JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Phosphoinositides محت الدهون التي تتغير بسرعة استجابة للمؤثرات المختلفة وفرة نسبية. توضح هذه المقالة طريقة لقياس وفرة phosphoinositides التي وصفها أيضي الخلايا مع 3 H- ميو -inositol، تليها استخراج وdeacylation. ثم يتم فصل استخراج glycero-inositides بواسطة عالية الأداء اللوني السائل وكميا بواسطة التلألؤ التدفق.

Abstract

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Introduction

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protocol

ملاحظة: يصف النص أدناه بالتفصيل طريقة لقياس PtdInsPs في الخميرة. لأنها توفر تفاصيل التجريبية لخلايا وضع العلامات الخميرة مع 3 H- ميو -inositol، واستخراج وdeacylating الدهون وبروتوكول HPLC-شطف إلى يجزئ وتحديد PtdInsPs deacylated. يرجى ملاحظة أن وضع العلامات، وdeacylation، القرار النوعي والكمي لPtdInsPs في خلايا الثدييات تتطلب التحسين وأطول ملامح HPLC-شطف. هذه التفاصيل يمكن العثور عليها في أي مكان آخر، على الرغم من أننا نناقش بعض الجوانب في مناقشة. وعموما، فإن منهجية لاستخراج الدهون، deacylate واستخراج للذوبان في الماء غرو-InsPs من تعطى الخميرة وهو موضح في الشكل 1.

1. بروتوكول لوصفها وتحليل PtdInsPs في الخميرة

  1. زراعة الخلايا وradiolabeling
    1. تنمو 20 مل ثقافة السائل من SEY6210 سلالة الخميرة في 30 درجة مئوية مع الهز المستمر في تركيبية كاملةوسائل الإعلام إلى مرحلة سجل منتصف أو الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من حوالي 0،6-0،7.
      ملاحظة: لا تستخدم وسائل الإعلام YPD لأن هذا قد يؤثر على 3 H- ميو -inositol التأسيس. يجب أن هذا الحجم ثقافة توفر مادة كافية لمدة 2-3 أشواط HPLC.
    2. بيليه ما مجموعه 10-14 OD من خلايا الخميرة (لاحظ أن 1 مل الثقافة مع OD 600 = 1 يحتوي ~ 1X10 7 الخلايا) بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق في 12 مل أنبوب الجولة القاع. و resuspend مع 2 مل خالية من إينوزيتول الوسائط (IFM) (انظر الجدول رقم 1 لتكوين IFM).
    3. كرر الطرد المركزي ونضح وسائل الإعلام. resuspend الكرية مع 440 ميكرولتر من IFM واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
    4. إضافة 60 ميكرولتر من 3 H- ميو -inositol (1 ميكرولتر = 1 μCi) لكل عينة ويحضن في درجة حرارة متزايدة من 30 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعة مع الهز المستمر.
      الحذر: 3 H- ميو -inositol هي رفيقة المشعالريال التي ينبغي التعامل معها بعد التدريب المناسب. بالإضافة إلى ذلك، جميع المواد الاستهلاكية التي تجعل الاتصال مع 3-H التي تحتوي على مواد يجب التخلص بشكل مناسب وتعيين كنفايات مشعة.
      ملاحظة: يمكن تغيير درجة حرارة النمو كما هو مطلوب طالما كل سلالات يمكن مقارنة تزرع في نفس درجة الحرارة.
    5. نقل تعليق الخلية (500 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 500 ميكرولتر من حمض البيركلوريك 9٪ و 200 ميكرولتر من حمض غسلها الخرز الزجاجي. مزيج من قبل قلب واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
    6. دوامة العينة في سرعة قصوى لمدة 10 دقيقة ونقل لست] إلى أنبوب microcentrifuge جديدة باستخدام طرف جل التحميل لتجنب الخرز الزجاجي.
    7. بيليه العينة في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونضح طاف.
    8. resuspend الكرية التي كتبها حمام صوتنة في 1 مل من الجليد الباردة 100 ملم EDTA. بيليه مرة أخرى كما كان من قبل.
  2. Deacylation واستخراج
  3. طازجة إعداد 5.0 مل من كاشف deacylation من خلال الجمع بين 2.3 مل من الميثانول، 1.3 مل من 40٪ ميثيل، 0.55 مل من 1-بيوتانول و0.80 مل من الماء. عكس إلى المزيج.
  4. نضح EDTA ويصوتن بيليه في 50 ميكرولتر من الماء.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من كاشف deacylation ويصوتن لخلط. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
  6. الدهون الحرارة لمدة 50 دقيقة في 53 درجة مئوية في كتلة الحرارة. تجفيف العينات تماما من فراغ الطرد المركزي أكثر من 3 ساعات أو O / N.
    1. تأكد من تركيب مصيدة الكيميائية بين فراغ الطرد المركزي ومضخة فراغ لمنع الأبخرة من دخول الهواء.
  7. resuspend الكرية مع 300 ميكرولتر من الماء عن طريق حمام صوتنة واحتضانها في RT لمدة 20 دقيقة. تجفيف العينات التي كتبها فراغ الطرد المركزي لمدة 3 ساعات أو O / N. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
  8. يصوتن بيليه مع 450 ميكرولتر من الماء. هذه هي المرحلة المائية أثناء الاستخراج.
  9. طازجة إعداد 10 مل من extractioن كاشف عن طريق إضافة 8.0 مل من 1-بيوتانول، 1.6 مل من الأثير إيثيل و 0.40 مل من اثيل فورمات. عكس إلى المزيج.
  10. إضافة 300 ميكرولتر من كاشف استخراج إلى المرحلة المائية. دوامة الخليط في سرعة قصوى لمدة 5 دقائق وفصل طبقات بواسطة الطرد المركزي في سرعة قصوى (18000 x ج) لمدة 2 دقيقة.
  11. جمع طبقة مائية أسفل في أنبوب microfuge جديدة مع تجنب الطبقة العليا العضوية، واجهة، وبيليه. كرر استخراج المرحلة المائية مرتين أكثر مع كاشف استخراج الطازجة.
  12. تماما تجف الطبقة المائية التي جمعتها فراغ الطرد المركزي. تفريق بيليه في 50 ميكرولتر من الماء عن طريق حمام صوتنة.
  13. إضافة 2 ميكرولتر من كل عينة إلى 4 مل من السائل التلألؤ في 6 مل البولي ايثيلين التلألؤ القارورة. تحديد عدد من التهم (في CPM) في كل عينة عن طريق التلألؤ السائل باستخدام نافذة مفتوحة.
  14. تخزين العينات في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للHPLC.
  • فصل3 H-glycero inositides من قبل HPLC
    1. إعداد العازلة A من خلال تصفية 1 لتر من الماء عالى النقاء مع زجاجة كبار مرشح 0.22 ميكرون فراغ، تليها التفريغ.
    2. إعداد العازلة B بجعل حل 1 لتر من 1 M فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة (APS، MW 132.06) في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 3.8 مع حمض الفوسفوريك. تصفية فوسفات الأمونيوم مع زجاجة كبار مرشح 0.22 ميكرون فراغ، تليها التفريغ.
    3. تجميع قنينة حقن عن طريق تجهيز 2 مل قارورة مع 250 ميكرولتر حجم صغير إدراج بنابض. تحميل 10 ملايين CPM وإضافة الماء لإجمالي حجم 55 ميكرولتر. إعداد قارورة فارغة مع 55 ميكرولتر من الماء.
    4. سقف قارورة مع قبعات المسمار تجهيزه مع حواجز PTFE / سيليكون (تواجه الجانب الأحمر داخل القارورة). وضع كل قارورة في صينية أخذ العينات السيارات من HPLC، بدءا من قارورة فارغة.
    5. استخدام HPLC والبرامج المرتبطة بها والتي تسيطر على تدفق العازلة، degasses مخازن والضوابط عينة injectiعلى. استخدام ماض تدفق الانترنت والبرامج المرتبطة به لتنظيم معدل التدفق scintillant ورصد إشارة 3 H-الاضمحلال.
      1. استخدام ساكس العمود اللوني السائل مع أبعاد 250 ملم × 4.6 ملم وتحتوي على 5 ميكرون الراتنج السيليكا في HPLC. تجهيز العمود مع حارس عمود لمنع حقن من الملوثات.
      2. تثبيت 3 H-متوافقة 500 ميكرولتر خلية تدفق في ماض التدفق.
        ويمكن أن يتم تجزئة مع نظام سلسلة لا نهاية HPLC اجيلنت 1200 التي تسيطر عليها البرنامج لل ChemStation أو مع غيرها من نظم HPLC المتاحة تجاريا: ملاحظة. ويمكن أن يتم التلألؤ تدفق شاطف HPLC مع ماض تدفق β-RAM التي تسيطر عليها البرنامج لورا أو ماض تدفق المتاحة تجاريا آخر أو برنامج متوافق.
    6. تهيئة المضخة الرباعية بمعدل تدفق 1.0 مل / دقيقة مع 100٪ عازلة A.
    7. إعداد ملف تعريف موازنة على HPLCللسيطرة على التدرج من المخازن A و B (نسمي هذا "البروتوكول موازنة"): 1٪ B الاحتياطي لمدة 5 دقائق، 1-100٪ B لمدة 5 دقائق، و 100٪ B لمدة 5 دقائق، 100-1٪ B لمدة 5 دقيقة، 1٪ B لمدة 20 دقيقة. تعيين الحد ضغط 400 بار، 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق، و 30 دقيقة وقت التشغيل.
    8. إعداد ملف تعريف شطف (الشكل 2) على HPLC للسيطرة على التدرج من المخازن A و B (نسمي هذا "البروتوكول A"): 1٪ B لمدة 5 دقائق، 1-20٪ B لمدة 40 دقيقة، 20-100٪ B لمدة 10 دقيقة، و 100٪ B لمدة 5 دقائق، 100-1٪ B لمدة 20 دقيقة، 1٪ B لمدة 10 دقيقة. تعيين الحد ضغط 400 بار، 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق، و 90 دقيقة وقت التشغيل.
    9. إعداد بروتوكول الكشف على ماض تدفق (نسمي هذا "البروتوكول كشف") لتشغيل لمدة 60 دقيقة، مع التلألؤ السائل معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة وزمن السكون 8.57 ثانية.
    10. برنامج تسلسل حقن الآلي على HPLC لتبدأ المياه فارغة على "بروتوكول A موازنة"، ثم عن طريق البريدمنظمة العمل ضد الجوع radiolabelled العينة على "البروتوكول". تهيئة تسلسل عندما تصبح جاهزة.
    11. في حين المدى لا يزال على بروتوكول موازنة، وخلق دفعة على ماض تدفق لقياس كل من العينات مع "بروتوكول A الكشف." فإن حقن كل عينة جديدة تهيئة "بروتوكول A" على HPLC في حين اثار على ماض تدفق لبدء "بروتوكول A الكشف."
    12. عند الانتهاء من جميع أشواط، تدفق HPLC، العمود وتدفق ماض مع 100٪ العازلة A لمدة 30 دقيقة في 1.0 مل / دقيقة معدل التدفق.
  • تحليل البيانات
    1. استخدام البرمجيات لورا أو أي برامج أخرى التي يمكن قياس أطياف اللوني. وصفت الخطوات الموضحة في هذا القسم في الشكل (3).
    2. فتح الملفات عن طريق النقر على "ملف"، "فتح"، وحدد ملف البيانات الخام لكل عينة.
    3. في "الاستشرابية" علامة التبويب، زويام في لتمتد كل واحدة من قمم أقل (حوالي 1000 التهم [المحور ص]) مع الإبقاء على قرار الوقت. التكبير في كل قمة الفردية إذا لزم الأمر.
    4. تسليط الضوء على كل من قمم للتحليل باستخدام "إضافة ROI" أداة. تحديد القمم التي كتبها وقت شطف: الأبوية غرو الإضافية في 10 دقيقة، وغرو-Ins3P في 18 دقيقة، وغرو-Ins4P في 20 دقيقة، وغرو الإضافية (3،5) P 2 في 29 دقيقة، وغرو الإضافية (4،5 ) P 2 في 32 دقيقة.
    5. في "المناطق الجداول" علامة التبويب، تسجيل "منطقة (التهم)" كل الذروة. لاحظ "بدء (MM: SS)" مرة و "النهاية (MM: SS)" الوقت من كل الذروة.
    6. لالطرح الخلفية، تسليط الضوء على المنطقة المحاذية للالذروة التي تمتد على نفس المقدار من الوقت. طرح عدد من التهم من ذروة المقابلة.
    7. تطبيع مساحة كل ذروة ضد الأبوية غرو الإضافية (التعبير عن "٪ من إجمالي PtdIns"). ثم، وتطبيع كل من قمم في كل حالة تجريبية ضد حالة التحكم (معبرا عنها "نزيادة أضعاف مقارنة للسيطرة على ").
      ملاحظة: يمكن أيضا تطبيع كل قمة أن يتم مقابل مجموع التهم ولكن منذ الأبوية غرو الإضافية هو أكثر وفرة من كل PtdInsPs البعض النتائج تميل إلى أن تكون مماثلة.
    8. تصدير البيانات لتحليل اللون عن طريق الضغط على "ملف"، "حفظ باسم ..."، ثم اختر "CSV (مفصولة بفواصل)" تنسيق الملف. رسم البيانات في جدول وتقديم الضرورة.

    • النتائج

    باستخدام هذا الأسلوب، وصفت PtdInsPs الخميرة عملية الأيض مع 3 H- ميو -inositol. بعد وضع العلامات، وعجلت الدهون الفوسفاتية مع حمض البيركلوريك، تليها deacylation فوسفورية واستخراج غرو-InsPs للذوبان في الماء (الشكل 1). في هذه المرحلة، فمن الأهمية بمكا...

    Discussion

    تفاصيل هذه المقالة بروتوكول تجريبي اللازمة لقياس مستويات الخلايا من PtdnsPs كل جانب HPLC تدفق التلألؤ من الخميرة. منهجية تمكن من وضع العلامات الأيضية من PtdInsPs مع 3 H- ميو -inositol، تليها معالجة الدهون واستخراج للذوبان في الماء 3 H-غرو-InsPs، تجزئة HPLC والتحليل. باست?...

    Disclosures

    The authors declare that they have no competing financial interests.

    Acknowledgements

    C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
    Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
    Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
    AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
    BiotinSigmaB4501
    Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
    Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
    Calcium pantothenateSigmaC8731
    Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
    D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
    Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
    Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
    EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
    Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
    Ethyl formateSigma112682Reagent grade
    Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
    Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
    FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
    Folic acidBiobasicFB0466USP grade
    HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
    Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
    Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
    Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
    Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
    L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
    Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
    Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
    MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
    Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
    Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
    Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
    OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
    p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
    Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
    Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
    PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
    Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
    Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
    Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
    Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
    Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
    RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
    Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
    Sodium molybdateSigma243655
    Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
    Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
    Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
    Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
    β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

    References

    1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
    2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
    3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
    4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
    5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
    6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, (2014).
    7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
    8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
    9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
    10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
    11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
    12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
    13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
    14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
    15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
    16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
    17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
    18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
    19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
    20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
    21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
    22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
    23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
    24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
    25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
    26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
    27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
    28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
    29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
    30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
    31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
    32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
    33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
    34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
    35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
    36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
    37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
    38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
    39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
    40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
    41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
    42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
    43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    107 Phosphoinositides radiolabeling

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved