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  • Résumé
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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Phosphoinositides sont des lipides dont l'abondance relative change rapidement en réponse à divers stimuli de signalisation. Cet article décrit une méthode pour mesurer l'abondance des phosphoinositides par les cellules métaboliquement étiquetage avec 3 H- myo-inositol, suivie par l'extraction et la désacylation. Glycéro-inositides extraites sont ensuite séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance et quantifiés par scintillation de flux.

Résumé

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Introduction

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protocole

Note: Le texte ci-dessous décrit en détail une méthode pour mesurer PtdInsPs dans la levure. Il fournit les détails expérimentaux pour les cellules d'étiquetage de levure avec 3 H- myo-inositol, l'extraction et désacylante lipides et un protocole HPLC-élution de fractionner et de quantifier PtdInsPs désacylés. S'il vous plaît noter que l'étiquetage, la désacylation, la résolution et la quantification des PtdInsPs dans des cellules mammifères exiger optimisation et profils plus longs HPLC-élution. Ces détails peuvent être trouvés ailleurs, si nous discuter de certains des aspects à la discussion. Dans l'ensemble, la méthode pour extraire les lipides, désacyler et extrait soluble dans l'eau le Gro-InsPs de levure est donnée et est illustré sur la figure 1.

1. Protocole pour l'étiquetage et Analyse PtdInsPs dans la levure

  1. Culture cellulaire et radiomarquage
    1. Cultiver un 20 ml culture liquide de la souche de levure SEY6210 à 30 ° C avec agitation constante en synthétique completles médias à la phase mi-log ou une densité optique à 600 nm (DO600) d'environ 0,6-0,7.
      Note: Ne pas utiliser les médias YPD car cela peut affecter 3 H- myo-inositol incorporation. Cette taille de la culture devrait fournir suffisamment de matériel pour 2-3 HPLC pistes.
    2. Pellet un total de 10 à 14 DO des cellules de levure (à noter que 1 ml de culture avec une OD 600 = ~ 1 contient 1x10 7 cellules) par centrifugation à 800 xg pendant 5 min dans un tube de 12 ml à fond rond. Remettre en suspension avec 2 ml de milieu sans inositol (IFM) (voir le tableau 1 pour la composition IFM).
    3. Répétez centrifugation et aspirer les médias. Reprendre le culot avec 440 ul d'IFM et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    4. Ajouter 60 ul de myo-inositol 3 H- (1 pi = 1 uCi) à chaque échantillon et incuber à la température croissante de 30 ° C pendant 1 à 3 heures avec une agitation constante.
      Attention: 3 H- myo-inositol est une matière radioactiverial qui doit être manipulé après une formation appropriée. En outre, tous les consommables qui font contact avec un matériau contenant 3 H-doivent être éliminés de manière appropriée et désignés comme des déchets radioactifs.
      Note: La température de croissance peut être changé selon les besoins, tant que toutes les souches à comparer sont cultivés à la même température.
    5. Transférer la suspension cellulaire (500 ul) à un tube de microcentrifugation contenant 500 pi d'acide perchlorique à 9% et 200 ul d'acide lavé les billes de verre. Mélanger par inversion et on incube sur de la glace pendant 5 min.
    6. Vortex de l'échantillon à la vitesse supérieure pendant 10 min et transférer les lysats à un nouveau tube en utilisant une pointe de gel de chargement pour éviter les perles de verre.
    7. Pellet l'échantillon à 12 000 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
    8. Reprendre le culot par bain sonication dans 1 ml de glace froid 100 mM d'EDTA. Pellet de nouveau comme précédemment.
  2. Désacylation et l'extraction
    1. Fraîchement préparer 5,0 ml du réactif de désacylation en combinant 2,3 ml de methanol, 1,3 ml de méthylamine à 40%, 0,55 ml de 1-butanol et 0,80 ml d'eau. Inversez pour mélanger.
    2. Aspirer le EDTA et sonication du culot dans 50 ul d'eau.
    3. Ajouter 500 pi de réactif de désacylation et soniquer pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
    4. Les lipides de la chaleur pendant 50 minutes à 53 ° C dans un bloc chauffant. Sécher les échantillons complètement par centrifugation à vide de plus de 3 h ou O / N.
      1. Assurez-vous que le piège chimique est installé entre la centrifugeuse sous vide et la pompe à vide pour empêcher les vapeurs d'entrer dans l'air.
    5. Reprendre le culot avec 300 pi d'eau par bain sonication et incubation à température ambiante pendant 20 min. Sécher les échantillons par centrifugation sous vide pendant 3 heures ou O / N. Répétez cette étape une fois de plus.
    6. Soniquer le culot avec 450 pi d'eau. Ceci est la phase aqueuse lors de l'extraction.
    7. Fraîchement préparer 10 ml de la extraction aun réactif par addition de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml d'éther éthylique et 0,40 ml de formiate d'éthyle. Inversez pour mélanger.
    8. Ajouter 300 ul de réactif d'extraction de la phase aqueuse. Vortex le mélange à la vitesse supérieure pendant 5 min et séparer les couches par centrifugation à la vitesse supérieure (18.000 xg) pendant 2 min.
    9. Recueillir la phase aqueuse inférieure dans un nouveau tube de centrifugeuse, tout en évitant la couche supérieure organique, l'interface, et le culot. Répéter l'extraction de la phase aqueuse encore deux fois avec le réactif d'extraction frais.
    10. Complètement sécher la couche aqueuse recueillie par centrifugation sous vide. Disperser le culot dans 50 ul d'eau par bain sonication.
    11. Ajouter 2 ul de chaque échantillon de 4 ml de liquide de scintillation dans un flacon à scintillation de 6 ml de polyéthylène. Déterminer le nombre de comptes (en cpm) dans chaque échantillon par scintillation liquide en utilisant une fenêtre ouverte.
    12. Conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'au moment de l'HPLC.
  3. Séparation de3 H-glycéro-inositides par HPLC
    1. Préparer le tampon A en filtrant 1 L d'eau ultra-pure avec une bouteille couvre-filtre de 0,22 pm sous vide, suivie d'un dégazage.
    2. Préparer tampon B en faisant une solution à 1 L de 1 M phosphate d'ammonium dibasique (APS, MW 132.06) dans l'eau et ajuster le pH à 3,8 avec de l'acide phosphorique. Filtrer le phosphate d'ammonium avec une bouteille haut de filtre de 0,22 um à vide, suivie par dégazage.
    3. Assemblez le flacon d'injection en équipant un flacon de 2 ml avec un petit volume 250 pi insert à ressort. Chargez 10 millions de CPM et ajouter de l'eau pour un volume total de 55 pi. Préparer un flacon vide avec 55 pi d'eau.
    4. Boucher les flacons avec bouchons à vis équipé d'un septum PTFE / silicone (côté rouge face à l'intérieur du flacon). Placez chaque flacon dans la barre d'auto-échantillonnage de l'HPLC, en commençant avec le flacon vide.
    5. Utilisez une HPLC et le logiciel associé qui contrôle le flux de tampon, les tampons et les contrôles dégaze échantillon INJECTIsur. Utilisez un scintillateur de flux en ligne et son logiciel associé pour réguler le débit scintillant et de surveiller le signal 3 H-dentaire.
      1. Utiliser une colonne de chromatographie liquide SAX avec des dimensions de 250 mm x 4,6 mm et contenant de 5 um dans la résine de la silice HPLC. Équipez la colonne avec un garde de la colonne pour éviter l'injection de contaminants.
      2. Installation d'une cellule d'écoulement 500 ul de 3H-compatible dans le scintillateur de l'écoulement.
        NOTE: Le fractionnement peut être effectué avec une série de système HPLC Agilent infinité de 1200 commandé par un logiciel ChemStation ou avec d'autres systèmes HPLC disponibles dans le commerce. Flux de scintillation de l'éluant de CLHP peut être fait avec un débit scintillateur β-RAM commandé par le logiciel ou un autre scintillateur Laura d'écoulement disponibles dans le commerce ou un logiciel compatible.
    6. Initialiser la pompe quaternaire à un débit de 1,0 ml / min avec 100% de tampon A.
    7. Définir un profil d'équilibrage sur la HPLCpour contrôler le gradient de tampons A et B (appelons cela "Protocole Un équilibrage"): 1% de tampon B pendant 5 min, 1-100% de B pendant 5 min, 100% de B pendant 5 min, 100-1% de B pendant 5 min, 1% de B pendant 20 min. Régler la limite de pression à 400 bars, 1,0 ml / débit min, et 30 min le temps d'exécution.
    8. Définir un profil d'élution (figure 2) sur la HPLC pour contrôler le gradient de tampons A et B (appelons cela "Protocole A"): 1% de B pendant 5 min, 1-20% de B pendant 40 min, 20-100% B pendant 10 min, 100% de B pendant 5 min, 100-1% de B pendant 20 min, 1% de B pendant 10 min. Régler la limite de pression à 400 bars, 1,0 ml / débit min, et 90 min le temps d'exécution.
    9. Mettre en place un protocole de détection sur le scintillateur de flux (appeler cette "Un protocole de détection") de fonctionner pendant 60 minutes, avec un taux d'écoulement de fluide de scintillation de 2,5 ml / min et un temps de séjour 8.57 sec.
    10. Programmer une séquence d'injection automatisée sur la HPLC pour commencer l'ébauche de l'eau sur le thème "Un protocole d'équilibrage", suivi par ehaque radiomarqué échantillon sur "Protocole A". Initialisation de la séquence lorsque vous êtes prêt.
    11. Alors que la marche est toujours sur le protocole d'équilibrage, créer un lot sur ​​le scintillateur de flux pour mesurer tous les échantillons avec "Un protocole de détection." L'injection de chaque nouvel échantillon va initialiser la "Protocole A" sur la HPLC tout en déclenchant le scintillateur de débit pour commencer "Un protocole de détection."
    12. À la fin de toutes les courses, rincer la HPLC, la colonne et le débit scintillateur avec 100% de tampon A pendant 30 min à 1,0 ml / débit min.
  4. L'analyse des données
    1. Utilisez un logiciel Laura ou tout autre logiciel qui permet de quantifier les spectres de chromatographie. Les étapes décrites dans cette section sont illustrés dans la Figure 3.
    2. Ouvrez les fichiers en cliquant sur "Fichier", "Ouvrir", et sélectionnez le fichier de données brutes pour chaque échantillon.
    3. Dans l'onglet "chromatogrammes", zoOM pour étirer chacun des pics moindres (environ 1000 chefs d'accusation [axe y]) tout en conservant la résolution de temps. Zoomez sur chaque pic individuelle si nécessaire.
    4. Mettez en surbrillance chacun des pics pour l'analyse en utilisant la fonction "Ajouter ROI". Identifier les pics par le temps d'élution: Parental Gro-Ins à 10 min, Gro-Ins3P à 18 min, Gro-Ins4P à 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 à 29 min et Gro-Ins (4,5 ) P 2 à 32 min.
    5. Dans l'onglet "tables des régions", enregistrer la "zone (chiffres)" de chaque pic. Notez le "commencer (mm: ss)" temps et «fin (mm: ss)" temps de chaque pic.
    6. Pour la soustraction du fond, mettre en évidence une région adjacente à la pointe couvrant la même quantité de temps. Soustraire le nombre de coups de pic correspondant.
    7. Normaliser l'aire de chaque pic contre parentale Gro-Ins (exprimé en "% de Ptdlns totales"). Ensuite, normaliser chacun des pics dans chaque condition expérimentale contre la condition de commande (exprimée en "n-fold augmentation par rapport à contrôler »).
      NOTE: La normalisation de chaque pic peut également être fait contre les coups totaux, mais depuis le parentale Gro-Ins est beaucoup plus abondante que tous les autres PtdInsPs les résultats ont tendance à être similaires.
    8. Exporter les données pour les chromatographes en appuyant sur "Fichier", "Enregistrer sous ...", et choisissez le "CSV (Comma Separated)" format de fichier. Tracer les données sur une feuille de calcul et de présenter, si nécessaire.

Résultats

En utilisant cette méthode, PtdInsPs de levure ont été marquées métaboliquement avec 3 H- myo-inositol. Après marquage, les phospholipides ont été précipités avec de l'acide perchlorique, suivie d'une désacylation phospholipide et l'extraction de la Gro-InsPs soluble dans l'eau (figure 1). A ce stade, il est important de quantifier le signal radioactif total associé avec le Gro-InsPs extraite par scintillation liquide pour ...

Discussion

Cet article détaille le protocole expérimental nécessaire de quantifier les niveaux cellulaires de PtdnsPs par flux scintillation HPLC couplé à de la levure. La méthodologie permet au marquage métabolique avec de PtdInsPs myo-inositol 3 H-, suivi par un traitement d'extraction des lipides et de 3 H-Gro-InsPs, CLHP et fractionnement analyse soluble dans l'eau. En utilisant cette méthode, les niveaux relatifs de PtdInsPs dans les cellules dans diverses conditions peuvent êtr...

Déclarations de divulgation

The authors declare that they have no competing financial interests.

Remerciements

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Références

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