herkunft. Die Fähigkeit einiger anaerobe Erreger an menschliche Zellen einzudringen gibt ihnen adaptive Maßnahmen zur angeborenen Immunität zu entfliehen sowie Wirtszelle Verhalten zu modulieren. Jedoch sicherzustellen, dass die anaeroben Bakterien sind im experimentellen Untersuchung der Ereignisse kann Herausforderungen mit sich bringen zu Hause sind. Porphyromonas gingivalis, ein Gram-negative anaerobe, ist in der Lage eine Vielzahl von eindringenden eukaryotischen Nicht-Fresszellen. Dieser Artikel beschreibt, wie man erfolgreich Kultur und Beurteilung der Fähigkeit von P. gingivalis die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) einzudringen. Zwei Protokolle wurden entwickelt: ein, um Bakterien, die erfolgreich eindringen kann und zu überleben, in dem Wirt, und der andere, um Bakterien Interaktion mit Wirtszellen sichtbar zu messen. Diese Techniken erfordern die Verwendung eines anaeRobic Kammer P. liefern gingivalis mit einer anaeroben Umgebung für ein optimales Wachstum.

Das erste Protokoll ist auf der antibiotischen Schutz-Assay, die weitgehend verwendet wird, um die Invasion von Wirtszellen, die durch Bakterien Studie. Jedoch ist die Antibiotikum-Schutzassay beschränkt; nur intrazelluläre Bakterien, die nach Behandlung mit Antibiotika und Host-Zell-Lyse kultivierbar sind, werden gemessen. Um alle Bakterien, die Interaktion mit Wirtszellen, sowohl lebenden und toten beurteilen wir ein Protokoll, das Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktion untersuchen entwickelt. Bakterien fluoreszent mit 2 'bezeichnet, 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein-acetoxymethylester (BCECF-AM) und verwendet, um eukaryotische Zellen unter anaeroben Bedingungen zu infizieren. Folgende Fixierung mit Paraformaldehyd und Permeabilisierung mit 0,2% Triton X-100, werden Wirtszellen mit TRITC-Phalloidin und DAPI markiert, um den Zellkern und Cytoskelett beschriften sind. Mehrere images zu verschiedenen Schwerpunkten (Z-Stack) getroffen werden für zeitlich-räumliche Visualisierung von Bakterien erhalten. Verfahren in dieser Studie verwendet wird, kann auf jede kultivierbare anaerobe und jegliche eukaryotische Zelltyp angewendet werden.

Einleitung

Anaerobe Bakterien besiedeln fast alle Oberflächen des menschlichen Körpers. Obwohl überwiegend in der Flora des Darm und Urogenitaltrakts, wo Sauerstoffkonzentrationen sind niedrig, es gibt sie auch in hohen Konzentrationen auf der Haut, Mund, Nase und Rachen ^1. Anaerobe Bakterien sind eine häufige Ursache von endogenen Infektionen und werden häufig von erkrankten Stellen isoliert. Jedoch aufgrund ihrer Natur anspruchsvolle Anaerobier können schwierig zu isolieren und Kultur. Studien mit anaeroben Bakterien sind unter eingeschränkten Bedingungen durchgeführt werden. Moderne anaeroben Kulturtechniken es den Forschern ermöglichen, um die anaerobe Einstellungen erforderlich, um viele anaerobe Laborstämmen oder klinischen Isolaten ^2,3 studieren zu imitieren.

Pathogenen anaeroben Bakterien haben eine dynamische Beziehung und Co-Evolution mit den Wirtszellen in dem sie wohnen entwickelt. Esten Anaerobier sind anfällig für das Töten von der Immunantwort des Wirts vor Erreichen infectischiedenen Ebenen. Allerdings haben einige pathogene Bakterien Mechanismen zu entkommen oder untergraben die Wirtsimmunantwort entwickelt. Sie erreichen dieses Ziel durch Mechanismen wie Umgehung der Immunerkennung, Neutralisation von Immunmediatoren, Veränderung der zellvermittelten Immunität, Invasion von Wirtszellen und Veränderung der Immunsignal ^4. Porphyromonas gingivalis, eine Gram-negative anaerobe sowohl mündlich als auch in Verbindung gebracht extraoralen Erkrankungen, ist ein Beispiel eines hoch angepasst bakterielles Pathogen Lage verursacht pathogenen Veränderungen im Aufnahme ^5-7.

