Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Özet

Anaerobik bakteriler çok böyle gut, ağız ve vajina gibi birçok insan nişler aerop çoğunluktadır. Ayrıca, anaerobik enfeksiyonlar sık ​​ve sık sık yerli kökenlidir. İnsan hücreleri istila bazı anaerobik patojenlerin yeteneğini onlara doğal bağışıklığı kaçmak için de konakçı hücre davranışını modüle edilmesi için bir tedbir alınması verir. Ancak, anaerobik bakteriler zorluklar oluşturabilecek olayların deneysel soruşturma sırasında canlı sağlanması olduğunu. Porphyromonas gingivalis, bir Gram-negatif anaerob, ökaryot fagositik olmayan hücrelere çeşitli işgal yeteneğine sahiptir. Bu makale başarıyla kültür ve P. yeteneğini değerlendirmek için nasıl özetliyor gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) işgal etmek. İki protokolleri geliştirilmiştir: Bir başarı istila ve ev sahibi içinde hayatta ve diğer konakçı hücreleri ile etkileşim bakteri görselleştirmek için bakteriler ölçmek için kullanılır. Bu teknikler, bir ANAE kullanımını zorunlurobic P. tedarik bölmesi Optimal büyüme için bir anaerobik ortam ile gingivalis.

Birinci protokol büyük ölçüde bakterilerin konakçı hücrelerin istilası incelemek için kullanılır antibiyotik koruma deneyi, dayanmaktadır. Bununla birlikte, antibiyotik koruma deneyi sınırlıdır; Antibiyotik tedavisi ve konak hücre lizis aşağıdaki kültürlenebilen sadece hücre içi bakteriler ölçülür. Canlı ve ölü konakçı hücreler ile etkileşen tüm bakteri değerlendirmek için, konukçu-patojen etkileşimini incelemek için flüoresan mikroskopi kullanan bir protokol geliştirilmiştir. Bakteriler flüoresan olarak, 2 'ile 7'-bis- (2-karboksietil) olarak etiketlenmiştir -5- (and-6) -carboxyfluorescein asetoksimetil ester (BCECF-AM) ve anaerobik koşullar altında ökaryotik hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır. % 0.2 Triton X-100 ile formaldehit ve geçirgenliği ile tespit eden konakçı hücreler, sırasıyla, hücre sito-iskeletini ve çekirdeği etiketlemek için TRITC falloidinle ve DAPI ile etiketlenmiştir. Çoklu imaFarklı odak noktaları (Z-yığın) alınan ges bakterilerin zamansal-mekansal görselleştirme için elde edilir. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri, herhangi bir ekilebilir anaerob herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.

Giriş

Anaerobik bakteriler insan vücudunun hemen hemen tüm yüzeyleri kolonize. Oksijen konsantrasyonu düşüktür bağırsak ve genitoüriner yolun florasında baskın olmasına rağmen, aynı zamanda cilt, ağız, burun, boğaz ve 1 yüksek seviyelerde bulunmaktadır. Anaerobik bakteriler endojen enfeksiyon ortak bir nedenidir ve sıklıkla hastalıklı sitelerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, bunların üreyen doğa anaeroblar izole etmek ve kültür, zor olabilir. Anaerobik bakteri içeren çalışmalar kısıtlı şartlarda yapılmalıdır. Modern anaerobik-kültür teknikleri araştırmacılar, birçok anaerobik laboratuar suşları ve hatta klinik izolatları 2,3 incelemek için gerekli olan anaerobik ayarlarını taklit izin verir.

Patojenik anaerobik bakteriler içinde bulundukları konakçı hücreler ile dinamik bir ilişki ve ko-evrim geliştirdik. En anaeroblar infecti ulaşmadan önce bir vücut bağışıklığı tepkisi ile öldürülmeye duyarlılı seviyeleri. Ancak, bazı patojen bakteriler kaçmak ya da konak immün yanıtı yıkmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bunlar, bağışıklık tanıma bağışıklık aracılarının nötralizasyon, hücre-aracılı bağışıklığın bir değişiklik, konakçı hücrelerin istilası ve 4 sinyal İmmün alterasyon kaçırma gibi mekanizmalarla bu amacı gerçekleştirmek. Porphyromonas gingivalis, hem oral hem de karışmış bir Gram-negatif anaerob ağız dışı hastalıklar, ev 5-7 patojen değişikliklerin neden olabilecek yüksek adapte bakteriyel patojenin bir örnektir.

