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Neste Artigo

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  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Resumo

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Introdução

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protocolo

Nota: O texto abaixo descreve em pormenor um método para medir PtdInsPs em leveduras. Ele fornece os detalhes experimentais para as células de levedura de rotulagem com 3 H- mio-inositol, extraindo e desacilando lipídios e um protocolo de HPLC-eluição para fracionar e quantificar PtdInsPs desacilados. Por favor, note que a rotulagem, a desacilação, resolução e quantificação de PtdInsPs em células de mamíferos requerem otimização e perfis de HPLC-eluição mais longos. Esses detalhes podem ser encontrados em outros lugares, embora nós discutir alguns dos aspectos na discussão. Em geral, a metodologia para extrair os lípidos, desacilar e extrair o solúvel em água Gro-InsPs de levedura é determinada e é ilustrada na Figura 1.

1. Protocolo para Rotulagem e Análise PtdInsPs em leveduras

  1. Cultura de células e a marcação radioactiva
    1. Cresce de 20 ml de cultura líquido do SEY6210 estirpe de levedura a 30 ° C com agitação constante em sintético completomeios para a fase mid-log ou uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de cerca de 0,6-0,7.
      Nota: Não use mídia YPD como isso pode afetar 3 H- mio-inositol incorporação. Este tamanho de cultura deve fornecer material suficiente para 2-3 corridas de HPLC.
    2. Pellet um total de 10-14 OD das células de levedura (note que 1 mL de cultura com uma DO600 = 1 contém ~ 1x10 7 células) por centrifugação a 800 xg durante 5 min num tubo de 12 ml de fundo redondo. Ressuspender com 2 ml de livre-inositol mídia (IFM) (ver Tabela 1 para composição IFM).
    3. Repita centrifugação e aspirar a mídia. Ressuspender o sedimento com 440 ul de MFI e incubar à TA durante 15 min.
    4. Adicionar 60 ul de 3 H-mio-inositol (1 mL = 1 uCi) a cada amostra e incubar à temperatura crescente de 30 ° C durante 1 a 3 horas com agitação constante.
      Cuidado: 3 H- mio-inositol é um companheiro radioativorial que deve ser tratado após o treinamento apropriado. Além disso, todos os produtos de consumo que fazem contacto com material contendo 3 H deve ser descartado de forma apropriada e designados como resíduos radioactivos.
      Nota: A temperatura de crescimento podem ser alterados conforme necessário, desde que todas as estirpes a serem comparadas são cultivadas à mesma temperatura.
    5. Transferir a suspensão de células (500 uL) para um tubo de microcentrifugadora contendo 500 ul de ácido perclórico a 9% e 200 uL de esferas de vidro lavadas com ácido. Misturar por inversão e incubar em gelo durante 5 min.
    6. Vortex a amostra à velocidade máxima durante 10 minutos e transferir os lisados ​​para um novo tubo de microcentrífuga utilizando uma ponta de gel de carregamento a fim de evitar as esferas de vidro.
    7. Pellet da amostra a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
    8. Ressuspender o sedimento por banho de ultra-sons em 1 ml de EDTA a 100 mM arrefecido em gelo. Agregar novamente como antes.
  2. Desacila�o e extração
    1. Recentemente preparar 5,0 ml do reagente de desacilação por combinação de 2,3 ml de metanol, 1,3 ml de metilamina a 40%, 0,55 ml de 1-butanol e 0,80 mL de água. Inverta para misturar.
    2. Aspirar o EDTA e sonicar o sedimento em 50 ul de água.
    3. Adicionar 500 ul de reagente a desacilação e sonicar a mistura. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min.
    4. Lípidos calor durante 50 min a 53 ° C num bloco de aquecimento. Secam-se as amostras completamente por centrifugação de vácuo ao longo de 3 horas ou O / N.
      1. Assegure-se que uma armadilha química está instalado entre o vácuo por meio de centrífuga e a bomba de vácuo, para evitar a entrada de vapores no ar.
    5. Ressuspender o sedimento com 300 ul de água por banho de sonicação e incubar à TA durante 20 min. Secam-se as amostras por centrifugação a vácuo durante 3 horas ou O / N. Repita este passo mais uma vez.
    6. Sonicar o sedimento com 450 ul de água. Esta é a fase aquosa durante a extracção.
    7. Recém preparar 10 ml da extraction reagente pela adição de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml de éter etílico e 0,40 ml de formato de etilo. Inverta para misturar.
    8. Adicionar 300 ul de reagente de extracção para a fase aquosa. Vortex a mistura à velocidade máxima durante 5 min e separar as fases por centrifugação a velocidade máxima (18.000 x g) durante 2 min.
    9. Recolher a fase aquosa inferior para um novo tubo de microcentrifuga, evitando a camada superior orgânica, a interface, e o sedimento. Repetir a extracção da fase aquosa mais duas vezes com reagente de extracção fresco.
    10. Completamente seca a camada aquosa recolhida por centrifugação a vácuo. Dispersa-se o sedimento em 50 ul de água por banho de sonicação.
    11. Adicionar 2 mL de cada amostra a 4 ml de fluido de cintilação num frasco de cintilação de 6 ml de polietileno. Determinar o número de contagens (em cpm) em cada amostra por cintilação líquida usando uma janela aberta.
    12. Armazenar as amostras a -20 ° C até estar pronto para a HPLC.
  3. Separação de3H-glicero-inositides por HPLC
    1. Preparar tampão A por filtração 1 L de água ultrapura com uma garrafa topo filtro de 0,22 um vácuo, seguida de desgaseificação.
    2. Preparar tampão B, fazendo uma solução de 1 L de 1 M de fosfato de amónio dibásico (APS, MW 132,06) em água e ajustar o pH para 3,8 com ácido fosfórico. Filtra-se o fosfato de amónio com um frasco de topo filtro de 0,22 um vácuo, seguida de desgaseificação.
    3. Monte o frasco para injectáveis ​​equipando um frasco de 2 ml com uma inserção de 250 ul volume pequeno de mola. Carga de 10 milhões de CPM e adicionar água para um volume total de 55 ul. Prepare um frasco vazio com 55 mL de água.
    4. Tapar os frascos com tampas de rosca equipado com um septo PTFE / silicone (lado vermelho de frente para o interior do frasco). Coloque cada frasco na bandeja de auto-amostragem do HPLC, começando com o frasco em branco.
    5. Use um HPLC e software associado que controla o fluxo de buffer, degasses buffers e controles de amostra injectiligar. Use um cintilador fluxo on-line e seu software associado para regular o caudal de cintilante e para monitorar o sinal de 3 H-decadência.
      1. Utilizar uma coluna de cromatografia líquida SAX com dimensões de 250 mm x 4,6 mm e contendo 5 uM de sílica na resina de HPLC. Equipar a coluna com uma coluna de guarda para evitar a injecção de contaminantes.
      2. Instalar uma célula compatível H-3 de fluxo de 500 uL na cintilador de fluxo.
        NOTA: O fraccionamento pode ser realizado com um sistema de HPLC Agilent 1200 series infinito controlado por software Chemstation ou com outros sistemas de HPLC disponíveis comercialmente. Fluxo de cintilação do eluente de HPLC pode ser feito com um fluxo de cintilador β-RAM controlado pelo software Laura ou outro cintilador de fluxo disponível comercialmente ou software compatível.
    6. Inicializar a bomba quaternária, a uma taxa de fluxo de 1,0 ml / min com 100% de tampão A.
    7. Definir um perfil de equilíbrio no HPLCpara controlar o gradiente de tampões A e B (chamada de "Um protocolo de equilíbrio"): 1% de tampão B, durante 5 min, 1-100% de B durante 5 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 5 min, 1% de B durante 20 min. Definir o limite de pressão a 400 bar, 1,0 ml / min caudal, e 30 min tempo de execução.
    8. Defina-se um perfil de eluição (Figura 2) no HPLC para controlar o gradiente de tampões A e B (chamar este "Protocolo A"): 1% de B durante 5 min, 1-20% de B durante 40 min, 20-100% B durante 10 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 20 min, 1% de B durante 10 min. Definir o limite de pressão a 400 bar, 1,0 ml / min caudal, e 90 min tempo de execução.
    9. Configurar um protocolo de detecção no cintilador de fluxo (chamo isso de "Protocolo A detecção") para ser executado durante 60 minutos, com uma taxa de fluxo de fluido de cintilação de 2,5 ml / min e um tempo de permanência 8,57 seg.
    10. Programar uma sequência de injecção automática no HPLC para começar com o espaço em branco na água "Protocolo Um equilíbrio", seguido de each radiomarcado amostra em "Protocolo A". Inicializar a seqüência quando estiver pronto.
    11. Enquanto a corrida ainda está no protocolo de equilíbrio, criar um lote no cintilador fluxo para medir todas as amostras com "Protocolo A detecção." A injeção de cada nova amostra irá inicializar "Protocolo A" no HPLC, enquanto acionando o cintilador fluxo para começar "Protocolo A detecção."
    12. Após a conclusão de todas as corridas, lave a HPLC, a coluna eo fluxo cintilador com 100% de Tampão A durante 30 minutos a 1,0 ml / min caudal.
  4. Análise de dados
    1. Use um software de Laura ou qualquer outro software que pode quantificar o espectro de cromatografia. Os passos descritos nesta secção são representados na Figura 3.
    2. Abra os arquivos clicando em "Arquivo", "Abrir" e selecione o arquivo de dados brutos para cada amostra.
    3. Na aba "cromatogramas", zoom a esticar em cada um dos picos menores (cerca de 1000 contagens [eixo y]), mantendo a resolução de tempo. Zoom em cada pico indivíduo, se necessário.
    4. Realce cada um dos picos para a análise usando a opção "Adicionar ROI" ferramenta. Identificar picos por tempo de eluição: Parental Gro-Ins em 10 min, Gro-Ins3P aos 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 aos 29 min e Gro-Ins (4,5 ) P 2 em 32 min.
    5. Na aba "mesas regiões", gravar a "área (contagem)" de cada pico. Observe o "start (mm: ss)" o tempo eo "fim (mm: ss)" tempo de cada pico.
    6. Por subtracção do fundo, destacar uma região adjacente ao pico abrangendo a mesma quantidade de tempo. Subtrair o número de contagens do pico correspondente.
    7. Normalizar a área de cada pico parental contra Gro-Ins (expressa como "% do total de PtdIns"). Em seguida, normalizar cada um dos picos em cada condição experimental contra a condição de controle (expresso como "nfold aumento em relação ao controle ").
      NOTA: Normalização de cada pico pode também ser feito contra as contagens totais, mas uma vez que o parental Gro-Ins é muito mais abundante do que todos os outros PtdInsPs os resultados tendem a ser semelhante.
    8. Exportar os dados para os cromatógrafos pressionando "Arquivo", "Salvar como ...", e escolha a opção "CSV (separados por vírgula)" formato de arquivo. Plotar os dados em uma planilha e apresentar, se necessário.

Resultados

Usando este método, PtdInsPs de levedura foram marcadas metabolicamente com H-3 mio-inositol. Após marcação, os fosfolípidos foram precipitados com ácido perclórico, seguida por desacilação e fosfolípido extracção do Gro-InsPs solúvel em água (Figura 1). Nesta fase, é importante para quantificar o sinal radioactivo associado ao total de extraiu-Gro-InsPs por cintilação líquida para garantir suficiente rácio de sinal para ruído para...

Discussão

Este artigo detalha o protocolo experimental necessária para quantificar os níveis celulares de PtdnsPs por acoplado-HPLC fluxo de cintilação de levedura. A metodologia permite que a marcação metabólica de PtdInsPs com 3 H-mio-inositol, seguido de processamento e extracção de lípido solúvel em água 3H-Gro-InsPs, fraccionamento por HPLC e análise. Usando este método, os níveis relativos de PtdInsPs em células sob várias condições pode ser quantificada, como é mostrado pa...

Divulgações

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimentos

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Referências

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