Taschen der Biofilm Plaque in tiefen Spalten zwischen den Zähnen und Zahnfleischschleimhautgewebe gebildeten anaeroben Bakterien, die von Luftsauerstoff ⁸ geschützten Hafen abgegrenzt. Diese Zahnfleischtaschen dienen als Nische für verschiedene anaerobe Erreger wie P. gingivalis ^9. P. gingivalis ist eine Keystone-Erreger, der in der Lage ist, umgestaltening die mündliche mikrobiellen Gemeinschaft in einer Weise, die Entwicklung und Progression von Parodontalerkrankungen ¹⁰ zu fördern. Es erzeugt eine große Anzahl von Virulenzfaktoren, die aktiv sind gegen ein breites Spektrum von Wirtsproteinen und stellt Mechanismen für die Umgehung der Wirtsabwehr ^11. Es ist auch in der Lage eindringenden Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und Parodontalligament Zellen in vitro und in ^{vivo-12-14 15.} Durch die effiziente Invasion von Wirtszellen, P. gingivalis kann Wirtsimmunität zu entkommen. Effektive Invasion von Wirtszellen ermöglicht nicht nur das Bakterium, um Wirtsabwehr zu entkommen, sondern dient auch als Reservoir für künftige Re-Infektion als auch verändert die Wirtszelle. Untersuchungen der molekularen Mechanismen der Adhäsion und Internalisierung des Bakteriums durch Wirtszellen beteiligt sind, erforderlich ist. Forschung in mehreren Laboratorien wird auf das Verständnis der molekularen Vorgänge bei der Internalisierung von P. assoziiert konzentriert gingivalis durch die Wirtszellensowie die verwendet werden, um zu unterdrücken und zu entführen, die Immunantwort und zu überleben, die feindlichen Abwehrmechanismen Mechanismen.

Es gibt viele Tests, die die Identifizierung und Charakterisierung von Krankheitserregern, die in der Lage ist eindringenden Wirtszellen sind. In vitro-Studien mit anaerobe Pathogene Jedoch stellen viele experimentelle Probleme für die Forscher vor allem, weil es schwierig ist, Untersuchungen mit sperrigen Instrumente in Abwesenheit von Sauerstoff zu bauen. Dies wird durch die Tatsache, dass eukaryotische Zellen benötigen Sauerstoff, zu wachsen und müssen somit separat in Gewebekultur-Inkubatoren hergestellt werden verstärkt. Ein Weg, um solche Hindernisse zu vermeiden, wäre es, die Untersuchungen unter atmosphärischem Sauerstoff durchzuführen, aber das würde das Wachstum von anaeroben Bakterien unmöglich machen. Ein weiteres Verfahren wäre die durch Wärme abgetöteten Bakterien zu verwenden, um zu infizieren und zu studieren Host-Zell-Interaktionen. Zwischen Hitze abgetöteten und lebensfähigen Bakterien, die die Relevanz der Wirt-Pathogen interacti verringern bestehen jedoch Unterschiede^am 16. Es ist von zentraler Bedeutung für lebensfähige Bakterien mit unveränderter Expression Interaktion mit Wirtszellen zu studieren; Daher sind Verfahren zur Züchtung von P. gingivalis in einer anaeroben Umgebung gegeben. Auch sind zwei einfache kosteneffektive Protokolle zur Bewertung der Fähigkeit von P. zeigten gingivalis durch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) internalisiert werden. Das erste Protokoll basiert auf dem beliebten Antibiotikum-Schutz-Assay basiert. Obwohl der Test ist einfach, sind Überlegungen bei der Verwendung von anaeroben Mikroorganismen gegeben. Das zweite Protokoll erfordert die Verwendung eines fluoreszierenden Scanning-Mikroskop zur Visualisierung Interaktion und verinnerlicht P. gingivalis. Jeder Test hat seine Grenzen und Vorteile, die diskutiert werden, den Forscher eine Gliederung für die Untersuchung der Invasivität von anaeroben Bakterien bereitzustellen. Obwohl die aktuelle Manuskript studiert P. gingivalis und HUVECs können diese Protokolle für viele andere anaerobe Bakterien ebenso verwendet werdenwie für andere Arten von Wirtszellen.

Protokoll

Die folgenden Protokolle werden Methoden für die Kultivierung und Untersuchung der Invasion durch die anaerobe Arten, P. beschreiben gingivalis; jedoch können diese Protokolle für eine Reihe von anaeroben Pathogene verwendet werden. Obwohl HUVECs verwendet werden, kann dieses Protokoll für andere eukaryontische Zellen sowohl immune und nicht-immune verwendet werden.

1. anaeroben Kammer Betrieb und Wartung

Hinweis: P. gingivalis ist eine anaerobe empfindlich auf ein normales Niveau von Sauerstoff in der Luft auftreten. Eine kontrollierte anaerobe Umgebung ist für die Kultivierung von P. gingivalis.

1. Hier aufrechtzuerhalten eine gemischte anaerobe Gas (80% _N 2, _10% H 2, 10% _CO 2) in einem Vinyl anaeroben Kammer (1A) bezeichneten künstlichen Atmosphäre. Verwenden Sie eine Luftschleuse (1B) für die Übertragung von Artikeln aus der Laborumgebung zu der anaeroben Kammer. Die Luftschleuse betreibt manuell, twEis Spülung mit _N2-Gas vor der Einführung des gemischten anaeroben Gas.
2. Verwenden Sie einen Schwefelwasserstoff-Entfernungssäule (1C) für wartungsfreie Entfernung der unerwünschten Schwefelwasserstoff. Legen Sie einen Luftentfeuchter in der Kammer, um _H 2 O durch den Katalysator zu entfernen und Aerosole, die die Ausbreitung der Kontamination zu erleichtern vermeiden.
   Anmerkung: Schwefelwasserstoff ist ein natürliches Stoffwechselnebenprodukt vieler anaeroben Bakterien und ihre Akkumulation Bakterien toxisch und kann in einer Beschädigung des elektronischen Folge und eine Verringerung der Lebensdauer des Katalysators.
3. Verwenden Sie ein Fan-Box auf der Kammeratmosphäre durch eine Palladium-Katalysator, der Sauerstoff in Gegenwart von Wasserstoff (Abbildung 1D) entfernt zu zirkulieren.
   Hinweis: Ein Rezirkulieren Atmosphären (HEPA) Filter entfernt Verunreinigungen aus der Luft mit einer Grße von 0,22 um oder mehr.
4. Kultur anaeroben Bakterien in einem Inkubator bei 37ºC, die in der anaeroben befindetKammer. Verwenden Sie Standard-aseptischer Techniken beim Arbeiten im Inneren des anaeroben Kammer.

Abbildung 1. Anaerobe vinyl Kammer und seiner Komponenten. (A) einem Vinyl anaeroben Kammer vollständig vom Luftsauerstoff abgedichtet stellt Arbeitsplatz für zwei Personen zu einem Zeitpunkt (32 in x 78 in). Es enthält einen Brutschrank bei 37 ° C (hinten Mitte) eingestellt. (B) eine Luftschleuse für den Transfer von Artikeln aus der Laborumgebung zu der anaeroben Kammer eingesetzt. Pictured ist eine automatische Luftschleuse durch eine Steuerung, die so programmiert, dass das Vakuum und Säuberungsverfahren erforderlich, um eine anaerobe Umgebung zu erstellen automatisch durchführen kann betrieben. (C) Eine Entfernung von Schwefelwasserstoff Column bietet wartungsfreien Hochleistungs Entfernung unerwünschter Schwefelwasserstoff. (D) Zwei Katalysator-Fan-Boxen sindwährend des anaeroben Kammer angeordnet, um die Zirkulation der Raumatmosphäre durch Palladium-Katalysator, der in Gegenwart von Wasserstoff, Sauerstoff entfernt. Die anaeroben Kammer wird gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Herstellung von anaeroben Bakterien

Hinweis: P. gingivalis aerotolerant und kann unter aeroben Bedingungen gelagert werden, aber es wird nicht in Gegenwart von Sauerstoff wachsen auf einem höheren Niveau als 6% ^17,18. Einer anaeroben Kammer ist notwendig für die ordnungsgemäße Pflege der P. gingivalis und anderen anaeroben Spezies (Abbildung 1). Richtiges Training und Ausbildung auf anaeroben Kammer Gebrauch ist, bevor Sie mit microanaerobes ¹⁹ erforderlich.

1. Gleichgewicht kommen alle flüssigen Medien und Platten, um anaerobe conditIonen für mindestens 12 h vor dem Experiment um den restlichen Sauerstoff zu entfernen.
2. Bringen P. gingivalis von -80 ° C Gefrierschrank bis anaeroben Kammer, noch auftauen.
3. Streak P. gingivalis auf Trypticase-Soja Blutagarplatten (TSA II mit 5% Schafblut). Wickeln Sie Platten in Parafilm und lagern bei 37 ° C in einer anaeroben Inkubator für 4-7 Tage.
4. Impfen P. gingivalis in 3 ml Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Brühe, ergänzt mit Hämin und Menadion einem angereicherten nicht-selektiven flüssigen Medien für die Isolierung und Kultur von anaeroben und anspruchsvoller Mikroorganismen, mit sterilen Schleifen.
   Hinweis: Für die langfristige Lagerung, Mischung Bakterienkulturen in BHI mit Glycerin oder DMSO (10-20% Endkonzentration) und in einen -80 ° C Gefrierschrank vorbereitet.
5. Bereiten Sie eine Starterkultur von P. gingivalis, indem Sie eine 1:10 Verdünnung und damit Bakterien bis Mitte der log-Phase wachsen.

Anmerkung: Die optische Dichte des bacterial Suspension wird bestimmt, und die Bakterienkonzentration für jeden Stamm untersucht werden eingestellt. Für P. gingivalis eine Suspension bei einer OD ₆₆₀ von 0,7 entspricht der mittleren log-Phase und ~ 7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml. In dem Protokoll beschriebene Wachstumsbedingungen vorstehend spezifisch für P. gingivalis und eventuell auf andere Bakterienstämme angepasst werden.

3. Endothelzellkultur

Hinweis: Der Kauf gepoolt primäre HUVECs und Kultur in Basalmedium, enthaltend vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) bei 37 ° C in 5% _CO 2 nach Herstelleranweisungen.

1. Samen HUVECs in T-75-Flaschen mit 2,5 ^× 10 5 Zellen / Kolben in 15 ml VEGF Medien.
   Hinweis: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit über ein 1: 1-Verdünnung mit 4,0% Trypanblau. Zellen, die mit einem geschwächten Membran Trypanblau behalten, werden gesunde Zellen mit intakten Membranen weiß erscheinen, wenn sie unter einem binokularen Lichtmikroskop. CounT 100-Zellen, zu gewährleisten, dass über 80% der Zellen lebensfähig ^{sind 20.}
2. Ersetzen Medien alle 2 Tage mit vorgewärmter Frisch VEGF Medien, bis die Zellen zu erreichen ~ 80% Konfluenz.
3. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten PBS. Befreien Zellen von der T75-Flasche durch Inkubation mit 2 ml Trypsin-EDTA (0,25%) für 5 Minuten, gefolgt von 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung.
4. Sammeln suspendiert HUVECs in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie keine zusätzlichen Zellen aus T-75-Kolben mit PBS und Transfer in 50 ml konischen Röhrchen.
5. Zentrifuge Zellen bei 200 g für 10 min.
6. Überstand entfernen, auszusetzen Zellpellet in 10 ml vorgewärmten VEGF Medien.
7. Bestimmen Sie, Zellkonzentration mit einer Zählkammer oder ähnliche Zellzählung Gerät.
8. Berechnen Menge an Zellsuspension, um entweder auf 6-Well-Platte (400.000 / well) oder 12-Well-Platte mit Deckgläsern hinzufügen (50.000 / Well). HUVECs werden bereit für Experimente am nächsten Tag.

4. Überlebensassay Invasion / Interaction(Überzug)

Anmerkung: Bei der Durchführung dieses Tests, bereiten zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Endothelzellen auf 400.000 Zellen / Well. Eine Platte wird verwendet, um Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Die andere Platte wird für intrazelluläre Bakterien ausmachen. Die 6-Lochplatte ermöglicht Triplikaten von zwei Proben in einem Experiment durchgeführt werden. Für einen Überblick über dieses Protokoll finden Sie in der Überlebensassay Flussdiagramm (Abbildung 2) zu entnehmen.

1. Bereiten anaerobe Bakterien, wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 1), bis sie Mitte der log-Wachstums (OD ₆₆₀ von 0,5 bis 0,7) zu erreichen.
2. Zentrifuge Bakterien bei 5.000 × g für 10 min.
   Hinweis: Wenn Zentrifuge außerhalb anaeroben Kammer führen Bakterienproben in einem dicht verschlossenen 15 ml-Tube, wickeln Sie die Kappe mit Parafilm zu Sauerstoff Auslaufen zu verhindern.
3. Zeigen pelletiert P. gingivalis zurück in der Kammer, Überstand verwerfen. Erneut mit PBS waschen, Pellet-Bakterien vor Resuspendieren in VEGF michdia. Vorbereitung Suspensionen für alle Bakterienstämme bei einer OD ₆₆₀ von 0,7, die bis zur mittleren log-Phase (~ 7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml) entspricht, getestet werden. Die Bakterien sind nun bereit für die Infektion.
4. Transfer 6-Well-Platten, die HUVECs von Gewebekultur-Inkubator in anaeroben Kammer. Entfernen Sie das Medium und dreimal mit anaeroben PBS. 2 ml der anaeroben VEGF Medien in jede Vertiefung und legen die Platten bei 37 ° C in der anaeroben Inkubator für 20 Minuten, um die Temperatur für eine Infektion zu äquilibrieren.
   Hinweis: Platte Bakterien auf Blutagarplatten, diejenigen für die Infektion verwendet, sicherzustellen, sind homogen und nicht nach Infektion kontaminiert.
5. Infizieren Wirtszellen mit Bakterien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI Bakterien: Host) von 100: 1.
   Anmerkung: HUVEC-Zellzahl durch Ausführen einer Trypanblau-Ausschlusstests an einem einzigen Bohrloch vor der Infektion bestimmt. Bakterienzellzahl wird über die optische Dichte bestimmt (beispielsweise von 0,5 OD = 5 x ¹⁰ 8 Zellen / ml). Bacterial Konzentration auf richtige MOI basierend auf HUVECs Konzentration ²¹ eingestellt.
6. Legen Sie 6-Well-Platten mit infizierten HUVECs in anaeroben Inkubator und lassen Bakterien mit Wirtszellen für 30 Minuten zu interagieren.
7. Vorbereitung Saponin in BHI (1,0% w / v) in der anaeroben Kammer und filtriert durch einen 0,2 um Filter.
8. Überleben beider befestigt und verinnerlicht Bakterien.
   1. Platten entfernen aus dem Inkubator, absaugen Medien, waschen dreimal mit anaeroben PBS und 2 ml gefiltert 1,0% Saponin (hergestellt wie in Schritt 4.8 beschrieben). Inkubieren Sie für 15 Minuten, um Host-Zell-Lyse zu ermöglichen.
   2. Kratzen Boden jeder Vertiefung mit Zellschaber. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und eine 1: 1-Verdünnung in BHI.
   3. Fahren Sie mit seriellen Verdünnungen der Probe zu machen. Je nach Bakterienart und Konzentration, passen Verdünnungsreihen. Beginnen Sie mit 1: 100 oder 1: 1000 Verdünnungen.
   4. Platte 200 ul gewünschte Verdünnung auf Blutagarplatten. Wrap ter Platten in Parafilm und in der anaeroben Inkubator bei 37 ° C.
   5. Nach sieben Tagen Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die Platten und zählen koloniebildenden Einheiten (KBE) mit der Lichtbox manuell zählen Kolonien.
      Hinweis: KBE aufgezählt werden. Für größere Mengen an CFUs können Bilder aufgenommen werden, und Computersoftware kann verwendet werden, um die Zählung von CFUs erleichtern.
9. Survival of verinnerlicht Bakterien.
   1. Platten entfernen aus dem Inkubator. Dreimal Waschen mit anaeroben PBS und 2 ml VEGF Medien, ergänzt mit Antibiotikum (300 ug / ml Gentamicin und 400 ug / ml von Metronidazol).
   2. Inkubation für 1 Std. Achten Sie darauf, die Antibiotika zu testen, so dass sie zu 100% effektiv bei der die gewünschte Bakterienstamm zu töten und stellen Sie sicher, dass sie Wirtszellen ^22,23 nicht durchdringen.
   3. Absaugen Medien, 2 ml gefiltertes 1,0% Saponin. Inkubieren Sie für 15 Minuten, um Host-Zell-Lyse zu ermöglichen.
   4. Kratzen Sie unten auf jeder well mit Zellschaber. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und stellen Sie 1: 1-Verdünnung in BHI.
   5. Bereiten Sie Verdünnungen der Probe (1: 100, 1: 1.000).
   6. Platte 200 ul gewünschte Verdünnung auf Blutagarplatten. Wickeln Sie Platten in Parafilm und in anaeroben Inkubator.
   7. Nach sieben Tagen Inkubation bei 37 ° C Platten zu entfernen und zu zählen KBE.

Abbildung 2. Schematische Darstellung eines Protokolls für das Überleben von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen verwendet. Beide Assays für insgesamt bakterielle Überleben und das Überleben von verinnerlicht Bakterien können zur gleichen Zeit durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Internalisierung von Bakterien in Wirts Cells (Fluoreszenz-Mikroskopie)

Hinweis: P. gingivalis ist mit 2 'bezeichnet, 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM ist ein nicht-fluoreszierendes membranpermeablen Farbstoff; ihre Umwandlung in Fluorescein BCECF über die Wirkung der intrazellulären Esterasen kann angeben Zellviabilität. P. gingivalis mit BCECF-AM-Farbstoff markiert und dann verwendet, um eukaryontische Zellen zu infizieren. Nach der Infektion werden die Zellen fixiert und mit DAPI und TRITC-Phalloidin markiert. Die DAPI-Färbung verwendet, um die eukaryotische Zellkern Fleck wird auch beschriften bakteriellen Zellkern, der eine Gegenmaßnahme, um nicht lebensfähige Bakterien, die nicht können metabolisch spalten BCECF-AM zu identifizieren bietet. Wirtszellen werden mit TRITC-Phalloidin rotem Aktin Farbstoff markiert.

1. Autoklaven Deckgläser. Aseptisch Deck zu 12-Well-Platten hinzuzufügen vor der Aussaat Endothelzellen bei 5 × ¹⁰ 4 Zellen / Vertiefung. (Vorbereitet Tag vor Versuch)
2. Haben Endothelzellen auf 18 mm (# 1.5 Dicke) kreisförmige Deckgläser hergestellt in Platten mit 12 Vertiefungen wie oben beschrieben.
3. Bereiten anaeroben Bakterien bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet (OD ₆₆₀ = 0,5-0,7), wie in Kapitel 1 beschrieben.
4. Wasch Bakterien 2x mit anaerober PBS durch Zentrifugation bei 5.000 × g und Suspensions Pellet in PBS bei 5-7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml.
5. Werden 20 ul 0,2 mM BCECF-AM bis 2 ml Bakteriensuspension (5-7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml) zu einer Endkonzentration von BCECF-AM von 2 uM.
6. Inkubieren bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
7. Übertragungsplatten mit Endothelzellen auf 18 mm (# 1.5 Dicke) kreisförmigen Deckgläser von Gewebekultur-Inkubator ausgesät in den anaeroben Kammer. Mit PBS und Austausch mit anaeroben VEGF Medien waschen.
   Hinweis: Überprüfen Sie, ob HUVECs werden unter einem Lichtmikroskop gesund. HUVECs sollte ~ 80% konfluent waren, sollten vergleichbare Morphologie für die Hersteller sein.
8. Centrifuge markierten Bakterien an5.000 × g für 10 min, um restliche BCECF-AM Farbstoff zu entfernen. Suspend in 2 ml anaeroben VEGF Medien.
9. Infizieren Wirtszellen mit markierten Bakterien bei einer MOI von 100: 1 (Bakterien: Host).
10. Inkubieren in anaeroben Kammer bei 37 ° C für 30 min.
11. Nach der Infektion Wasch Zellen mit PBS dreimal und in frisch hergestellten 4,0% Para fix für 10 min.
    Hinweis: Nach der Fixierung von Zellen, kann Experiment außerhalb der anaeroben Kammer durchgeführt werden.
12. Waschdeckgläser mit PBS dreimal.
13. 1 ml 0,2% Triton X-100 für 10 min.
14. Waschdeckgläser mit PBS dreimal.
15. Dann werden 50 ul des TRITC-Phalloidin (50 ug / ml) auf Deckgläsern für 45 min.
16. Wash Deckgläser dreimal, von der 12-Well-Platte und setzen Sie auf einem Objektträger mit Soft-Set Eindeckmedium enthält DAPI. Dichten Sie die Seiten mit Nagellack.
    Hinweis: Die Objektträger können für ein paar Monate im Dunkeln gelagert werden. Vermeiden Sie Belichtung zur Photobleaching zu verhindern.
17. Blick gleitetmit einem konfokalen Mikroskop.
    1. Hier verwenden Sie ein 34-Kanal spektrale System (32-Kanal-Array-Detektor und zwei Seiten PMT-Detektoren, sowie eine Durchlichtdetektor) um eine AxioObserver (invertiert) konfiguriert, stehen mit einem motorisierten XY-Tisch. Das System verfügt über fünf Laser: blau-Diode (405 nm), mit mehreren Leitungen Argon (458, 488, 514 nm), grüne Diode (561 nm), roten HeNe (633 nm) und einem 440 nm gepulsten Laser. Anlegen eines Fluorescence Lifetime Imaging-System mit 2-Hybrid GaAsP Detektoren (für FRET-FLIM).
    2. Detektieren die Fluoreszenz von DAPI und TRITC in einem Kanal unter Verwendung eines Dual-Band-Filter mit Anregungswellenlängen von 340-380 nm und 540-560 nm und einem Emissionsfilter von 435 bis 485 nm und von 570 bis 590 nm. Detektieren die Fluoreszenz von BCECF-AM unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 440 bis 500 nm und einem Emissionsfilter von 510 bis 590 nm.
       Hinweis: Steuerungen für BCECF-AM sollte auf jedem Bakterienstamm durchgeführt werden untersucht, um die ordnungsgemäße Kennzeichnung der lebensfähigen Bakterien zu gewährleisten. Zuerst überprüfen, dass nonviable Bakterien sind DAPI-positive und BCECF-negativ. Zweitens, sicherzustellen, dass lebende Bakterien können BCECF-AM in Fluorescein BCECF verstoffwechseln. Variable Konzentrationen der Bakterien oder BCECF-AM Farbstoff eventuell auf optimaler Kennzeichnung geprüft werden.

Ergebnisse

Protokolle oben umrissen wurden bei der Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen P. verwendet gingivalis und Endothelzellen. P. gingivalis W83 und P. gingivalis V3150, welches eine Deletion des PG0228 wurden in der Studie verwendet. Das PG0228 vorhergesagt wird, ein Protein, das die Pegel der RNA und Proteinen verändern können, was sich letztlich auf eine Wechselwirkung von P. kodieren gingivalis mit Wirtszellen. Um die Wirkung der PG0228 auf P. unt...

Diskussion

Alle oben genannten Verfahren können verwendet werden, um spezifische Assays, um die Wechselwirkung von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen beurteilen zu entwerfen. Jedoch gibt es einige Überlegungen, die Versuche erfolgreich durchzuführen. Zuerst gibt es die Mikrobenstämme in einer Studie verwendet werden.

Es ist von entscheidender Bedeutung bei dem Vergleich von zwei Stämmen sowohl mit dem Überlebens-Assay sowie durch Mikroskopie-Analyse, daß sie sich in einer ähnlichen W...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200