Biyofilm plak cepler atmosferik oksijen 8 korunur anaerobik bakteri barındırabilir diş ve dişeti mukoza dokusunun arasında oluşan derin yarıklar oluşmuştur. Bunlar periodontal cepler gibi P. gibi çeşitli anaerobik patojenler, bir niş olarak hizmet gingivalis 9. P. gingivalis şeklini kapasitesine sahip bir kilit taşı patojendirPeriodontal hastalıkların 10 gelişmesini ve ilerlemesini teşvik şekillerde ağız mikrobiyal topluluk ing. Bu ana proteinlerin geniş bir spektrumuna karşı aktif olan ve ana savunma 11 kaçırma için mekanizmalar sağlar hastalık oluşturma faktörlerinin çok sayıda üretir. Aynı zamanda, in vitro ve in vivo 12-14 15 epitel, endotel, fibroblastik ve periodontal ligament hücreleri istila edebilir. Etkin bir şekilde, P. konakçı hücreleri işgal tarafından gingivalis konak bağışıklık kaçabilir. Konakçı hücrelerin etkili işgali sadece bakteri konak savunma kaçmasına izin değil, aynı zamanda gelecekte yeniden enfeksiyon için bir rezervuar olarak hizmet yanı sıra konakçı hücreyi değiştirir. Konakçı hücreler tarafından yapışması ve bakterinin içselleştirme yer alan moleküler mekanizmalar çalışmalar gereklidir. Birkaç laboratuvarlarda Araştırma P. içselleştirilmesi ile ilgili moleküler olayları anlamaya odaklanmıştır konakçı hücreler tarafından gingivalishem de bastırmak ve bağışıklık yanıtı kaçırmak ve düşman konak savunma mekanizmaları hayatta kalmak için kullanılan mekanizmalar olarak.

Tanımlanması ve konakçı hücreleri işgal edebilen patojenleri karakterize edebilen çok sayıda deneyler vardır. Oksijen yokluğunda hantal araçlara dayanan çalışmalar yapmak zor olduğundan Ancak, anaerobik patojenler ile in vitro çalışmalar ağırlıklı olarak araştırmacı birçok deneysel sorunlar oluşturmaktadır. Bu ökaryotik hücreler büyümeye oksijene ihtiyaç ve dolayısıyla doku kültürü inkübatörlerde ayrı hazırlanmış olmalıdır gerçeği ile birleşir. Bu tür engelleri önlemek için bir yolu atmosferik oksijenin altında çalışmalar yapmak olurdu, ama o anaerobik bakteri büyüme imkansız hale getirecektir. Başka bir yöntem, enfekte ve ana-hücre etkileşimini incelemek ısı ile öldürülmüş bakterilerin kullanmak olacaktır. Ancak, farklılıkların konak-patojen etkileflimlere alaka azaltmak ısı ile öldürülmüş ve canlı bakteri arasındaki mevcut16. Bu konak hücreleri ile etkileşim değişmeden ifade ile canlı bakteri incelemek için merkezi; P kültürlemek için, bu nedenle, yöntem anaerobik ortamda gingivalis verilmiştir. Aynı zamanda, iki basit düşük maliyetli protokoller P. yeteneğini değerlendirmek için gösterilmektedir gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) tarafından içselleştirilebilir için. Birinci protokol popüler antibiyotik koruma deneyi dayanmaktadır. Deney basittir, ancak anaerobik mikroorganizmalar kullanılarak hususlar verilmiştir. İkinci protokol etkileşim görselleştirmek için bir floresan tarama mikroskobu kullanılmasını gerektirir ve P. içsel gingivalis. Her deney sınırlamaları ve anaerobik bakteri invazivliğini eğitimi için araştırmacı bir taslağını sunmak üzere ele alınacak avantajlara sahiptir. Geçerli el yazması P çalışmaları olsa da gingivalis ve HUVECler, bu protokoller ve diğer pek çok anaerobik bakteriler için kullanılabilirEv sahibi hücre tiplerine olarak gösterilmiştir.

Protokol

Aşağıdaki protokoller anaerobik türler, P. tarafından işgali kültüre ve eğitim yöntemlerini anlatacağız gingivalis; Bununla birlikte, bu protokoller anaerobik patojenlerin bir dizi kullanılabilir. HUVECler kullanılsa da, bu protokol immün olmayan bağışıklık hem de ökaryotik hücreler için kullanılabilmektedir.

1. Anaerobik Odası Kullanımı ve Bakımı

Not: P. gingivalis ortam havasındaki karşılaşılan oksijen normal düzeylere duyarlı bir anaerob olduğunu. Kontrollü bir anaerobik ortam P. ekimi için hayati önem taşımaktadır gingivalis.

  1. Burada, karışık anaerobik gaz (% 80 N2,% 10 H2, 2 10% CO) bir vinil anaerobik odası içinde (Şekil 1A) 'de verilen bir yapay atmosferi korumak. Anaerobik odasına laboratuar ortamında öğeleri aktarmak için bir hava kilidi (Şekil 1B) kullanın. Hava kilidi elle tw faaliyetKarışık anaerobik gazın önce N 2 gazı ile buz temizleme.
  2. Istenmeyen hidrojen sülfid bakım gerektirmeyen çıkarılması için bir bir hidrojen sülfür arındırma kolonu (Şekil 1C) kullanın. Katalizör tarafından oluşturulan O H 2 kaldırmak ve kontaminasyon yayılmasını kolaylaştıran aerosoller önlemek için bölme içinde bir nem alıcı yerleştirin.
    Not: Hidrojen sülfür, birçok anaerobik bakteri doğal metabolik yan ürünü olduğunu ve birikim bakteriler için toksik ve elektronik zarar ve bir katalizör ömrünü azaltabilir.
  3. Hidrojen mevcudiyetinde (Şekil 1D) oksijeni ortadan kaldıran bir paladyum katalizörü vasıtasıyla odası atmosferinin sirküle edilmesi için bir fan kutusu kullanın.
    Not: Bir çevrimli atmosferik (HEPA) filtresi 0.22 um veya daha büyük bir boyutu ile havadaki kirletici kaldırır.
  4. Anaerobik içinde bulunan bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde kültür anaerobik bakterilerodası. Anaerobik odasının içine çalışırken standart aseptik teknikler kullanın.

figure-protocol-2143
Şekil 1. Anaerobik vinil odası ve bileşenleri. (A) atmosferik oksijen tamamen kapatılmış bir vinil anaerobik odası bir anda (32 x 78 in) iki kişi için çalışma alanı sağlar. Bu (geri orta) 37 ° C'de ayarlanmış bir inkübatör içermektedir. (B) Bir hava kilidi anaerobik odasına laboratuar ortamında öğelerin aktarımı için kullanılır. Resimde otomatik olarak anaerobik ortam yaratmak için gerekli vakum ve temizleme işlemleri gerçekleştirmek için programlanabilir bir kontrolör ile çalıştırılan bir otomatik airlock olduğunu. (C) bir hidrojen sülfür arındırma Sütun istenmeyen hidrojen sülfitin bakım gerektirmeyen bir yüksek kapasiteli kaldırma sağlar. (D) İki katalizör fan kutularıhidrojen varlığında, oksijeni ayırmaktadır, paladyum katalizörü vasıtasıyla odası atmosferinin dolaşımını sağlamaya anaerobik odası boyunca yerleştirilir. Anaerobik odası üreticinin talimatlarına göre ayarlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Anaerobik Bakterilerin 2. Hazırlık

Not: P. gingivalis aerotolerant ve havadar koşullarda saklanabilir ancak% 6 17,18 daha yüksek seviyelerde oksijen varlığında büyüme olmaz. Bir anaerobik odası P. uygun yetiştirilmesi için gerekli olan gingivalis ve diğer anaerobik türler (Şekil 1). Anaerobik odası kullanımı ile ilgili uygun eğitim ve öğretim microanaerobes 19 ile çalışmaya başlamadan önce gerekmektedir.

  1. Anaerobik iklimlendirme tüm sıvı ortamları ve plakaları dengelenmesiEn az 12 saat boyunca deney öncesinde iyonları artık oksijen çıkarmak için.
  2. P Transferi anaerobik odasına -80 ° C derin dondurucuda gelen gingivalis, çözülme edelim.
  3. Streak P. (TSA II% 5 koyun kanı ile) triptikaz soya kan agar plaklarına gingivalis. 4-7 gün için bir anaerobik kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de parafilm ve mağaza plakaları sarın.
  4. P aşılamak 3 ml beyin kalp infüzyon halinde gingivalis (BHI) et steril döngüleri kullanarak, hemin ve menadoin anaerobik ve titiz mikroorganizmaların izolasyonu ve kültürü için zenginleştirilmiş bir seçici olmayan sıvı ortam ile takviye edilmiştir.
    Not: Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda gliserol veya DMSO (% 10-20 nihai konsantrasyon) ve yer ile BHI hazırlanan bakteri kültürleri karıştırın.
  5. P. bir başlangıç ​​kültürünü hazırlayın 1:10 seyreltme yapılmadan ve bakteri, orta log fazına kadar büyümeye izin vererek gingivalis.

Not: bac optik yoğunluğunuarteryal Süspansiyon belirlenir ve incelenecek her bir suş için bakteri konsantrasyonu ayarlanır. P. gingivalis, orta log fazında ve • 7 x 10 8 hücre / ml 0,7 tekabül OD 660 bir süspansiyon. Protokolde tarif edildiği büyüme koşulları yukarıdaki P. özgüdür gingivalis ve diğer bakteri türleri için adapte edilmesi gerekebilir.

3. Endotel Hücre Kültürü

Not: Alma üreticinin talimatlarına uygun olarak,% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, vasküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF) ihtiva eden bazal ortam içinde primer HUVECler ve kültür toplanmış.

  1. 15 ml VEGF medyada 2.5 x 10 5 hücre / şişeye T-75 matara Tohum HUVECler.
    Not:% 4,0 tripan mavisi ile 1 seyreltme: 1 vasıtasıyla canlılığı kontrol edin. Binoküler ışık mikroskobu altında bakıldığında tripan mavisi koruyacaktır bir tehlikeye membran ile hücreler, intakt membranlı sağlıklı hücre, beyaz görünecektir. Counhücrelerin% 80'den fazla 20 yaşayabilir olduğundan emin olun, 100 hücre t.
  2. Hücreler ~% 80 confluency ulaşana kadar önceden ısıtılmış taze VEGF medya ile Ortam 2 günde değiştirin.
  3. Önceden ısıtılmış bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. 2 ml tripsin nötrleştirme çözeltisi, ardından 5 dakika boyunca 2 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile inkübe edilerek T75 şişeden hücreler serbest bırakılması.
  4. Bir 50 ml konik bir tüp içinde süspansiyon haline getirilmiş edilmiş HuVEClerde toplayın. PBS ile T-75 şişeler herhangi bir ekstra hücreleri yıkayın ve 50 ml konik tüpler transfer.
  5. 10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje hücreleri.
  6. Süpernatantı 10 ml önceden ısıtılmış VEGF medya hücre pelet askıya.
  7. Hemasitometre veya benzer hücre sayım cihazı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
  8. (50.000 / oyuk) lamelleri ile 6-çukurlu bir tablaya (400,000 / çukur) veya 12-çukurlu plaka ya da eklemek hücre süspansiyonu miktarını hesaplayın. HUVECler ertesi gün deneme için hazır olacak.

4. Survival Testi Invasion / Etkileşim(Kaplama)

Not: Bu deney yaparken, / de 400,000 hücre 'de tohumlanmakta endotel hücrelerinin iki 6-oyuklu plakalar hazırlamak. Bir tabak bakteri bağlı ve ana hücreler tarafından değerlendirmek için kullanılacaktır. Diğer levha içi bakteriler için hesap verecek. Iki numune kopyaların bir deneyde ifa edilecek olan, 6-yuvalı plaka sağlar. Bu protokolün bir taslak hayatta kalma tahlil akış şeması (Şekil 2) bakınız.

  1. Onlar orta-log büyüme (OD 660 0.5-0.7) ulaşıncaya kadar (bölüm 1) yukarıda açıklandığı gibi anaerobik bakteri hazırlayın.
  2. Santrifüj bakteri 10 dakika için 5000 xg'de.
    Santrifüj dış anaerobik odası ise, sıkıca kapatılmış bir 15 ml tüp içinde bakteriyel numuneleri taşıyan oksijen sızmasını önlemek için parafilm kap sarma: edin.
  3. Topak haline P. yerleştirin gingivalis geri odasında, süpernatant atın. VEGF Beni resuspending önce tekrar PBS ile pelet bakteri yıkayındia. Tüm bakteri soyları, orta log fazında (~ 7 x 10 8 hücre / ml) karşılık gelen 0.7 OD 660 değerinde test için süspansiyonlar hazırlayın. Bakteriler şimdi enfeksiyon için hazır.
  4. Anaerobik odasına doku kültürü inkübatör HUVECler içeren transfer 6 oyuklu plakalar. Ortamı çıkarın ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa, anaerobik VEGF ortamının 2 ml ilave edilir ve enfeksiyon için sıcaklık dengelenmesi için 20 dakika boyunca anaerobik bir inkübatörde 37 ° C'de plakalar yerleştirin.
    Not: enfeksiyon için kullanılan olanları sağlamak için kan agar plaklarına Plaka bakteriler homojen ve enfeksiyon sırasında kontamine değildir.
  5. 100: enfeksiyon çokluğunda bakteri konakçı hücreleri (ana MOI bakteriler) Infect 1.
    Not: HUVEC hücre sayısı enfeksiyondan önce tek bir oyuk üzerinde tripan dışlama testi ile tespit edilir. Bakteriyel hücre sayısı (0,5 = 5 x 10 8 hücre / ml OD, gibi), optik yoğunluk ile belirlenmiştir. Bİçeriği: Bakteri konsantrasyonu HUVECler konsantrasyonuna 21 dayalı doğru İçişleri Bakanlığı ayarlanır.
  6. Anaerobik inkübatör içine enfekte HUVEC 6-çukurlu tabak yerleştirin ve bakteriler, 30 dakika boyunca, konak hücreleri ile etkileşim sağlar.
  7. BHI içinde saponin anaerobik odası içinde ve 0.2 um'lik bir filtreden filtre (ağ / hac% 1.0) hazırlayın.
  8. Hem takılı ve içselleştirilmiş bakteri Survival.
    1. Inkübatörden, aspirat ortam plakaları çıkarın anaerobik üç kez PBS ile yıkayın ve 2 ml (adım 4.8 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır),% 1.0 saponin, süzüldü ekleyin. Ev sahibi hücre lizizine izin vermek için 15 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Hücre kazıyıcı ile her iyi alt kazıyın. Beher kuyudan hücre karışımını toplamak ve 1 yapın: BHI 1 seyreltme.
    3. Numunenin seri dilüsyonları yapmaya devam edin. Bakteriyel türler ve konsantrasyona bağlı olarak, seri dilüsyonları ayarlayın. 1 ile başlayın: 100 veya 1: 1000 dilüsyonları.
    4. Kan agar plakaları üzerine istenen seyreltme 200 ul Plate. Bürünmüş37 ° C'de anaerobik kuluçka makinesinde parafilm ve yerine o plakalar.
    5. 37 ° C'de yedi günlük inkübasyondan sonra, plakalar çıkarın ve el koloniler saymak için bir ışık kutusu kullanılarak koloni oluşturan birimler (CFU) sayısı.
      Not: CFU numaralandırılan. CFU büyük miktarlar için, görüntü alınabilir ve bilgisayar programı CFU numaralandırılmasına kolaylaştırmak için kullanılabilir.
  9. Içselleştirilmiş bakteri Survival.
    1. Inkübatör plakaları çıkarın. Anaerobik PBS ile üç kez yıkanır ve takviye antibiyotik (gentamisin 300 ug / ml, metronidazole 400 ug / ml) ile 2 ml VEGF ortamı eklenir.
    2. 1 saat süreyle inkübe edin. Istenilen bakteri suşu öldürme% 100 etkilidir, böylece antibiyotik test etmek ve onlar konakçı hücreleri 22,23 nüfuz olmadığından emin olmak için emin olun.
    3. Aspire medya, süzülmüş% 1.0 saponin 2 ml ekleyin. Ev sahibi hücre lizizine izin vermek için 15 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Her wel alt Pençehücre kazıyıcı ile l. Her kuyudan hücre karışımı toplayın ve 1 yapın: BHI 1 seyreltme.
    5. Örnek (: 100, 1: 1000, 1) seri dilüsyonları hazırlayın.
    6. Kan agar plakaları üzerine istenen seyreltme 200 ul Plate. Anaerobik inkübatör parafilm ve yerinde plakaları sarın.
    7. 37 ° C'de inkübasyondan yedi gün sonra plakaları kaldırmak ve CFU sayımı C.

