قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Summary

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H⁺ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Abstract

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis¹. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate², the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate ^3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO₂, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate^- + H⁺ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO₂, hydration to H₂CO₃ and dissociation to HCO₃^- + H⁺ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification ⁶. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Introduction

الهدف العام من هذه الطريقة لقياس دقيق لمعدل حال السكر من الخلايا باستخدام تحليل تدفق خارج الخلية. القياس الكمي للمعدل حال السكر باستخدام تحمض خارج الخلية هو نقطة النهاية المرجوة من العديد من التجارب. ومع ذلك، فإن المعدل الإجمالي للتحمض خارج الخلية هو مجموع عنصرين: تحمض الجهاز التنفسي، في شكل CO ₂ (الذي يرطب إلى H ₂ CO ₃ ثم تنأى لHCO ₃ ^- + H ^+)، وتحمض حال السكر، في شكل اللاكتات ^- + H ^+.

وحتى وقت قريب كانت تعتبر مساهمات CO ₂ إلى إجمالي تحمض خارج الخلية تذكر في منصة القياس المستخدمة هنا، محلل XF24 ^7. ومع ذلك، فمن الواضح في الأنظمة الأخرى المتعددة التي CO ₂ يمكن أن تكون مساهما رئيسيا في الخلية تحمض ^4-5. أوراق متعددة تقر هذا يخدعtribution، ولكن لا تحاول الكميات مباشرة من CO ₂ -derived ^3،8،9 الحمضية. أثبتنا مؤخرا كميا أن إنتاج CO ₂ هو مصدر هام من مصادر خارج الخلية تحمض في هذا النظام ^6. وعلاوة على ذلك، رغم أن هناك العديد من المسارات الأيضية التي تولد CO ₂ من هدم الجلوكوز، وتلك التي تقوم بها dehydrogenases مصفوفة في دورة حمض الستريك هي المساهمة ساحق وجميع مصادر أخرى تولد كميات CO ₂ التي تقع ضمن الخطأ التجريبي ^6.

دون تصحيح لCO ₂ الإنتاج، وتحمض خارج الخلية وبالتالي هو مؤشر غامضة من معدل حال السكر، ولا يمكن أن تستخدم كميا. ويبرز لدينا المنشور السابق عدة حالات حيث يضم الجهاز التنفسي CO ₂ الجزء الأكبر من إجمالي إشارة تحمض، حتى في خلايا يعتقد عموما لاستخدام أساسا تحلل ^6. بالإضافة إلى ذلك،الجهاز التنفسي مساهمة CO ₂ إلى إجمالي تحمض تختلف على نطاق واسع خلال التجارب التنميط الأيضية المشتركة، مما يدل على أن المقارنة الصحيحة من معدل حال السكر خلال أجزاء مختلفة من تجربة تتطلب تصحيح CO _2.

لقياس معدل حال السكر من الخلايا باستخدام معدل تحمض خارج الخلية، فمن الضروري تحويل تغيرات درجة الحموضة للتغيرات في إجمالي H ⁺ ولدت، وطرح تحمض خارج الخلية التي تسببها CO ₂ طرحها أثناء التشغيل من دورة حمض الستريك. هنا، نحن تصف طريقة واضحة لقياس خارج الخلية معدل إنتاج بروتون (من التغيرات خارج الخلية في درجة الحموضة وقوة معايرة التخزين المؤقت للوسط مقايسة) وCO ₂ إنتاج (من التغيرات خارج الخلية في _O 2 التركيز)، وشرح كيفية حساب معدل حال السكر استخدام هذه القياسات.

هذه القوة طريقة ENS أداة القياس تحمض خارج الخلية عن طريق استخدامه لحساب معدل حال السكر بشكل صحيح كما حددتها إنتاج اللاكتات. دون تصحيح لCO التنفسي ₂ (أو القياس المباشر لاكتات)، فإنه من المستحيل تحديد ما إذا كان وإلى أي مدى يعكس معدل تحمض إجمالي معدل حال السكر، يفند تفسير التجارب التي تستخدم الكلي تحمض خارج الخلية كمقياس مباشر من إنتاج اللاكتات.

الحسابات

CO ₂ واللاكتات و، داخل الخطأ التجريبي، اثنين فقط من المساهمين في إنتاج حمض خارج الخلية، استنادا إلى التجارب مع الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية ^6. ولذلك، فإن معدل إجمالي تحمض خارج الخلية (PPR، ومعدل إنتاج بروتون) يمكن تعريفها بأنها:

PPR _TOT = PPR _{التركيب} + PPR _glyc المعادلة 1

. _content "> حيث TOT = المجموع؛ التركيب = الجهاز التنفسي؛ glyc = حال السكر حال السكر PPR هو على النحو التالي:

PPR _glyc = PPR _طفل - PPR _{التركيب} المعادلة 2

هنا،

PPR _TOT = ECAR _طفل / BP المعادلة 3

حيث ECAR = معدل خارج الخلية تحمض (ميل / دقيقة)، وBP = طاقة التخزين المؤقت (ميل / بمول H ⁺ في 7 ميكرولتر)، في حين

PPR _{التركيب} = (10 ^{درجة الحموضة PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{درجة الحموضة PK ₁₎₎} (ماكس H ⁺ / O ₂₎ (OCR _طفل - OCR _{تعفن / MYX)} المعادلة 4

حيث K ₁ = المشترك ثابت توازن CO ₂ ترطيب والتفكك إلى HCO ₃ ^- + H ^+. ماكس H ⁺ / O ₂ = عشرالبريد CO ₂ تحمض -derived لتحول التمثيل الغذائي معين مثل أكسدة كاملة من الجلوكوز ^6؛ OCR = معدل استهلاك الأكسجين _(O 2 بمول / دقيقة)، وOCR _{تعفن / MYX} = غير الميتوكوندريا OCR.

المعادلة 4 يعزل الميتوكوندريا OCR بطرح أي OCR غير الميتوكوندريا (كما هو موضح OCR التي هي مقاومة للالميتوكوندريا التنفسي السموم روتينون وmyxothiazol) ويمثل الحد الأقصى للH ⁺ ولدت في _O 2 المستهلكة لكل الركيزة (ماكس H ⁺ / O ₂ ) (انظر ^6)، وكذلك نسبة CO ₂ مما أدى إلى H ⁺ في درجة الحرارة التجريبية ودرجة الحموضة (10 ^{درجة الحموضة PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{درجة الحموضة PK _1).} لأكسدة كاملة من الجلوكوز، والأكسجين الميتوكوندريا معدل استهلاك (OCR) يساوي بالضبط إلى نسبة CO ₂ الإنتاج. وفي حجم فحص يقتصر قياس تدفق خارج الخلية، CO ₂ المنتجاتد بواسطة التنفس لا يزال محاصرا في المتوسط ​​الفحص. ورطب معظم المحاصرين CO _{2 إلى} H ₂ CO _3، التي تنأى ثم إلى HCO ₃ ^- + H ^+. يبقى جزء صغير حل ولكن ليس رطب، وجزء آخر صغير هو رطب ولكن ليس فصلها، وفقا لما تمليه الديناميكا الحرارية التي كتبها ثابت التوازن جنبا إلى جنب من CO ₂ ترطيب والتفكك إلى HCO ₃ ^- + H ⁺ في درجة حرارة التجريبية (37 ° C) ودرجة الحموضة (~ 7.4).

وبالتالي، فإن المعادلة كاملة لحساب PPR _ز بطرح PPR _{التركيب} من PPR _طفل هو:

PPR _glyc = ECAR _طفل / BP - (10 ^{درجة الحموضة PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{درجة الحموضة PK ₁₎₎} (ماكس H ⁺ / O ₂₎ (OCR _طفل - OCR _{تعفن / MYX)} المعادلة 5

أنان بهذه الطريقة، ومعدلات التنفس وتحلل، وكذلك ترتبط معدلات إنتاج ATP، ويمكن تحديدها كميا من قياسات مباشرة (استهلاك الأوكسجين، وتحمض خارج الخلية، وقدرة التخزين المؤقت) والاستيراد أو حساب القيم الأخرى المطلوبة (H ⁺ / O ₂ ، P / O، والتوازن K ثابت ₁₎ ^6. التجربة الموصوفة هنا تتوسع على التقنيات القياسية لاستخدام التمويه محلل خارج الخلية مثل فرس البحر XF24 ^10،11. لصيغ قياس تدفق خارج الخلية الأخرى (على سبيل المثال، XF ^ه 96، أو XFP)، ينبغي تحجيمها كافة وحدات التخزين أدناه بشكل مناسب.

قوة التخزين المؤقت للفحص المتوسطة يمكن أن تقاس بناء منحنى القياسية إما مباشرة في منصة تدفق خارج الخلية أو بشكل منفصل باستخدام مسبار درجة الحموضة معايرة. هنا، يتم إعطاء ثلاثة خيارات لقياس التخزين المؤقت من خارج الخلية تدفق المتوسطة الفحص، بما في ذلك استخدام جميع injectiعلى منافذ للمحلل تدفق خارج الخلية مع عينة الآبار خالية من الخلايا، أو فقط باستخدام آخر ميناء حقن في الآبار التي تحتوي على الخلية (الجزء 1) أو باستخدام قياس درجة الحموضة الخارجي (القسم 2). انظر جدول المرفق للحصول على الحسابات الكاملة للبيانات سبيل المثال.

لقياس قوة التخزين المؤقت باستخدام القدرة على الكشف عن درجة الحموضة الصك تدفق خارج الخلية، فمن الأكثر أمانا لاستخدام الآبار خالية من الخلايا لتقليل التباين إشارة. ومع ذلك، في الخطأ، لا يوجد فرق إحصائي بين (لا تظهر البيانات) والآبار عند تنفيذ هذا القياس التي تحتوي على الخلايا خالية من الخلايا. ملاحظة: الاختلاف هو موضح في الخطوة 1.7 تحمل ميزة يمثل أي تغييرات محتملة على التخزين المؤقت التي يمنحها المركبات المضافة أو بسبب وجود خلايا، مع الحرمان من إشارة ضجيج. لكن، وكما ذكر أعلاه، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في السلطة التخزين المؤقت المحسوبة بين تصميم خالية من الخلايا هو مبين في الجدول 1 وتصميم بعد تجربة في الجدول 2 تحت ظروف تجريبية موضح هنا.

بالإضافة إلى ذلك، على نطاقات ΔpH الصغيرة (<0.4 وحدة؛ تجريبيا أفضل يقتصر على 0.2 وحدة)، المنحدر الخطي الحصول عليها عن طريق التآمر Δ ميلا في الساعة / بمول H ⁺ يقارب نحو كاف علاقة لوغاريتمية بين ΔpH و[H ^+]. لذا المنحدر من هذا المنحنى القياسي يمثل السلطة التخزين المؤقت من المتوسط ​​فحص تحت الاختبار في درجة الحموضة / نانومول H ⁺ في 7 ميكرولتر، أو ميلا في الساعة / بمول H ⁺ في 7 ميكرولتر. ونحن نوصي زيادة قوة التخزين المؤقت متوسطة الحجم أو تقليل كثافة الخلايا للعينات التي تتجاوز تغيير وحدة 0.2 درجة الحموضة خلال فترة القياس. ويمكن أيضا أن انخفض قياس الوقت، ولكن هذا قد يقصر من معدل تحمض حالة مستقرة وإدخال خطأ في حساب المعدل.

Protocol

1. قياس جارى الطاقة في الجريان صك خارج الخلية: شكلان

ملاحظة: تم إعداد الحسابات والطرق الموضحة هنا باستخدام خارج الخلية الجريان محلل. لأدوات أخرى، يجب تحجيم حجم قياس مناسب.

1. إعداد 0.1 M القياسية حمض الهيدروكلوريك في المياه باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز (انظر المواد والمعدات) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: يتم عرض حسابا سبيل المثال لإعداد حقن حمض الهيدروكلوريك للاستخدام في جميع المنافذ حقن أربعة في الجدول رقم 1:

الجدول 1. حقن حمض الهيدروكلوريك على التوالي إلى فحص تدفق خارج الخلية بشكل جيد.

2. إعداد التخفيفات من مستوى حمض الهيدروكلوريك في المتوسط ​​إلى أن يعاير كما في الجدول (1) لعدد من مكررات التقنية كونها كارالعبوات الناسفة في لوحة واحدة، زائد واحد للسماح للخطأ pipetting ل، على سبيل المثال، لمدة أربعة مكررات التقنية للميناء والحقن، وإعداد الأوراق المالية من (1.1 ميكرولتر × 5) 0.1 M حمض الهيدروكلوريك في (48.9 ميكرولتر × 5) فحص المتوسطة.
3. توزيع 50 ميكرولتر في كل ميناء ألف من خرطوشة قياس التحقيق. كرر هذا الإجراء الموانئ المتبقية B، C و D.
4. تشغيل فحص تدفق خارج الخلية ^{10 مع} دورة المعايرة القياسية، تليها دورتين من [مزيج 2 دقيقة، 1 دقيقة الانتظار، و 5 دقائق قياس] لكل من الإضافات ميناء أربعة (انظر الشكل 2).
   1. برنامج التجربة أعلاه في برنامج الصك وفقا لتعليمات البرنامج. تحميل خرطوشة مستعدة في الجهاز وإجراء المعايرة وفقا لتعليمات البرنامج.
   2. عند المطالبة من قبل البرنامج، وإزالة لوحة تحتوي على calibrant وإدراج لوحة تحتوي فحص المتوسطة في كل بئر في الصك؛ متابعة البرنامج.
5. U الغناء متوسط ​​8-10 نقاط البيانات التي تم الحصول عليها في حالة مستقرة (عادة 8-10 نقطة مشاركة) من قبل وبعد كل إضافة الميناء، وحساب (التراكمي) الفرق في درجة الحموضة (ΔpH) التي تسببها كل حقنة من حمض القياسية.
6. رسم ΔpH ضد نانومول H ⁺ الواردة في حجم 7 ميكرولتر المحاصرين من قبل المسبار القياس. المنحدر الخطي هو القدرة التخزين المؤقت (BP) في ميلا في الساعة / بمول H ^+.
7. بدلا من ذلك إلى خطوات 1،2-1،3، وإجراء القياسات ΔpH بعد الفحص في المنافذ التي A، تستخدم B، و C لإجراء التجربة، تليها حقن حمض الهيدروكلوريك في ميناء D. وكما في الجدول رقم 2، وأربعة مكررات التقنية هي يستخدم لتوليد كل نقطة من منحنى 5-نقطة القياسي في 20 بئرا التجريبية (باستثناء الآبار الأربعة خلفية تصحيح درجة الحرارة) من خارج الخلية لوحة فحص التدفق.

53464table2.jpg "/>
الجدول 2. حمض الهيدروكلوريك واحدة الحقن في مقايسة تدفق خارج الخلية بشكل جيد.

2. قياس جارى الطاقة باستخدام مقياس درجة الحموضة الخارجية

ملاحظة: لقياس قوة التخزين المؤقت من المتوسطة باستخدام مسبار درجة الحموضة الخارجي، معايرة التحقيق في 37 ° C والحفاظ على درجة الحرارة هذه لجميع الكواشف أثناء التجربة.

1. إعداد 0.1 M القياسية حمض الهيدروكلوريك في المياه باستخدام حمض الهيدروكلوريك تركيز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. دافئ التحقيق درجة الحموضة، ودرجة الحموضة المعايير، والمتوسطة الفحص الذي من المقرر أن تقاس قوة التخزين المؤقت، و 0.1 M حمض الهيدروكلوريك إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
3. معايرة درجة الحموضة التحقيق في 37 ° C وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحفاظ على جميع الكواشف عند 37 درجة مئوية طوال الفحص باستخدام لوحة الحرارة أو حمام الماء.
4. قسامة 10 مل من المتوسط ​​الفحص في كوب صغير أو أنبوب مخروطي الشكل. مراقبة درجة الحموضة بشكل مستمر باستخدام مسبار درجة الحموضة مغمورة.
5. إضافة 0.1 M حمض الهيدروكلوريك لكما يقول المتوسطة في 10-20 مكل.
   1. ضمان خلط باستخدام بقضيب أو يحوم الحاوية يدويا بعد كل إضافة الحمضية.
   2. السماح لبضع ثواني لقياس درجة الحموضة لتحقيق الاستقرار، ثم سجل الرقم الهيدروجيني بعد كل إضافة.
   3. كما هو موضح في الجدول رقم 3، وجعل عدد كاف من الإضافات لضمان دقة حساب المنحدر وتغطي مجموعة ودرجة الحموضة المتوقعة خلال التجربة.

الجدول 3. قياس قوة التخزين المؤقت باستخدام متر الرقم الهيدروجيني. تمثل البيانات تجربة نموذجية مع ستة 20 إضافات ميكرولتر من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك.

6. مؤامرة ضد ΔpH نانومول H ⁺ وأضافت في 7 ميكرولتر، وإعطاء منحدر الخطي الذي يمثل السلطة التخزين المؤقت (الشكل 1).

. في غضون صفحة = "دائما">
الشكل 1. تحديد السلطة التخزين المؤقت. منحنى حمض الهيدروكلوريك معيار قياس كما في الجدول رقم 1، الجدول 2 أو (هنا) كما في الجدول 3. المنحدر من منحنى تناسب خطي يعطي السلطة التخزين المؤقت (الرقم الهيدروجيني / نانومول H ⁺ في 7 ميكرولتر). تمثل كل نقطة يعني ± SEM من ن = 9 مكررات التقنية.

7. مرة واحدة ومن المعروف أن السلطة التخزين المؤقت من خلال الأسلوب 1 أو 2 أعلاه، تحويل الإشارات ECAR (ميل / دقيقة) لPPR (بمول H ⁺ / دقيقة / البروتين ميكروغرام) عن طريق قسمة ECAR من قبل التخزين المؤقت الطاقة (BP) (ميل / بمول H ⁺⁾ ورفع لمحتوى البروتين من كل جانب:
   PPR _طفل (بمول H ⁺ / دقيقة / البروتين ميكروغرام) = ECAR (ميل / دقيقة) / BP (ميل / بمول H ⁺ في 7 ميكرولتر) / البروتين لكل بئر (ميكروغرام) المعادلة 6
8. بدلا من ذلك، استخدم نفس الطريقة في التجاربالصورة 1 أو 2 لحساب جارى القدرات القيمة (BC) المستخدمة من قبل برنامج أداة لحساب تلقائيا PPR خلال جمع البيانات.
   ملاحظة: دليل المستخدم الصك ¹² (صفحة 107) يوفر معلومات مفصلة حول حساب واستخدام قدرة التخزين المؤقت، حيث وصفت قبل الميلاد كما
   BC (مول / لتر) = الشامات H ⁺ / (ΔpH حجم س العازلة (L)) المعادلة 7
   ملاحظة: سعة التخزين المؤقت على النحو المحدد في المعادلة 7 يمكن أن تحسب في المقايسات الصك أو التحقيق درجة الحموضة الخارجي هو موضح أعلاه. يتم التحويل بين السلطة التخزين المؤقت وقدرة التخزين المؤقت بسهولة (انظر جدول المرفق):
   BC = 1 × 10 ^-9 / BP ((ميل / بمول H ⁺ في 7 ميكرولتر) / 7 ميكرولتر) معادلة 8
   ملاحظة: إذا كان معروفا قبل إجراء الفحص، وقدرة التخزين المؤقت يمكن إدخالها مباشرة في البرنامج أداة أثناء الإعداد التجريبية.
9. تطبيق هذا الإجراء والحسابات المستخدمة أعلاه إلى معظم النظم العازلة التقليدية، كما هو موضح في المنشور السابق ^6.
   ملاحظة: الجدول 4 قوائم قوة التخزين المؤقت وقدرة التخزين المؤقت للعديد من وسائل الإعلام التقليدية.

الجدول 4. السلطة جارى وقدرة التخزين المؤقت وسائل الإعلام المحدد.

3. إجراء عملية خارج الخلية الجريان الفحص باستخدام خلايا C2C12 بالخلايا العضلية الجذعية

ملاحظة: في الخطوة 3.4.3، كان هناك -derived عدم وجود فروق ملحوظة في CO ₂ إنتاج حامض تعتمد على وجود الأنهيدراز الكربونيك في الثقافة C2C12، مما يدل على أن وجودها غير مطلوب للتحويل الكامل من CO _{2 إلى} HCO ₃ ^- + H ^+. ومع ذلك، هذا الاختبار تجريبيا في النظم التجريبية مختلفة فمن المستحسن قبل أومالأنهيدراز الكربونيك itting.

1. ثقافة الماوس C2C12 myoblasts ¹³ إلى 37 درجة مئوية تحت 95٪ الهواء / 5٪ CO ₂ في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 11.1 ملي الجلوكوز، 2 مم الجلوتامين، و 10٪ ت / ت مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل.
2. 24 ساعة قبل الفحص، وخلايا لوحة / البذور في 100 ميكرولتر من نفس الثقافة المتوسطة في 20000 خلية / جيد في 24-جيدا البوليسترين خارج الخلية لوحة فحص التدفق (انظر المواد وطرق) مع أي طلاء إضافي.
3. تمييع أوليغوميسين، FCCP، والروتينون بالإضافة إلى myxothiazol، وحمض الهيدروكلوريك (اختياري) إلى 10X التركيز النهائي في كريبس قارع الأجراس الفوسفات HEPES (KRPH) مقايسة المتوسطة (2 ملي HEPES و 136 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي ناه ₂ PO _4، 3.7 ملي بوكل، 1 ملي MgCl _2، 1.5 ملي CaCl _2، 0.1٪ ث / ت الدهنية خالي من الحمض البقري ألبومين المصل، ودرجة الحموضة 7.4 عند 37 درجة مئوية).
4. إعداد الخلية
   1. 30 دقيقة قبل الفحص، وغسل الخلايا الملتصقة ثلاث مرات بواسطة الشفط لشركة جنرال الكتريكntly إزالة المتوسطة من البئر ثم إضافة ببطء 500 ميكرولتر KRPH.
   2. احتضان الخلايا بعد الخطوة غسل الثالثة عند 37 درجة مئوية تحت الهواء (وليس تحت CO _2، والتي سوف تغير درجة حموضة هذه الوسيلة خالية من بيكربونات 5٪).
   3. في بداية الفحص، استبدال KRPH في الآبار مع 500 ميكرولتر KRPH الطازجة التي تحتوي على الأنهيدراز الكربونيك 500 U / مل وإما الجلوكوز (10 ملم) أو المتوسطة فقط، مع عدم وجود ركيزة إضافية.
5. تحميل خرطوشة الاستشعار
   1. الماصة 50 مكل من كل 10X مجمع أعدت في الخطوة 3.3 في الموانئ خرطوشة من خارج الخلية تدفق خرطوشة استشعار على النحو التالي (تركيزات النهائي في فحص بالنظر أيضا): ميناء A: 2 ميكروغرام / مل أوليغوميسين، بورت B: 0.5 ميكرومتر FCCP، ميناء C : 1 ميكرومتر روتينون، 1 ميكرومتر myxothiazol، بورت D: حمض الهيدروكلوريك (إذا كان أداء حمض المعايرة في الفحص كما هو موضح أعلاه وفي الجدول 2).
      ملاحظة: لغرض إكمال السلسلة التنفسية تثبيط الموصوفة هنا، 1 ميكرومتر بلديxothiazol يمكن أن تستخدم بالتبادل مع 1 ميكرومتر antimycin A.
6. خارج الخلية فحص تدفق:
   1. أداء قياسي خارج الخلية تدفق فحص لتحديد التحكم في الجهاز التنفسي كما هو موضح في ^10.

ملاحظة: للحصول على كل جزء من التجربة، وتحديد المزيج، الانتظار، وأوقات قياس المطلوب، فضلا عن عدد من الدورات في القطاع.

ملاحظة: تم جمع البيانات في الجدول رقم 5 على دورتين فحص من 2 دقيقة المزيج، 1 دقيقة الانتظار، و 5 دقائق مقياس لكل قطاع، مع ثلاث دورات فحص تحدث بعد إضافة منفذ D من كميات مختلفة من حمض الهيدروكلوريك (لمعايرة التخزين المؤقت السلطة كما هو الحال في الجدول 2).

الجدول 5. خارج الخلية التكوين فحص التدفق.

4. Measuriنانوغرام النهاية نقطة تركيز اللاكتات

ملاحظة: للتحقق من صحة الفحص غير المباشر هو موضح هنا في بعض نظام مختلف، نهاية نقطة تركيز اللاكتات في نهاية يمكن تحديدها مباشرة في التقليدية لوحة 96-جيدا تجربة التدفق خارج الخلية من خلال قياس سرعة الأولية (أكثر من 2 دقيقة) للحد من NAD ⁺ → NADH يحفزه نازعة اكتات، وصفت بالتفصيل في موقعنا نشر قبل ^6. للبيانات الواردة في ممثل النتائج، كان تركيز اللاكتات نقطة النهاية في الآبار فحص تحتوي على الجلوكوز ~ 40 ميكرومتر.

1. إعداد 2X المتوسطة الهيدرازين: 1 M تريس، 20 ملي EDTA، 400 ملي الهيدرازين، ودرجة الحموضة 9.8 عند 22 درجة مئوية). مباشرة قبل بدء الفحص، إضافة NAD ⁺ إلى 4 ملم ونازعة اللاكتات (LDH) إلى 40 U / مل. التشكيل النهائي المتوسطة مقايسة (1X): 500 ملم تريس، 10 ملي EDTA، 200 ملي الهيدرازين، 2 مم NAD ^+، 20 U / مل LDH.
2. مباشرة بعد فحص تدفق خارج الخلية، وإزالة 100ميكرولتر من مقايسة المتوسطة من كل بئر من خارج الخلية لوحة فحص تدفق ونقل إلى بئر مبهمة (أسود) لوحة 96-جيدا.
3. لكل عينة جيدا، إضافة 100 ميكرولتر 2X الهيدرازين المتوسطة.
4. تحميل على الفور لوحة في قارئ صفيحة ميكروسكوبية والبدء في رصد NADH مضان في 340 نانومتر الإثارة / 460 الانبعاثات نانومتر.
5. تسجيل السرعة الأولية لحوالي 2 دقيقة.
6. تشغيل تجربة مماثلة لبناء منحنى القياسية بالتآمر السرعة الابتدائية ضد تركيز اللاكتات لتركيزات اكتات أضاف 0-50 ميكرومتر.
7. حساب تركيز اللاكتات في كل التجريبية جيدا باستخدام منحنى القياسية.

5. قياس محتوى البروتين

1. إزالة ما تبقى المتوسطة فحص من كل بئر من لوحة فحص.
2. غسل الآبار ثلاث مرات مع 250 ميكرولتر خالية من BSA KRPH، والحرص على التقليل من تهجير الخلايا من السطح جيدا السفلي.
3. إضافة 25 ميكرولتر RIPA تحللالمتوسط ​​(150 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، 1 ملم EGTA، 1 ملم EDTA، 1٪ ت / ت تريتون X-100، و 0.5٪ ث / ت deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ ت / ت SDS، ودرجة الحموضة 7.4 عند 22 درجة مئوية) إلى كل بئر من لوحة فحص.
4. احتضان لوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
5. تستنهض الهمم لوحة على لوحة شاكر في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
6. قياس تركيز البروتين بالطرق العادية، على سبيل المثال، عن طريق فحص BCA، وضمان أن تكوين تحلل العازلة متوافق مع أسلوب القياس. محتوى البروتين في التجربة في الشكل 2 كان ~ 4 ميكروغرام / جيد.

النتائج

ويبين الشكل (2) والبيانات الأولية لتجربة نموذجية. استخدمت مشاركة 10 نقاط القياس من تسجيل نقطة إلى نقطة على حد سواء OCR ودرجة الحموضة (مظللة أشرطة عمودية) عن الحسابات. المخاوف الأولية التي من شأنها أن متوسط ​​قيمة (قياس نقطة الوسط) من كل دورة الفحص لا توفر القرار كاف من معدل حسابا دقيقا، لا سيما ويبدو أن فارق طفيف بين الجمع الميناء وثابت معدل تحمض الدولة، ولم تنقلها من هناك، لأن هذا لا يبدو أن تسهم إسهاما كبيرا في خطأ في الحساب (لا يظهر). بدلا من ذلك، إذا تم إدخال قدرات التخزين المؤقت الصحيحة أثناء الإعداد التجريبية، طاعون المجترات الصغيرة يمكن قراءتها مباشرة من قراءات جمع البيانات الصك عن طريق عرض الإخراج PPR في البرنامج أداة أو في شكل PC-المتوافقة المتاحة باعتبارها واحدة من إعدادات إخراج البيانات.

ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
الشكل 2. آثار تدفق خارج الخلية التمثيلية للO _{2 و} H ^+. OCR ودرجة الحموضة يتتبع للتجربة سبيل المثال في الجدول رقم 5، التي تحتوي على 10 ملي الجلوكوز في بداية الفحص. وكان ميناء D تركيزات حمض الهيدروكلوريك مختلفة لمعايرة قوة التخزين المؤقت (لا يظهر في هذه آثار متوسط). بيانات من نشر السابق ^6. تمثل كل نقطة يعني ± SEM من ن = 8 مكررات البيولوجية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل البيانات من نتائج ممثلة

باستخدام جداول البيانات المبينة في الجدول 6 وقدمت كمرفق، يمكن إدخال قيم البيانات من الآبار الفردية في الأعمدة تظهر مع رؤوس صفراء. جميع الأعمدة الستة ل يتم احتساب حق من هذه الإدخالات. على سبيل المثال في الجدول 6 يبين حسابات PPR _{التركيب} وPPR _glyc باستخدام ECAR والبيانات OCR من الآبار الفردية للظروف المحلية مع أو بدون الجلوكوز وأضاف، قبل أن ميناء A إضافة أوليغوميسين. وبلغ متوسط ​​مكررات التقنية على كل المستحضرات البيولوجية عادة لإعطاء قيم واحدة من المخرجات في الأعمدة الأربعة الأخيرة، ثم وبلغ متوسط ​​البيانات من المستحضرات البيولوجية المختلفة مع انتشار المناسب الإحصاءات خطأ في BP وهذه القيم الأربع.

الجدول 6. حساب الجهاز التنفسي وتحمض حال السكر. أعمدة رأسية في الأصفر تشير القيم إدخالها من حساب (على سبيل المثال، BP، ماكس H ⁺ / O _2)، أو من جمع البيانات (على سبيل المثال، _طفل ECAR، OCR). ملاحظة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول. | الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول كما جداول البيانات إكسل .

مساهمات تحلل والتنفس لPPR بعد التصحيح

ويبين الشكل 3 إخراج رسومي للبيانات محسوبة كما في الجدول رقم 6 لمعدلات الأم من تحمض حال السكر والجهاز التنفسي، والمعدلات التالية أوليغوميسين إضافة (ميناء A)، والمعدلات التالية FCCP إضافة (بورت B). وتبين هذه البيانات بوضوح كيف أن نسب التنفسي وحال السكر تغيير تحمض مع اختيار الركيزة (الجلوكوز مقابل التحكم (CTL) مع أي المضافة) ومع الوضع الميتوكوندريا (وظيفة الأم مقابل وظيفة غيرت دواء).

">
الشكل 3. معدل إنتاج بروتون (PPR) من مصادر حال السكر وأمراض الجهاز التنفسي. PPR من التنفس (الأجزاء المفتوحة) وتحلل (أجزاء شغل) من الخلايا C2C12 حسابها باستخدام المعادلة 5 مع الجلوكوز وأضاف (ثلاثة أشرطة اليسرى) أو بدون الجلوكوز المضافة (ثلاثة أشرطة اليمنى). بيانات من ^6. تمثل جميع البيانات يعني ± SEM من ن = 8 مكررات البيولوجية.

Discussion

تحمض خارج الخلية هو مؤشر قياس بسهولة من معدل الأيض الخلوي. لتحديد بشكل صحيح معدل تحلل الخلوية (على النحو المحدد إنتاج اللاكتات) فمن الأهمية بمكان أن نعرف قوة التخزين المؤقت للوسط الفحص، وإلى تحويل قياسات التدفق خارج الخلية من استهلاك الأوكسجين وتحمض إلى بروتون معدلات الإنتاج. قبل تنفيذ هذا الحساب، وتحمض الناتجة من CO ₂ الذي صدر في دورة حمض الستريك يمكن طرح، وترك تحمض الذي ينجم عن إنتاج اللاكتات.

طرق مختلفة متعددة نظرا هنا لقياس قوة التخزين المؤقت لهذا التصحيح تحمل مزايا وعيوب مختلفة. القياس الخارجي باستخدام مسبار درجة الحموضة ودرجة عالية من الدقة وقابلة للتكرار، ولكن قد لا تعكس الفروق الصغيرة في الكشف عن درجة الحموضة التي أدخلتها fluorophores الواردة في لوحة الفحص، إضافة مركبات خلال الفحص، أو وجود رانه الخلايا نفسها. للفي لوحة قياسات درجة الحموضة وتتناول هذه القضايا، ولكن أيضا إدخال درجات متفاوتة من الضوضاء التجريبية.

تصحيح CO _{2 إلى} ECAR يسمح لأول مرة على حساب اضح لا لبس فيه والكمي للمعدل حال السكر، ويكشف عن تباين في مساهمة الجهاز التنفسي وحال السكر إلى إجمالي ECAR أثناء التجربة. باستخدام المعادلة (5) وقياسات OCR، ECAR، والتخزين المؤقت السلطة، ومعدل حال السكر يمكن حسابها باستخدام جدول بسيط المقدمة (الجدول 6). يمكن التحقق من هذا المعدل عن طريق قياس اللاكتات اللاحق، إذا رغبت في ذلك ^6. في الخلايا حيث مسار الفوسفات البنتوز نشطا للغاية، واستخدام مثبطات ممر مثل 6-aminonicotinamide قد يكون مفيدا لعزل معدل حال السكر. حساب لمساهمات كل من CO ₂ ^- والمستمدة من اللاكتات H ⁺ من مجموع قياس الخلوية إضافي تحمض معدل والأكسجين Consumptأيون المعدل هو أداة لا تقدر بثمن لاستخدام البيانات تدفق خارج الخلية في الإدلاء ببيانات قوية وكمية عن النشاط الأيضي.

باستخدام الإجراءات الموضحة هنا، بما في ذلك التعديلات المختلفة لقياس قوة التخزين المؤقت، وتحقيق الاستفادة المثلى من التجربة التدفق خارج الخلية للخلايا قيد التحقيق والبيانات المطلوبة، فإن معدل تحلل في خلايا سليمة يمكن كميا في إطار مجموعة واسعة من الظروف التجريبية. هذا الأسلوب يقتصر على الخلايا التي يمكن أن تنمو في ثقافة ملتصقة على (أو الخلايا أو العضيات التي يمكن الالتزام بها) على سطح البوليسترين. هو الأكثر موثوقية عندما الخلايا المستزرعة هي متجانسة ومتموجة، على الرغم من بيانات مفيدة قد لا يزال الحصول على مجموعة من هذه الشروط. الحسابات تتطلب بعض المعرفة من عملية التمثيل الغذائي للخلايا، والحد الأقصى H ⁺ / O ₂ نطاقات ،65-1،0 للأكسدة كاملة من ركائز مختلفة وأكثر لالأكسدة الجزئية ^6، ولكن إذا كانت الخلايا كnown لأكسدة الجلوكوز، يمكن افتراض قيمة من 1.0.

رغم أهميتها لجميع خصائص الأيض، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص عند استخدامها في النظم التي تحول بين التمثيل الغذائي في الجهاز التنفسي وحال السكر للحفاظ على إمدادات ATP الخلوية هو النمط الظاهري النقدي، بما في ذلك توصيف الخلايا الجذعية والخلايا السرطانية المستمدة من الورم. وفهم التغيرات الأيضية التحكم في هذه وغيرها من السياقات تسمح بدرجة أكبر من التطور والدقة في التصميم والتحليل التجريبي لهذه الأنواع من الخلايا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pherastar FS	BMG	n/a	microplate reader
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	n/a	extracellular flux instrument
Seahorse XF assay plate	Seahorse Bioscience	V7-PS	consumable
XF Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	solution
HCl standard	Sigma	38280	chemical
oligomycin	Sigma	O4876	chemical
FCCP	Sigma	C2920	chemical
Rotenone	Sigma	R8875	chemical
Myxothiazol	Sigma	T5580	chemical
DMEM	Corning	10-013-CV	medium component
FBS	Corning	35-010-CV	medium component
penicillin/streptomycin	Corning	30-002-CI	medium component
carbonic anhydrase	Sigma	C2624	chemical
96-well assay plate	Corning	CLS3991	consumable
NAD+	Sigma	N7004	chemical
LDH	Sigma	L1254	chemical