JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Özet

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Giriş

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protokol

Not: Metin aşağıda ayrıntılı olarak mayada PtdInsPs ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Bu etiketleme maya 3 H myo -inositol ile hücrelerin ayıklanması ve deacylating lipit ve damıtmak ve asillendirilmemiş PtdInsPs ölçmek için HPLC-elüsyon protokolü için deneysel ayrıntıları sağlar. Optimizasyonu ve uzun HPLC-elüsyon profilleri gerektiren memeli hücrelerinde PtdInsPs bu etiketleme, deasılasyonunu, çözünürlük ve miktarının unutmayınız. Biz Tartışma yönlerini bazı tartışmak rağmen bu detaylar, başka bir yerde bulunabilir. Genel olarak, yöntem yağ, deasilize özü ve maya verilmiş ve Şekil 1 'de gösterilmiş olup, suda çözünür Gro-InsPs çıkartma özelliğine sahiptir.

Maya Etiketleme ve Analiz PtdInsPs 1. Protokol

  1. Hücre kültürü ve Radyoetiketleme
    1. Sabit tam bir sentetik içinde sallanarak 30 ° C 'de, maya soyu SEY6210 bir 20 ml sıvı kültür büyütünorta log fazı veya yaklaşık 0.6-0.7, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar ortam.
      Not: Bu 3 H myo -inositol dahil edilmesini etkileyebilir olarak YPD ortamları kullanmayın. Bu kültür boyutu 2-3 HPLC çalışmaları için yeterli malzeme temin etmelidir.
    2. Maya hücrelerinin 10-14 OD toplam pelet 12 ml 5 dakika yuvarlak tabanlı tüp 800 x g'de santrifüj ile (OD 600 = 1 olan 1 ml kültür ~ 1x10 7 hücreleri ihtiva etmesi gerekir). Inositolsüz ortama (IFM) 2 ml yeniden süspanse edin (IFM bileşim için tablo 1 e bakınız).
    3. Santrifüj tekrarlayın ve medya aspire. IFM 440 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    4. Her bir örnek için 3 H, miyo -inositol (1 ul = 1 uCi) 60 ul ekle ve sürekli çalkalanarak 1 ila 3 saat boyunca 30 ° C'de artan sıcaklığında inkübe edin.
      Dikkat: 3 H myo -inositol radyoaktif bir arkadaşıUygun eğitimden sonra ele alınmalıdır riyali. Buna ek olarak, 3H-içeren malzeme ile temas tüm sarf uygun şekilde atılmalıdır ve radyoaktif atık madde olarak belirlenmiş.
      Not: büyüme sıcaklığı değiştirilebilir olduğu sürece, tüm suşlar aynı sıcaklıkta büyütülür karşılaştırılabilir şekilde gerektiği gibi.
    5. % 9 perklorik asit 500 ul ve asit 200 ul içeren bir mikrosantrifüj tüp hücre süspansiyonu (500 ul) aktarın cam boncuk yıkanır. Ters çevirme ile karıştırın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
    6. 10 dakika boyunca en yüksek hızda örnek Vortex ve cam boncuk önlemek için bir jel yükleme ucunu kullanarak yeni bir mikrosantrifüj tüpüne lizatları aktarın.
    7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de örnek Pelet ve süpernatan aspire.
    8. Buz soğukluğunda 100 mM EDTA, 1 ml banyo sonikasyon ile pelletini. Daha önce olduğu gibi yine pelet.
  2. Deaçillendirme ve çıkarma
    1. Taze 2,3 ml metanol, 40% metilamin 1,3 mi, 1-butanol 0.55 ml su, 0.80 ml birleştirerek deasilasyon reaktifi 5,0 ml hazırlar. Karıştırmak için ters çevirin.
    2. EDTA aspire su 50 ul pelet sonikasyon.
    3. Deasilasyon reaktif 500 ul ekleyin ve karıştırın ses dalgalarına maruz. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. Isı bloğu 53 ° C'de 50 dakika boyunca ısı lipidleri bulunmaktadır. 3 saat ya da O / N üzerinde vakum santrifüj tamamen örnekleri kurulayın.
      1. Kimyasal tuzak vakum santrifüj ve havanın girmesini buharları engellemek için vakum pompası arasına yüklü olduğundan emin olun.
    5. Banyo sonikasyon ile suyun 300 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 3 saat ya da O / N vakum santrifüj örnekleri kurulayın. Bir kez daha bu adımı yineleyin.
    6. Su 450 ul ile pelet sonikasyon. Bu ekstraksiyon sırasında sulu bir fazdır.
    7. Taze extractio 10 ml hazırlamak8,0 etil eter 1-bütanol ml, 1.6 ml etil format içinde 0,40 ml ekleyerek n reajanı. Karıştırmak için ters çevirin.
    8. Sulu faza ekstre edici reaktif 300 ul ekle. Vorteks 5 dakika boyunca en yüksek hızda karışım, ve 2 dakika boyunca en yüksek hızda (18,000 xg) santrifüj ile tabakalar ayrılır.
    9. Üst organik katman, arayüz ve pelet kaçınarak yeni bir mikrofüj tüpü içine alttaki sulu tabakayı toplayın. Taze bir ekstraksiyon reaktifi ile, iki kez daha sulu fazın ekstraksiyonu tekrarlayın.
    10. Tamamen vakum santrifüj ile toplanır, sulu tabaka kurutulur. Banyo sonikasyon ile su 50 ul pelet dağıtılır.
    11. Bir 6 ml polietilen parıldamalı cam şişe içine sintilasyon sıvısı 4 ml Her numunenin 2 ul ekleyin. Açık bir pencere kullanılarak sıvı titreşimi ile her bir numunede (CPM olarak) sayımının sayısını belirler.
    12. HPLC için hazır olana kadar -20 ° C'de örnekleri saklayın.
  3. AyırmaHPLC ile 3 'H-glisero-inositides
    1. Gaz alma, ardından bir şişe en 0,22 um vakum filtresi ile ultra saf su 1 L filtre edilerek A tamponu hazırlayın.