figure-protocol-11717
Şekil 2. ökaryotik hücreler ile anaerobik bakteri hayatta kalmak için kullanılan bir protokol şematik. Toplam bakteri hayatta kalma ve içselleştirilmiş bakteri hayatta kalmak için her iki deneyleri aynı anda yapılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ana Ce içine Bakterilerin 5. içselleştirilmesills (Floresan Mikroskobu)

Not: P. gingivalis, 2 'ile 7'-bis- etiketlenmiştir (2-karboksietil) -5- (ve-6) -Carboxyfluorescein, asetoksimetil ester (BCECF-AM). BCECF-AM floresan olmayan bir zan-geçirgen bir boyadır; Hücre içi esterazların etkisi ile floresein BCECF olan dönüşüm hücre canlılığı gösterebilir. P. gingivalis BCECF-AM boyası ile etiketlenmiş ve sonra ökaryotik hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Enfeksiyonu takiben, hücreler sabitlenir ve DAPI ve TRITC-falloidinle etiketli. Ökaryotik hücre çekirdeği leke kullanılan DAPI leke da değil metabolik cleave BCECF-AM can cansız bakterileri tanımlamak için bir karşı-önlem sağlar bakteriyel hücre çekirdeğine, etiketleyecektir. Konakçı hücreler TRITC-Phalloidin, kırmızı aktin boya ile vurgulanır.

  1. Otoklav lamelleri. Aseptik / gözenek 5 x 10 4 hücre endotelial hücreler, tohumlamadan önce 12 oyuklu plakalara lamelleri ekleyin. (Deneyden önce hazırlanan gün)
  2. yukarıda tarif edildiği gibi 12-yuvalı plakalar içinde 18 mm (# 1.5 kalınlık) dairesel lamelleri hazırlanan endotel hücrelerini yazıldı.
  3. Bölüm 1'de anlatıldığı gibi orta-log fazı büyüdü anaerobik bakteriler (= 0.5-0.7 OD 660) hazırlayın.
  4. Yıkama bakteri 5000 xg'de santrifüj ve 5-7 x 10 8 hücre / ml'de PBS içinde süspansiyon haline pelet ile anaerobik PBS ile 2x.
  5. 2 uM BCECF-AM bir son konsantrasyona kadar bakteriyel süspansiyon (5-7 x 10 8 hücre / ml) içinde 2 ml 0,2 mM BCECF-AM 20 ul ekle.
  6. Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  7. Anaerobik odasına doku kültürü inkübatör 18 mm (# 1.5 kalınlık) dairesel lamelleri numaralı seribaşı endotel hücreleri ile transfer plakaları. PBS ve anaerobik VEGF medya ile alışverişi ile yıkayın.
    Not: HUVECler ışık mikroskobu altında sağlıklı olduğundan emin olun. HUVECler% 80 birleşen, morfoloji üreticilerine karşılaştırılabilir olmalıdır ~ olmalıdır.
  8. Santrifüj etiketli bakteriler10 dakika için 5000 xg artık BCECF-AM boya kaldırmak için. 2 ml anaerobik VEGF medyada Askıya.
  9. 1 (bakteri: host) 100 MOI'da etiketlenmiş bakteri ile konak hücreleri enfekte.
  10. 30 dakika boyunca 37 ° C'de anaerobik odasında inkübe edilir.
  11. Ve PBS ile üç kez enfeksiyon yıkama hücreleri sonra 10 dakika boyunca taze hazırlanmış% 4.0 paraformaldehid düzeltmek.
    Not: hücrelerin sabitlenmesi sonra deney anaerobik ile odacığın dış tarafına yapılabilir.
  12. Yıkama PBS ile üç kez lamelleri.
  13. 10 dakika için% 0.2 Triton X-100, 1 ml ekleyin.
  14. Yıkama PBS ile üç kez lamelleri.
  15. 45 dakika boyunca lamelleri TRITC falloidinle (50 ug / ml) 50 ul ekle.
  16. Yıkama DAPI içeren yumuşak set montaj ortamı ile bir slayt 12 plaka ve yerden kaldırmak üç kez lamelleri. Oje ile kenarlarını kapatın.
    Not: Slaytlar karanlıkta birkaç ay saklanabilir. Foto-ağartma önlemek için hafif maruz kalmaktan kaçının.
  17. Görünüm slaytlarkonfokal mikroskop ile incelendi.
    1. Burada, (ters) bir AxioObserver etrafında düzenlenmiş bir 34 kanallı spektral sistemi (32 kanal dizi detektörü ve iki yan PMT dedektörleri, artı iletilen ışık dedektörü) bir motorlu XY sahnede stand kullanın. Mavi diyot (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), yeşil diyot (561 nm), kırmızı HeNe (633 nm) ve 440 nm darbeli lazer: Sistem beş lazerler vardır. (FRET-Flim için) 2 hibrid GaAsP dedektörleri ile bir Flüoresans Ömrü Görüntüleme sistemini donatın.
    2. 340-380 nm ve 540-560 nm, ve sırası ile 435-485 nm ve 570-590 nm'lik bir emisyon filtresi uyarım dalga boyları ile bir çift bant filtre kullanılarak bir kanalda DAPI ve TRITC floresans algılama. 440-500 nm eksitasyon dalga boyu ve 510-590 nm'lik bir emisyon filtresi olan bir filtre kullanılarak BCECF-AM floresans algılama.
      Not: Her bakteri suşu yapılmalıdır BCECF-AM için Kontrolleri canlı bakteri doğru etiketleme sağlamak için çalışılmaktadır. Öncelikle bu nonviab doğrulamakle bakteri DAPI-pozitif ve BCECF-negatiftir. İkincisi, canlı bakteri floresein BCECF içine BCECF-AM metabolize sağlamak. Bakteri veya BCECF-AM boyası değişken konsantrasyonları uygun etiketleme için test edilmesi gerekebilir.

Sonuçlar

Yukarıda özetlenen Protokoller P. arasındaki konak-patojen etkileşimi inceleyerek kullanılmıştır gingivalis ve endotel hücreleri. P. gingivalis W83 ve bir P. PG0228 bir silme taşıyan gingivalis V3150 çalışmada kullanılmıştır. PG0228 sonuçta P. etkileşimini etkileyebilir RNA ve protein seviyelerini değiştirebilir bir protein kodladığı tahmin edilmiştir Ev sahibi hücreleri ile gingivalis. P. PG0228 etkisini araştırmak ...

Tartışmalar

Yukarıdaki yöntemler eukaryotik hücreleri ile anaerobik bakteri ilişkinin değerlendirilmesi için özel bir tahlilleri tasarlamak için de kullanılabilir. Ancak, başarılı deneyler gerçekleştirmek için bazı noktalar vardır. İlk çalışmada kullanılan mikrobiyal soylar bulunmaktadır.

Bu, benzer bir büyüme aşamalarında ve invazyon verim 13 etkileyebilir yukarıda herhangi bir fark benzer hücre konsantrasyonları elde hayatta kalma tahlilinde hem de iki suşlar?...

Açıklamalar

Authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.

Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type BCoy Laboratory ProductsModel 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep BloodBBL221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor PoolLifeLine TechnologyFC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeLine TechnologyLL-0003
TrypKitLifeLineLL-0013
SaponinRiedel-de Haen16109
Gentamicin Sulfate SaltSigma-AldrichG-1264
MetronidazoleSigma-AldrichM-3761
BCECF-AMLifeTechnologiesB1150
TRITC Phalloidin Sigma-AldrichP1951
18 mm Circular CoverslipsElectron Microscopy Sciences72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200

Referanslar

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

EnfeksiyonSay 106anaerobik bakteriPorphyromonas gingivalisIstilahayatta kalmakonak patojen etkile imih cre i i bakterieki

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır