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요약

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

초록

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

서문

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

프로토콜

주 : 텍스트가 아래에서 상세히 효모 PtdInsPs을 측정하는 방법을 설명한다. 이 라벨 효모 3 H-의 미오의 -inositol와 세포 추출 및 deacylating 지질과 분별과 탈아 실화 PtdInsPs을 정량화 할 수있는 HPLC-용출 프로토콜에 대한 실험 세부 정보를 제공합니다. 최적화 및 이상 HPLC-용출 프로파일을 요구하는 포유 동물 세포에서 PtdInsPs의 라벨, 탈아 실화, 해상도 및 정량을 유의하시기 바랍니다. 우리가 토론에서 측면의 일부를 설명하지만이 정보는 다른 곳에서 찾아 볼 수있다. 전반적으로, 방법은 지질, deacylate를 추출 효모가 주어진 그림 1에 도시에서 수용성 촉진제-InsPs를 추출합니다.

효모의 레이블과을 분석 PtdInsPs 1. 프로토콜

  1. 세포 배양 및 방사성 표지
    1. 상수가 완료 합성에서 진탕하면서 30 ℃에서 효모 균주 SEY6210 20 ㎖의 배양액을 성장미드 로그 상 또는 약 600 nm의 0.6-0.7 (OD 600)에서의 광학 밀도 매체.
      참고 :이 3 H-미오 -inositol 통합에 영향을 미칠 수 있으므로 YPD 매체를 사용하지 마십시오. 이 배양은 2-3 크기 HPLC 실행을위한 충분한 재료를 제공한다.
    2. 효모 세포의 10-14 OD 총 펠렛 (12) 용액에 5 분 둥근 바닥 튜브 800 XG에서 원심 분리하여 (OD 600 = 1 1 ml의 문화 ~ 1 × 7 세포가 포함되어 있습니다). 이노시톨없는 배지 (IFM) 2 ㎖로 재현 탁 (IFM 조성물은 표 1 참조).
    3. 원심 분리를 반복하고 미디어를 대기음. IFM 440 μL와 펠렛을 재현 탁하고, 15 분 동안 실온에서 배양한다.
    4. 각 샘플에 3 H- 미오 -inositol (1 μL = 1 μCi를) 60 μl를 추가하고 일정한 흔들림과 1 시간 3 30 ° C의 성장 온도에서 품어.
      주의 : 3 H-의 미오의 -inositol는 방사성 친구입니다적절한 훈련 후 처리해야 리알. 또한, 3 H - 함유 물질과 접촉을 만드는 모든 소모품 적절히 배치되어야하고, 방사성 폐기물로 지정.
      주 : 성장 온도가 변경 될 수있는 한 모든 균주는 동일한 온도에서 성장된다 비교되는 바와 같이 필요에 따라.
    5. 9 % 과염소산 500 μL 및 산 200 μL를 함유하는 미세 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 (500 μL)를 이동시켜 유리 비드를 세척 하였다. 반전에 의해 혼합하고 5 분 동안 얼음에 품어.
    6. 10 분 동안 최고 속도로 샘플을 와동과 유리 비드를 피할 겔 로딩 팁을 사용하여 새로운 마이크로 원심 튜브에 해물을 전송.
    7. 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 펠렛과 뜨는을 대기음.
    8. 빙냉 100 mM의 EDTA 1 ㎖ 목욕 초음파에 의해 펠렛을 재현 탁. 이전처럼 다시 펠렛.
  2. 탈아 실화 및 추출
    1. 갓 2.3 ml의 메탄올, 40 % 메틸 아민 1.3 ㎖, 1- 부탄올 0.55 mL 및 물 0.80 mL를 조합함으로써 탈아 실화 시약 5.0 mL로 제조. 혼합 반전.
    2. EDTA를 대기음 및 물 50 μL에 펠렛을 초음파 처리.
    3. 탈아 실화 시약 500 μL를 추가하고 혼합 초음파 처리. 20 분 동안 실온에서 배양한다.
    4. 열 블록에 53 ° C에서 50 분 동안 열 지질. 3 시간 또는 O / N을 통해 진공 원심 분리하여 완전히 샘플을 건조시킵니다.
      1. 화학 트랩 진공 원심 분리기와 공기를 유입하여 증기의 발생을 방지하기 위해 진공 펌프 사이에 설치되어 있는지 확인합니다.
    5. 욕조 초음파에 의해 물 300 μL와 펠렛을 재현 탁하고 20 분 동안 RT에서 배양한다. 3 시간 또는 O / N 진공 원심 분리하여 샘플을 건조시킵니다. 다시 한 번이 단계를 반복합니다.
    6. 물 450 μL와 펠렛을 sonicate하세요. 이는 추출 동안 성상이다.
    7. 갓 extractio 10 ㎖를 준비8.0 에틸 에테르의 1- 부탄올 용액, 1.6 ㎖의 에틸 포르 메이트 0.40 ml를 첨가하여 N 시약. 혼합 반전.
    8. 수성 단계로 추출 시약 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 5 분 최고 속도의 혼합물을 2 분 동안 최고 속도 (18,000 XG)에서 원심 분리하여 층을 분리한다.
    9. 상부 유기 층, 인터페이스 및 펠렛을 회피하면서 새로운 미세 원심 분리 튜브에 하부 수성층을 모은다. 신선한 추출 시약 회 더 성상의 추출을 반복한다.
    10. 완전 진공 원심 분리에 의해 수층을 회수 건조​​. 목욕 초음파로 물 50 μL에 펠렛을 분산.
    11. 6 ml의 폴리에틸렌 섬광 유리 병에 섬광 유체의 4 ml의 각 샘플 2 μl를 추가합니다. 열려있는 창을 사용하여 액체 섬광하여 각 샘플 (CPM)에 카운트의 수를 결정합니다.
    12. HPLC에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 샘플을 저장합니다.
  3. 의 분리HPLC에 의해 3 H 글리세로 inositides
    1. 탈기 하였다 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터, 초순수로 1 L를 필터링하여 버퍼를 준비한다.
    2. 물에 1 M 암모늄 인산 (APS, MW 132.06) 1 L의 용액을 완충액 B로 준비 및 인산으로 3.8까지 pH를 조정한다. 탈기 하였다 병 상단 0.22 ㎛의 진공 필터와 인산 암모늄 필터.
    3. 스프링이 장착 된 250 μL 작은 볼륨 삽입과 유리 병 ㎖로 2 여비에 의해 주입 병을 조립합니다. 1000 만 노출 당 비용 (CPM)를 넣고 55 μL의 총 부피의 물을 추가합니다. 물 55 μL와 빈 유리 병을 준비합니다.
    4. PTFE / 실리콘 격막이 장착 스크류 캡 바이알 (적색 측이 병의 내측에 접함) 모자. 빈 유리 병을 시작으로 HPLC의 자동 샘플링 트레이에 각각의 병을 놓습니다.
    5. 버퍼 흐름을 제어 버퍼 및 제어 샘플 injecti을 degasses HPLC 및 관련 소프트웨어를 사용에. 섬광 유량을 조절하는 유량 온라인 신틸 레이터와 관련 소프트웨어를 사용하여 H-3 감쇠 신호를 모니터링.
      1. 250mm X 4.6 mm의 크기와 HPLC에 5 μm의 실리카 수지를 함유와 SAX 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용합니다. 오염 물질의 주입을 방지하기 위해 열 가드 컬럼을 갖추게.
      2. 흐름 신틸 레이터에서 3 H 호환 500 μL 흐름 전지를 설치합니다.
        참고 : 분별은 Chemstation 소프트웨어 또는 기타 상업적으로 이용 가능한 HPLC 시스템과 제어 애질런트 1200 무한 시리즈 HPLC 시스템으로 수행 할 수 있습니다. HPLC 용 출제의 흐름은 신틸레이션 로라 소프트웨어 또는 다른 시판 흐름 신틸 또는 호환 소프트웨어에 의해 제어 β-RAM 흐름 신틸으로 행해질 수있다.
    6. 100 % 완충액 A에 1.0 ㎖ / 분의 유속으로 펌프를 초기화 급
    7. HPLC에 평형 프로파일을 설정5 5 분간, 100-1%의 B 5 분 100 % B에서 5 분, 1-100 %의 B 1 % 완충액 B : 버퍼 A와 B의 구배 ( "평형 프로토콜"라고 부른다)를 제어하는 분, 20 분, 1 % B. 바 (400), 1.0 ㎖ / 분 유속, 30 분 실행 시간에 압력 한계를 설정한다.
    8. 버퍼 A와 B의 구배 (이 "프로토콜"을 호출) 제어 HPLC에 용출 프로필 (도 2)를 설정 : 40 분 동안 5 분 내지 20 %의 B 1 % B를 20~100% 10 분, 20 분, 1 %의 B 5 분 100-1% B의 10 분, 100 % B를위한 B. 400 바, 1.0 ml / min 유속 및 90 분 실행 시간에 압력 한계를 설정한다.
    9. 유동 신틸 레이터에 검출 프로토콜 2.5 ㎖ / 분의 신틸레이션 유체 유량 및 8.57 초의 지속 시간으로, 60 분 동안 실행 (이것은 "프로토콜 검출"전화)를 설정한다.
    10. 전자 다음에 물을 비워 "프로토콜 평형"로 시작하는 HPLC에 자동 주입 순서를 프로그램ACH는 "의정서"에 샘플을 방사성 표지. 준비가되면 시퀀스를 초기화합니다.
    11. 실행이 평형 프로토콜에있는 동안,와 모든 샘플 측정하는 흐름 신틸 레이터에 배치 만들기 "프로토콜 탐지를." 시작 유동 신틸 트리거링 동안 각각의 새로운 샘플의 주입은 HPLC의 "프로토콜"를 초기화한다 "검출 프로토콜."
    12. 모든 실행의 완료시, HPLC 칼럼을 세척하고 1.0 ㎖ / 분의 유속으로 30 분 동안 100 % 완충액으로 신틸 흐름.
  4. 데이터 분석
    1. 로라 소프트웨어 또는 크로마토 그래피의 스펙트럼을 정량화 할 수있는 다른 소프트웨어를 사용합니다. 이 절에서 설명하는 단계는 그림 3에 묘사되어있다.
    2. "파일", "열기"를 클릭하여 파일을 열고 각 샘플에 대한 원시 데이터 파일을 선택합니다.
    3. "크로마토 그램"탭에서, ZO엄마의 작은 봉우리 (약 1000 카운트 [y 축]) 시간 해상도를 유지하면서 각각의 스트레칭. 필요한 경우 각 피크로 확대합니다.
    4. "투자 수익 (ROI)을 추가"도구를 사용하여 분석을 위해 각 피크를 강조 표시합니다. (4,5을 29 분에서 20 분, 촉진제 - 인 (3,5) P 2시 18 분, 촉진제-Ins4P에서 10 분, 촉진제-Ins3P에서 부모의 촉진제-기능을하고 그로 - 인 : 용출의 시간에 피크를 확인 32 분에서) P 2.
    5. "지역 테이블"탭에서 각 피크의 "영역 (카운트)"을 기록합니다. 시간과 "끝 (MM : SS)"각 피크의 시간 : "(SS MM) 시작"을합니다.
    6. 배경 차감을 위해, 동일한 시간에 걸친 피크에 인접한 영역을 강조. 해당 피크에서 카운트의 수를 뺍니다.
    7. ( "총 PtdIns의 %"로 표시) 부모의 촉진제 - 인에 대한 각 피크의 면적을 정상화. 그리고, "N으로 표시 제어 조건에 대하여, 각 실험 조건 (상기 각 피크를 정상화-fold 증가) "대조군에 비해.
      참고 : 각 피크의 정상화는 총 개수에 대해 수행 할 수 있지만, 부모의 촉진제-기능이 훨씬 더 풍부 다른 모든 PtdInsPs보다 이후 결과는 유사한 경​​향이있다.
    8. "... 다른 이름으로 저장", "파일"을 눌러 크로마토 그래프에 대한 데이터를 내보내기를 선택 파일 형식 "을 CSV (쉼표로 구분)". 스프레드 시트의 데이터를 플롯하고 필요에 따라 제시한다.

결과

이 방법을 사용, 효모 PtdInsPs는 대사 3 H-의 미오의 -inositol으로 표시했다. 표지 후, 인지질 및 인지질 탈아 실화 수용성 촉진제-InsPs (도 1)의 추출하여, 과염소산로 침전시켰다. 이 단계에서, 그것은 PtdIns 같은 매우 미량 PtdInsPs에 충분한 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 액체 섬광에 의해 추출 촉진제-InsPs와 관련된 총 방사능 신호를 정량화하는 것...

토론

이 문서에서는 효모에서 HPLC 결합 흐름 섬광에 의해 PtdnsPs의 세포 수준을 정량화하는 데 필요한 실험 프로토콜을 자세히 설명합니다. 방법론은 지질 처리 및 수용성 H-3-InsPs 촉진제, HPLC 분획의 추출 및 분석 하였다 3 H-의 미오의 -inositol와 PtdInsPs의 대사 라벨링을 가능하게한다. PtdIns (3,5) 야생형, vac14 D와 atg18의 D 효모 세포 (그림 4)에서 P 2 ?...

공개

The authors declare that they have no competing financial interests.

감사의 말

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

참고문헌

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