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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Zusammenfassung

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Einleitung

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protokoll

Hinweis: Der Text beschreibt ausführlich ein Verfahren zur PtdInsPs in Hefe zu messen. Es stellt die experimentellen Einzelheiten für die Kennzeichnung Hefezellen mit 3 H- myo-Inositol, Extrahieren und Deacylieren Lipiden und einer HPLC-Elution Protokoll zu fraktionieren und zu quantifizieren deacylierten PtdInsPs. Bitte beachten Sie, dass Kennzeichnung, Deacylierung, Auflösung und Quantifizierung von PtdInsPs in Säugerzellen erfordern Optimierung und mehr HPLC-Elutionsprofile. Diese Details können an anderer Stelle gefunden werden kann, obwohl wir einige Aspekte in der Diskussion zu diskutieren. Insgesamt ist die Methodik, um Lipide zu deacylieren extrahieren und Extrahieren der wasserlöslichen Gro-InsPs aus Hefe gegeben und ist in Figur 1 dargestellt ist.

1. Protokoll zur Markierung und Analyse PtdInsPs in Hefe

  1. Zellkultur und die Radiomarkierung
    1. Wachsen Sie eine 20 ml Flüssigkultur der Hefestamm SEY6210 bei 30 ° C unter ständigem Schütteln in komplette KunstMedium bis zur mittleren log-Phase oder einer optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) von ca. 0,6-0,7.
      Hinweis: Verwenden Sie keine Medien YPD da dies 3 H- myo-Inositol Einbau beeinflussen. Diese Kultur Größe sollte ausreichend Material für 2-3 HPLC Läufe bereitzustellen.
    2. Pelle insgesamt 10-14 OD der Hefezellen (beachte, dass 1 ml Kultur mit einer OD600 = 1 enthält ~ 1x10 7 Zellen) für 5 min in einem 12 ml-Rundrohr durch Zentrifugation bei 800 xg. Resuspendieren mit 2 ml Inosit freien Medien (IFM) (siehe Tabelle 1 für die IFM-Zusammensetzung).
    3. Wiederholen der Zentrifugation und saugen Sie den Medien. Das Pellet mit 440 & mgr; l der IFM und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
    4. Mit 60 & mgr; l 3 H- myo-Inositol (1 ul = 1 & mgr; Ci) zu jeder Probe und inkubiere bei der Wachstumstemperatur von 30 ° C für 1 bis 3 h unter ständigem Schütteln.
      Achtung: 3 H- myo-Inositol ist ein radioaktives Kollegenrial, die nach entsprechender Schulung behandelt werden sollte. Darüber hinaus sollten alle Verbrauchsmaterialien, die Kontakt mit 3 H-haltige Material zu machen und entsprechend entsorgt werden als radioaktiver Abfall bezeichnet.
      Anmerkung: Die Wachstumstemperatur kann geändert werden, wie gewünscht, solange alle Stämme, verglichen bei der gleichen Temperatur gehalten werden.
    5. Übertragen der Zellsuspension (500 ul) in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 ul 9% iger Perchlorsäure und 200 & mgr; l säuregewaschene Glasperlen. Mischen durch Umdrehen und inkubiert auf Eis für 5 min.
    6. Vortex die Probe bei Höchstgeschwindigkeit für 10 min und den Transfer der Lysate in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Gel-Ladespitze um die Glasperlen zu vermeiden.
    7. Pellet die Probe bei 12000 × g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
    8. Das Pellet von Bad Ultraschall in 1 ml eiskaltem 100 mM EDTA. Wieder Pellet wie zuvor.
  2. Deacylierung und Extraktion
    1. Frisch zubereiten 5,0 ml Deacylierung Reagenz indem 2,3 ml Methanol, 1,3 ml von 40% Methylamin, 0,55 ml 1-Butanol und 0,80 ml Wasser gegeben. Kehren Sie zu mischen.
    2. Saugen Sie das EDTA und beschallen das Pellet in 50 ul Wasser.
    3. Fügen Sie 500 ul der Deacylierung Reagenz und beschallen zu mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
    4. Wärme Lipide 50 min bei 53 ° C in einem Heizblock. Trocknen Sie die Proben vollständig durch Vakuumzentrifugation über 3 h oder O / N.
      1. Sicherzustellen, dass eine chemische Falle ist zwischen der Vakuumzentrifuge und der Vakuumpumpe, um Dämpfe in die Luft zu verhindern, eingebaut.
    5. Das Pellet mit 300 ul Wasser von Bad Beschallung und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Trockne die Proben durch Vakuumzentrifugation 3 h oder O / N. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
    6. Beschallen das Pellet mit 450 ul Wasser. Dies ist die wässrige Phase während der Extraktion.
    7. Frisch Herstellung von 10 ml der Extraction Reagenz durch Zugabe von 8,0 ml 1-Butanol, 1,6 ml Ethylether und 0,40 ml Ethylformiat. Kehren Sie zu mischen.
    8. Werden 300 ul des Extraktionsreagens zu der wässrigen Phase. Vortex die Mischung bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min und trenne die Schichten durch Zentrifugieren bei Höchstgeschwindigkeit (18.000 xg) für 2 min.
    9. Sammeln die untere wässrige Schicht in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen unter Vermeidung der obere organische Schicht, die Schnittstelle und das Pellet. Wiederholen Extraktion der wässrigen Phase noch zweimal mit frischem Extraktionsreagens.
    10. Vollständig trocknen die gesammelte wässrige Schicht durch Vakuumzentrifugation. Dispergieren des Pellet in 50 ul Wasser durch Behandlung in einem Ultraschallbad.
    11. Add 2 ul jeder Probe zu 4 ml Szintillationsflüssigkeit in einem 6 ml-Polyethylen Szintillationsfläschchen. Bestimmung der Anzahl der Zählungen (in CPM) in jeder Probe durch Flüssigszintillationszählung unter Verwendung eines offenen Fensters.
    12. Bewahren Sie die Proben bei -20 ° C, bis sie für HPLC.
  3. Trennung von3 H-glycero-inositides durch HPLC
    1. Bereiten Puffer A durch Filterung 1 l Reinstwasser mit einer Flasche top 0,22 um Vakuumfilter, gefolgt von Entgasung.
    2. Bereiten Puffer B, indem eine 1 L Lösung von 1 M Ammoniumhydrogenphosphat (APS, MW 132,06) in Wasser und stellen Sie mit Phosphorsäure den pH-Wert auf 3,8. Filtern Sie die Ammoniumphosphat mit einer Flasche top 0,22 um Vakuumfilter, gefolgt von Entgasung.
    3. Montieren Sie den Durchstechflaschen von Ausbau ein 2 ml mit einer federbelasteten 250 ul kleines Volumen Einsatz Fläschchen. Laden 10 Millionen CPM und fügen Sie Wasser für ein Gesamtvolumen von 55 ul. Bereiten Sie eine leere Flasche mit 55 ul Wasser.
    4. Verschließen Sie die Fläschchen mit Schraubverschluss mit einer PTFE / Silikon-Septum ausgestattet (rote Seite mit Blick auf das Innere der Flasche). Legen Sie jedes Fläschchen in der Auto-Sampling Fach des HPLC, beginnend mit der leeren Durchstechflasche.
    5. Verwenden Sie ein HPLC und zugehörige Software, Pufferfluss steuert, entgast Puffer und Kontrollen Probe INJEKTIERTam. Verwendung eines Online-Strömungs Szintillator und der zugehörigen Software, um den Szintillator Flußrate zu regulieren und die 3 H-Abfallsignal zu überwachen.
      1. Verwenden Sie einen SAX Flüssigkeitschromatographiesäule mit Abmessungen von 250 mm x 4,6 mm und mit 5 & mgr; m Silika-Harz in der HPLC. Statten Sie die Spalte mit einer Spalte Wache Injektion von Verunreinigungen zu verhindern.
      2. Installieren Sie eine 3 H-kompatiblen 500 ul Flusszelle in der Strömung Szintillator.
        HINWEIS: Die Fraktionierung kann mit einem Agilent 1200 Infinity-Serie-HPLC-System von ChemStation-Software oder mit anderen handelsüblichen HPLC-Systeme gesteuert erfolgen. Flow Scintillation der HPLC-Eluent kann mit einem β-RAM Strömungs Szintillator vom Laura Software oder anderen kommerziell erhältlichen Strömungs Szintillator oder kompatible Software gesteuert erfolgen.
    6. Initialisieren der quaternären Pumpe bei einer Fließrate von 1,0 ml / min mit 100% Puffer A.
    7. Einrichtung eines Ausgleichsprofil auf der HPLC1% Puffer B für 5 min, 1-100% B für 5 min, 100% B für 5 Minuten, 100-1% B 5: um die Steigung der Puffer A und B (nennen das "Protokoll Ein Gleichgewichtseinstellung") steuern min, 1% B für 20 min. Stellen Sie die Druckgrenze bei 400 bar, 1,0 ml / min Strömungsgeschwindigkeit und 30 Minuten Laufzeit.
    8. Richten Sie ein Elutionsprofil (Abbildung 2) auf der HPLC, um die Steigung der Puffer A und B (nennen das "Protokoll A") zu steuern: 1% B für 5 Minuten, 1-20% B für 40 min, 20-100% B für 10 min, 100% B für 5 min 100-1% B für 20 min, 1% B für 10 min. Stellen Sie die Druckgrenze bei 400 bar, 1,0 ml / min Strömungsgeschwindigkeit und 90 Minuten Laufzeit.
    9. Einrichten einer Erfassungsprotokoll auf die Strömung Szintillator (nennen das "Protokoll A detection"), die für 60 min laufen, mit einer Szintillationsflüssigkeit Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml / min und einer 8,57 sec Verweilzeit.
    10. Programmieren Sie eine automatisierte Einspritzfolge auf der HPLC mit dem Wasser leer in "Protokoll Ein Gleichgewichtseinstellung" beginnen, gefolgt von each radioaktiv markierte Probe auf "Protokoll A". Initialisieren Sie die Reihenfolge, wenn Sie fertig.
    11. Während der Lauf noch auf dem Gleichgewichtsprotokoll, eine Batch auf die Strömung Szintillator, um alle Proben mit Maß "A Protocol Erkennung." Die Injektion von jedem neuen Abtastwert wird "Protokoll A" auf der HPLC zu initialisieren, während die Auslösung der Strömungs Szintillator zu beginnen "Protokoll einer Detektions."
    12. Bei Beendigung aller Läufe, spülen Sie die HPLC, die Säule und Durchfluss Szintillator mit 100% Puffer A für 30 min bei 1,0 ml / min Durchflussmenge.
  4. Datenanalyse
    1. Verwenden Laura Software oder andere Software, die den Chromatographie-Spektren zu quantifizieren kann. Die in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte sind in Abbildung 3 dargestellt.
    2. Öffnen Sie die Dateien, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" und wählen Sie die Rohdatendatei für jede Probe.
    3. Im Register "Chromatogramme", zoom in jedem der kleineren Peaks (etwa 1000 Zählungen [y-Achse]) unter Beibehaltung der Zeitauflösung zu dehnen. Untersuche jeden einzelnen Peak, wenn nötig.
    4. Markieren Sie jede der Spitzen für die Analyse unter Verwendung des "Add ROI" Werkzeug. Identifizieren Spitzen durch die Elutionszeit: Parental Gro-Ins bei 10 min, Gro-Ins3P bei 18 min, Gro-Ins4P bei 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 bei 29 min und Gro-Ins (4,5 ) P 2 bei 32 min.
    5. Im Register "Bereiche Tabellen", notieren Sie die "Bereich (Counts)" jeder Spitze. Beachten Sie die "Start (mm: ss)" Zeit und "Ende (mm: ss)" Zeit jeder Spitze.
    6. Zum Abzug des Hintergrunds, markieren einen Bereich benachbart zu dem Peak überspannt dieselbe Menge an Zeit. Subtrahieren der Anzahl von Zählungen von dem entsprechenden Peak.
    7. Normalisieren die Fläche von jeder Spitze gegen elterliche Gro-Ins (wie "% of total PtdIns" ausgedrückt). Dann normalisiert jede der Spitzen in jeder Versuchsbedingung gegen den Steuerzustand (als "n ausgedrücktfache Steigerung im Vergleich zur Kontrolle ").
      HINWEIS: Die Normalisierung jeder Spitze kann auch gegen Gesamtzählungen durchgeführt werden, aber da die elterliche Gro-Ins ist viel häufiger als alle anderen PtdInsPs die Ergebnisse sind in der Regel ähnlich.
    8. Exportieren Sie die Daten für den Chromatographen, indem Sie auf "Datei", "Speichern unter ..." und wählen Sie die "CSV (Komma getrennt)" Dateiformat. Zeichnen Sie die Daten in einer Tabellenkalkulation und zu präsentieren wie nötig.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Hefe PtdInsPs metabolisch mit 3 H-myo-Inositol-markiert. Nach der Markierung wurden die Phospholipide mit Perchlorsäure ausgefällt, gefolgt von Deacylierung Phospholipid und die Extraktion der wasserlöslichen Gro-InsPs (Abbildung 1). In dieser Phase ist es wichtig, die gesamte radioaktives Signal mit dem extrahierten Gro-InsPs durch Flüssigszintillationszählung zu quantifizieren, um eine ausreichende Sign...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt die experimentelle Protokoll erforderlich, um Zellebenen PtdnsPs durch HPLC-gekoppelten Strömungs Szintillations aus Hefe zu quantifizieren. Die Methodik ermöglicht die metabolische Markierung von PtdInsPs mit 3 H- myo-Inositol, gefolgt von Lipid Aufarbeitung und Extraktion von wasserlöslichen 3 H-Gro-InsPs, HPLC-Fraktionierung und Analyse. Mit dieser Methode können die relativen Mengen an PtdInsPs in Zellen unter verschiedenen Bedingungen quantifiziert werden...

Offenlegungen

The authors declare that they have no competing financial interests.

Danksagungen

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Referenzen

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