    2. Su içinde 1 M amonyum fosfat dibazik (APS, MW 132,06) içindeki bir 1 L çözelti yaparak tampon B hazırlayın ve fosforik asit ile 3.8 pH ayarlamak. Gaz alma tarafından izlenen bir şişe üst 0.22 mikron vakum filtresi ile amonyum fosfat Filtre.
    3. Yaylı 250 ul küçük hacimli eki Şişeyi ml bir 2 donatım enjeksiyon flakon birleştirin. 10000000 'yi yükleyin ve 55 ul toplam hacim su ilave edilir. Su 55 ul boş şişe hazırlayın.
    4. PTFE / silikon septa ile donatılmış vidalı kapaklı şişeleri (kırmızı yan şişenin içine bakan) Cap. Boş flakon ile başlayan HPLC otomatik örnekleme tepsiye her flakon yerleştirin.
    5. Tampon akışını kontrol tamponlar ve kontroller numune Injecti gazı giderildi bir HPLC ve ilgili yazılımını kullanınüzerinde. Scintillant akış hızını düzenleyen bir çevrimiçi akış sintilatör ve ilişkili yazılımı kullanın ve 3 H-çürüme sinyalini izlemek için.
      1. 250 mm x 4,6 mm boyutlarında ve HPLC 5 um silika reçine ihtiva eden bir SAX sıvı kromatografi sütunu kullanın. Kirleticilerin enjeksiyon önlemek için bir sütun bekçi ile sütun kıyafeti.
      2. Akış sintilatör bir 3 'H-uyumlu bir 500 ul akış hücresi takın.
        Not: Fraksiyonasyon Chemstation yazılımı ile ya da başka ticari olarak temin edilebilir HPLC sistemi ile kontrol edilen bir Agilent 1200 serisi HPLC sistemi sonsuz ile yapılabilir. HPLC yıkama sıvısı akışı sintilasyon Laura yazılım veya başka bir ticari olarak kullanılabilir akış sintilatör veya uyumlu yazılımı tarafından kontrol edilen bir β-RAM akış sintilatör ile yapılabilir.
    6. % 100 tampon A ile 1.0 ml / dk'lık bir akış oranında, kuaterner pompa başlatma
    7. HPLC bir dengeleme profili kurmak5 için 5 dakika, 100-1% B için 5 dakika,% 100 B için 5 dakika, 1-100% B% 1 Tampon B: Tampon A ve B degrade ("A dengeleme Protokolü" diyorlar) kontrol etmek için dk, 20 dakika boyunca,% 1 B. 400 bar, 1.0 ml / dk bir akış oranında, 30 dakika çalışma süresi basınç limiti ayarlayın.
    8. Tamponlar A ve B degrade (bu "Protokol A" diyoruz) kontrol etmek için HPLC üzerinde bir elüsyon profili (Şekil 2) ayarlayın: 40 dakika 5 dakika,% 1-20 B için% 1 B,% 20-100 10 dakika boyunca 20 dakikada, 1% B 5 dakika,% B 100-1 10 dakika% 100 B B. 400 bar, 1.0 ml / dk bir akış oranında, 90 dakika çalışma süresi basınç limiti ayarlayın.
    9. Akış sintilatör bir algılama protokol 2.5 ml / dk'lık bir akış oranında sintilasyon sıvısı ve 8,57 saniye bekleme süresi ile, 60 dakika boyunca çalışması için (bu "Protokolü bir tarama" olarak adlandırır) ayarlayın.
    10. E, ardından su boş "Protokolün Bir denge" ile başlayan HPLC üzerinde otomatik bir enjeksiyon dizisi Programıach "Protokol A" konulu örneği radiolabelled. Hazır olduğunuzda dizisi başlatılamıyor.
    11. Çalışma dengeleme protokolü hala iken, numunelerin ölçmek için akış sintilatöre bir toplu oluşturmak "Protokolün A algılama." Başlamak için akış sintilatör tetikleme yaparken her yeni numune enjeksiyon HPLC "Protokol A" başlatmak olacaktır "Bir algılama Protokolü."
    12. Bütün çalışmalarda tamamlanmasından sonra, HPLC, kolon temizleme ve 1.0 ml / dk bir akış oranında 30 dakika boyunca% 100 Tampon A ile sintilatör akar.
  4. Veri analizi
    1. Laura yazılımı veya kromatografi spektrumları ölçmek için başka bir yazılım kullanın. Bu bölümde tarif edilen adım, Şekil 3 'de gösterilmiştir.
    2. "Dosya", "Aç" tıklayarak dosyaları açmak ve her numune için ham veri dosyasını seçin.
    3. "Kromatogramları" sekmesinde, zoom de daha az zirveleri (1000 sayımı [y ekseni]) saat çözünürlüğü koruyarak her germek için. Gerekirse, her bir zirve içine büyüt.
    4. "Yatırım getirisi Ekle" aracını kullanarak analiz zirvelerin her vurgulayın. (4,5 29 dakika ile 20 dakika, Gro-Ins (3,5) P 2 18 dakika, Gro-Ins4P 10 dakika, Gro-Ins3P de Ebeveyn Gro-ins ve Gro-In: elüsyon zaman doruklarına tespit 32 dk) P 2.
    5. "Bölgeler tabloları" sekmesinde, her tepe "alanına (sayar)" kaydedin. Zamanı ve "end (mm: ss)" Her tepe zamanı: "(ss mm) başlatın" unutmayın.
    6. Arka plan çıkarma için aynı süreyi kapsayan zirveye bitişik bir bölge vurgulayın. Karşılık gelen tepe noktasından sayıyı çıkarın.
    7. ("Toplam PtdIns% 'si" olarak ifade edilen) ebeveyn Gro-Ins karşı her tepe alanını Normale. Ardından, "n olarak ifade kontrolü duruma karşı her deneysel koşul (piklerin her normalleştirmekkat artış) "kontrol grubuna göre.
      Not: her bir tepe noktasının normalizasyonu aynı zamanda toplam sayısı ile de yapılabilir, ancak ebeveyn Gro-Ins çok daha bol diğer PtdInsPs daha çünkü benzer sonuçlar elde olma eğilimindedir.
    8. "... Olarak kaydet", "Dosya" düğmesine basarak kromatografları için veri ihracat ve tercih dosya biçimi "CSV (virgülle ayrılmış)". Bir tablo üzerinde veri arsa ve gerektiğinde sunuyoruz.

Sonuçlar

Bu yöntemi kullanarak, maya PtdInsPs metabolik 3H-miyo -inositol ile etiketlenmiştir. Etiketlemeden sonra, fosfolipid fosfolipid Deaçillendirme ve suda çözülebilen Gro-InsPs (Şekil 1) ekstre, perklorik asit ile çöktürülmüştür. Bu aşamada, bu PtdIns gibi, çok düşük yoğunluklu PtdInsPs için yeterli bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için sıvı skintilasyonu ile ekstre Gro-InsPs ile ilişkili toplam radyoaktif sinyal ölçmek i...

Tartışmalar

Bu makale mayadan HPLC-birleştiğinde akış skintilasyonu ile PtdnsPs hücresel seviyelerini ölçmek için gerekli olan deneysel protokol ayrıntıları. Yöntem, lipid işleme ve suda-çözünür, 3H-Gro-InsPs, HPLC ile ayrılması ve analiz ekstre 3H-miyo -inositol sahip PtdInsPs, metabolik etiketleme sağlar. PtdIns (3,5), yabani tip, vac14 D ve D atg18 Maya hücreleri (Şekil 4) 'de p 2 için gösterildiği gibi, bu yöntem kullanıl...

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Referanslar

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

KimyaSay 107Fosfoinosititlerlipidlermembran ka ak lak sintilasyonsinyal iletimiRadyoetiketlemes v kromatografisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır