JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول للحصول على المصفوفات المشتقة من خلية غنية في البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وذلك باستخدام crowders الجزيئات (MMC). وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم البروتوكول الذي يتضمن MMC في 3D عضوي النمط الجيل الجلد ثقافة مشتركة، مما يقلل من الوقت الثقافة مع المحافظة على استحقاق بناء.

Abstract

الأسرة بروتين سكري من الكولاجين تمثل البروتينات الهيكلية الرئيسية في جسم الإنسان، وهي المكونات الرئيسية من المواد الحيوية المستخدمة في هندسة الأنسجة الحديثة. وعنق الزجاجة الفني هو ترسب الكولاجين في المختبر، كما أنها بطيئة بشكل ملاحظ، مما أدى إلى تشكيل دون المستوى الأمثل من النسيج الضام، وتماسك النسيج لاحقا، ولا سيما في نماذج الجلد. هنا، نحن تصف الطريقة التي يتضمن إضافة تفاضلي الحجم السكروز شارك في البوليمرات على الثقافات الجلد لتوليد الجزيئات الازدحام (MMC)، مما يؤدي إلى تعزيز مثيرة من ترسب الكولاجين. بشكل خاص، أودعت الخلايا الليفية الجلدية كمية كبيرة من الكولاجين I / الرابع / السابع والفيبرونكتين تحت MMC بالمقارنة مع مجموعة المقارنة.

يصف بروتوكول أيضا وسيلة لdecellularize طبقات الخلايا المزدحمة، وتعريض كميات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تم الإبقاء على سطح الثقافة كما يتضح من immunocytochemistry. تمت دراسة مجمل الكتلة المصفوفة وتوزيع نمط استخدام التدخل انعكاس المجهر. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الليفية، الخلايا الكيراتينية وشارك في الثقافات أنتجت المصفوفات المشتقة من خلية (CDM) متفاوتة تكوين والتشكل. آلية التنمية النظيفة يمكن استخدامها باسم "السقالات الحيوي" بذر خلية الثانوي، حيث الاستخدام الحالي من الطلاء أو السقالات، وعادة من مصادر حيوانية xenogenic، يمكن تجنبها، وبالتالي التحرك نحو المزيد من التطبيقات ذات الصلة سريريا.

وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول تطبيق MMC خلال المرحلة المغمور من الجلد نموذج 3D عضوي النمط الثقافة المشتركة التي كانت كافية لتعزيز ECM ترسب في الوصل البشروي الأدمي (DEJ)، على وجه الخصوص، والكولاجين السابع، المكون الرئيسي رسو الألياف. أكد الإلكترون المجهري وجود ترسيخ الألياف في الثقافات المتقدمة مع MMC، مقارنة بمجموعة التحكم. وهذا أمر مهم كما الألياف ترسيخ حبل الأدمة إلى البشرة، وبالتالي،وجود شكل ما قبل النضج DEJ قد يستفيد المتلقين الكسب غير المشروع الجلد من حيث الاستقرار الكسب غير المشروع والتئام الجروح بشكل عام. وعلاوة على ذلك، تم تكثيفه الوقت ثقافة من 5 أسابيع إلى 3 أسابيع للحصول على بناء ناضجة، عند استخدام الوسائط المتعددة، وخفض التكاليف.

Introduction

يشكل الجلد حاجزا واقيا عن طريق منع فقدان الماء ودخول العوامل المسببة للأمراض. وهي مكونة من ثلاثة عناصر رئيسية هي؛ وانسجة الأدمة غنية 1، البشرة طبقية 2،3،4 على أعلى من ذلك، والوصل البشروي الأدمي بين 5،6. وتتكون الأدمة إلى حد كبير من الكولاجين والألياف المرنة وذات كثافة سكانية منخفضة مع الخلايا الليفية 7. في المقابل، وتتكون البشرة خلايا غنية من طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية. الخلايا الكيراتينية من الطبقة الداخلية الأكثر هي التكاثري وتوفر الخلايا القاعدية الجديدة التي تجديد واستبدال الخلايا الكيراتينية التفريق عضال التي تتحرك باستمرار إلى الخارجية، حيث ان معظم طبقة من الجلد وفقدت النواة ومادة هيولية، مما أدى إلى طبقة متقرن الذي يخضع ل التقشر.

تقاطع طريق الجلد، البشرة، نوع معين من الغشاء القاعدي، هو بنية معقدة تتألف من ربط جزيئات المصفوفة، التي tetheRS البشرة إلى الأدمة. ألياف الكولاجين الأول من الأدمة شابك مع الكولاجين السابع ترسو الألياف التي ترتكز على الكولاجين الرابع الصفيحة الغنية الكثيفة. رسو خيوط (laminin 5، والكولاجين السابع عشر وintegrins) بدورها تربط الكثيفة الصفيحة مع hemidesmosomes من الخلايا الكيراتينية القاعدية. الكيراتينية القاعدية (الطبقة القاعدية) لديها القدرة على التكاثر وتجديد، وكذلك يفرق وتطبق على شكل طبقات suprabasal. الشائكة الطبقة، الطبقة الحبيبية، وأخيرا الطبقة القرنية، وهو ما يمثل سطح تلامس الجلد مع البيئة. طريقها من الطبقة القاعدية إلى الطبقة متقرن، الكيراتينية تبديل أنماط التعبير من cytokeratins وأخيرا الخضوع لموت الخلايا المبرمج ويغلف أنفسهم في متقرن المظاريف، هياكل من البروتينات المحددة التي crosslinked تساهميا حسب النشاط الغلوتامين.

إعادة الجلد وطبقات في المختبر، بما في ذلك الهياكل المعقدة لل تقاطع طريق الجلد، البشرة والجلد المصفوفة خارج الخلية، ولمحاكاة عملية التقرن، لديها علماء ومفتون bioengineers دام مهمة صعبة. كانت هناك تقدما كبيرا في هندسة الأنسجة الجلد، على سبيل المثال، استخراج ناجحة من خلايا الجلد من الخزعات المرضى وتوليد الثقافات عضوي النمط الجلد باستخدام خلايا الجلد المستمدة من المريض (8). ومع ذلك، لا تزال المشاكل التي لم تحل الذي يخص لإفراز الفقراء من البروتينات المصفوفة خارج الخلية من خلايا الجلد أنفسهم ومما أدى إلى نماذج الجلد دون المستوى الأمثل. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت اللازم لتوليد 3D عضوي النمط الجلد شارك في الثقافة باستخدام البروتوكولات الحالية تتراوح ما بين 4-8 أسابيع، وهي الفترة الزمنية التي يحتمل أن تكون مختصرة مع إدماج crowders الجزيئات. تقليل الوقت اللازم ثقافة ينقذ تكلفة كاشف، ويقلل من حدوث الشيخوخة الخلايا ويقلل من وقت انتظار المريض يجب استخدام المنتج في العيادة.

ر "> الجزيئات الازدحام (MMC) ينطوي على إدخال جزيئات محددة إلى مستنبت لتوليد آثار حجم استبعادها. هذه تؤثر على معدلات التفاعل الأنزيمية بما في ذلك انشقاق بروتين من بروكولاغين وهو تأخر في ظل ظروف ثقافة المائية القياسية 9-13 تحت MMC، التفاعلات الأنزيمية وسارعت دون زيادة كمية الكواشف 14،15 مما أدى، في حالة من الانقسام بروكولاغين، زيادة كمية الكولاجين الأول الجزيئات في الثقافات المزدحمة بالمقارنة مع الضوابط غير مزدحم 10. وتحويل بروكولاغين الكولاجين يسمح تشكيل الكولاجين المجالس، الخلايا الليفية مثقف مع MMC لمدة 48 ساعة حققت أكبر بكثير من الكولاجين أنا بالمقارنة مع الثقافات الليفية غير مزدحم مراقبة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع 11،16،17. وإلى جانب الآثار المترتبة على الأنشطة الأنزيمية التي تؤثر على تكوين وتحقيق الاستقرار وإعادة تشكيل ECM، MMC أيضا وقد تبين لتعزيز مباشرة وتعدل الكولاجينتشكيل الألياف 18،19.

نقدم هنا طريقة لتعزيز المصفوفة خارج الخلية (ECM) إنتاج خلايا الجلد، ولا سيما الخلايا الليفية الجلدية والخلايا الكيراتينية البشرة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن ECM المخصب المنتجة في إطار MMC في الثقافات أحادي الطبقة يمكن decellularized وتستخدم مصفوفة المستمدة خلية نقية (CDM).

نحن نستخدم نهجا غير تقليدي لتصور ونقدر تماما ECM المودعة من قبل خلايا الجلد مثقف مع MMC. يستخدم التدخل انعكاس المجهري عادة لدراسة التفاعلات خلية مصفوفة أو نقاط الاتصال الخلية الى الزجاج. وقد استخدمت هذه التقنية في نظامنا لعرض المبلغ الإجمالي للمصفوفة تترسب على سطح الزجاج. وقد يقترن تدخل انعكاس المجهر مع المناعية الفلورية للحصول على اكبر قدر من المعلومات من حيث التكوين المصفوفة خارج الخلية ونمط، في حضور وغياب MMC.

Organotypiج الجلد المشترك الثقافات هو الطريقة الكلاسيكية لنموذج الجلد في المختبر في إطار ثلاثي الأبعاد. في حين ثنائية الأبعاد المشترك الثقافات قد يوفر معلومات مهمة، فمن محدود عند ترجمة هذه البيانات وتطبيقه مرة أخرى إلى البيئة في الجسم الحي، والتي هي بطبيعتها هيكل ثلاثي الأبعاد. الكيراتينية الجلد، وعلى وجه الخصوص، الاستقطاب وتحتوي على شرائح قمي والقاعدية التي تعتبر أساسية لتوازن والالتزام الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن البروتينات suprabasal نموذجية في الخلايا الكيراتينية فوق الطبقة القاعدية، مثل الكيراتين 1، الكيراتين 10 و filaggrin موجود فقط في سياق التقسيم الطبقي والتمايز النهائي من الخلايا الكيراتينية. كما التمايز النهائي لا يكاد يكون موجودا في الثقافات أحادي الطبقة العادية، وعادة لا يتحقق تعبير البروتين suprabasal في هذا النظام الثقافة. لذلك، تبدأ الثقافات عضوي النمط المغمورة في مستنبت، ولكن بعد ذلك ورفعت إلى واجهة الهواء السائل لدفع keratinocytالبريد التمايز. ويؤدي ذلك إلى التعبير عن علامات الطبقية، حتى التقرن وانعكاس أفضل بشكل عام من علم وظائف الأعضاء البشرة. بينما مجموعات أخرى قد ولدت من قبل عضوي النمط الجلد المشترك الثقافات بنجاح، فإن إنشاء منطقة الوصل البشروي الأدمي وظيفية قضية. هنا، نقدم طريقة جديدة لزراعة عضوي النمط الجلد المشترك الثقافات مع الغشاء القاعدي المعززة، في إطار زمني مكثف ودون المساس استحقاق هذه التركيبات. وهذا من شأنه توفير محاكيات الجلد لفي المختبر النمذجة، ودراسة علم الأحياء الجلد ومجموعة متنوعة من فحوصات الفرز.

Protocol

1. الجزيئات الازدحام في 2D الثقافات الجلد خلية

  1. البذور 50000 الخلايا (الخلايا الليفية الأولية أو الخلايا الكيراتينية الأولية أو ثقافة مشتركة من الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية الأولية) لكل بئر من 24 لوحة جيدا. خلايا البذور في 1 مل من وسائل الاعلام نمو نوع من الخلايا المقابلة.
  2. السماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها، في مئوية الحاضنة 37 درجة في 5٪ CO 2.
  3. تجاهل وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع 1 مل وسائل الإعلام الجديدة التي تحتوي على crowders الجزيئات و 100 ميكرومتر حمض الاسكوربيك. استخدام كوكتيل كراودر تتكون من 37.5 ملغ / مل Ficoll 70 و 25 ملغ / مل Ficoll 400. وسائل الإعلام استخدام الخلايا الليفية (FM)، ويتألف من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ المضادات الحيوية البنسلين ستربتومايسين. تنمو الخلايا الكيراتينية في وسائل الإعلام الحرة المصل، KSFM أو CNT-57. الحفاظ المشترك الثقافات في خليط من 50٪ FM و 50٪ سائل الإعلام خالية من المصل.
  4. احتضان الثقافات لمدة 6 أيام في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، مع تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.

2. المناعية الفلورسنت على الثقافات الجلد خلية

  1. غسل مزارع الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
  2. إصلاح مزارع الخلايا إما الميثانول أو امتصاص العرق (اعتمادا على مواصفات الأجسام المضادة).
    1. للميثانول التثبيت
      1. قسامة 500 ميكرولتر من الميثانول الباردة في كل بئر واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نضح تثبيتي، والتخلص من النفايات من الميثانول. الهواء الجاف في غطاء الصفحي الدخان.
    2. لامتصاص العرق التثبيت
      1. قسامة 500 ميكرولتر من 2٪ من محلول امتصاص العرق في كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. نضح تثبيتي، والتخلص من النفايات من امتصاص العرق.
      2. يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X، لمدة ثلاث يغسل، 5 دقائق لكل يغسل.
      3. قسامة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X في كل بئر.
  3. المناعية فلوري عن طريق الأجسام المضادة
    1. قسامة 500 ميكرولتر من 3٪ ألبومين المصل البقري (المخفف في برنامج تلفزيوني 1X) في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نضح عرقلة الحل وتجاهل.
    2. الأجسام المضادة الأولية
      1. للتصوير مباشرة من لوحة: قسامة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1: 100 التخفيف في 10٪ مصل الماعز) حل في كل بئر واحتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. لcoverslips: قسامة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1: 100 التخفيف في 10٪ مصل الماعز) حل على قطعة مسطحة من بارافيلم. وضع ساترة على بارافيلم، مع الجانب الخلية (جزء من ساترة مع الخلايا) التي تواجه حل. تغطية كامل على جانب الخلية، مع عدم وجود فقاعات. احتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. نضح حل الأجسام المضادة الأولية وتجاهل.
    4. يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X، لمدة ثلاث يغسل، 5 دقائق لكل يغسل.
    5. الجسم المضاد الثانوي
      1. للتصوير مباشرة من لوحة: قسامة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 400 التخفيف في 10٪ مصل الماعز) حل في كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتغطي لوحة مع الألومنيوم فو انا.
      2. لcoverslips: قسامة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 400 التخفيف في 10٪ مصل الماعز) حل على قطعة مسطحة من بارافيلم. وضع ساترة على بارافيلم، مع الجانب الخلية (جزء من ساترة مع الخلايا) التي تواجه حل. تغطية كامل على جانب الخلية، مع عدم وجود فقاعات. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والتي تغطي بارافيلم بورق الألمنيوم.
    6. نضح حل الضد الثانوية وتجاهل.
    7. يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X، لمدة ثلاث يغسل، 5 دقائق لكل يغسل. قسامة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X في كل بئر.
    8. متزايد
      1. لتصوير مباشرة من لوحة: لا جبل. انتقل إلى المجهر.
      2. للتصوير من coverslips: جبل coverslips، في تصاعد وسائل الإعلام، على شريحة زجاجية. بين عشية وضحاها الجافة في وعاء مغطى بورق الألمنيوم. انتقل إلى المجهر.
  4. الحصول على الصور باستخدام المسح الضوئي متحد البؤر الليزر مجهر مع الهدف النفط 40X / 1.30.
ه "> 3. التنشيف الغربية من الثقافات الجلد خلية

  1. غسل طبقات الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
  2. قسامة 100 ميكرولتر من تحلل العازلة (انظر قائمة المواد) في كل (شكل لوحة 6-جيدا) أيضا. كشط طبقة الخلايا مع مكشطة الخلية والحل نقل إلى أنبوب microcentrifuge.
  3. الحل الطرد المركزي في 15330 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل أنبوب microcentrifuge آخر وتجاهل بيليه.
  4. مزيج 13 ميكرولتر من كل عينة مع 5 ميكرولتر من عينة العازلة و 2 ميكرولتر من الحد من وكيل (انظر قائمة المواد). عينات الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. عينات الطرد المركزي في 15330 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع مياه التكثيف. نماذج تحميل إلى هلام PAGE مسبقة الصب وتديرها في 100 فولت لحوالي 1 ساعة.
  6. لنقل البروتينات المنفصلة إلى غشاء النيتروسليلوز، ساندويتش جل والغشاء بين قطع من الورق والإسفنج (من نفس الحجم). تأكد من عدم وجود فقاعات بين هلام، غشاء، وأوراق والإسفنجالصورة. إغلاق كاسيت شطيرة وتشغيل نقل في 70 V لفي 2 ساعة.
  7. للتحقق مما إذا كان نقل كاملة، واحتضان الغشاء مع 10 مل الشقائقية S. غسل غشاء مع 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
  8. منع مع 10 مل من الحليب 5٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل الغشاء مع 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
  9. احتضان مع 10 مل الأجسام المضادة الأولية لمدة 90 دقيقة (الماوس مكافحة الكولاجين السابع، LH 7.2، 1: 1000 في تخفيف٪ الحليب 5). يغسل الغشاء مع 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
  10. احتضان مع 10 مل الضد الثانوية لمدة 30 دقيقة (الماعز المضادة للماوس برنامج الصحة الإنجابية، 1: 2000 في تخفيف٪ الحليب 5). يغسل الغشاء مع 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
  11. نقل الغشاء إلى الكاسيت وإضافة 1 مل من أطلق بيت التمويل الخليجي كشف الكاشف. وضع، ورقة رقيقة من البلاستيك واضحة على الغشاء.
  12. للكشف عن التوهج، ضع فيلم حساسة للضوء على ورقة من البلاستيك وإغلاق الكاسيت. بعد 2دقيقة -5، وإزالة الفيلم من الكاسيت ووضعه في مطور.

4. صنع واستخدام مصفوفة المشتقة من خلية

  1. البذور 50000 الخلايا (الخلايا الليفية الأولية أو الخلايا الكيراتينية الأولية أو ثقافة مشتركة من الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية الأولية) لكل بئر من 24 لوحة جيدا.
  2. السماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها، في مئوية الحاضنة 37 درجة في 5٪ CO 2.
  3. تجاهل وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة التي تحتوي على crowders الجزيئات و 100 ميكرومتر حمض الاسكوربيك. يتكون كوكتيل كراودر 37.5 ملغ / مل Ficoll 70 و 25 ملغ / مل Ficoll 400. وسائل الاعلام الخلايا الليفية (FM) ويتكون من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ القلم بكتيريا. تزرع الخلايا الكيراتينية في وسائل الإعلام الحرة المصل، KSFM أو CNT-57. الحفاظ المشترك الثقافات في خليط من 50٪ FM و 50٪ KSFM أو CNT-57.
  4. احتضان الثقافات لمدة 6 أيام في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.
  5. Decellularize طبقات الخلايا للحصول على ماتري المشتقة من خليةس (و حصيرة = المشتقة من الخلايا الليفية مصفوفة، ك حصيرة = المشتقة من الخلايا الكيراتينية مصفوفة، وشارك في حصيرة = المصفوفة مستمدة من ثقافة مشتركة من الخلايا الليفية والخلايا القرنية).
    1. غسل طبقات الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني 1X.
    2. إضافة 250 ميكرولتر من 0.5٪ deoxycholate الصوديوم. احتضان، على الجليد، لمدة 10 دقيقة. نضح الخلايا المحللة.
    3. كرر الخطوة 4.5.2 ثلاث مرات.
    4. مصفوفة غسل الخلايا المشتقة من مرتين في H المقطر 2 O. حافظ على مصفوفة المشتقة من الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. المصفوفات يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية.
  6. إعداد تعليق خلية الثانوي (على سبيل المثال، البذر الخلايا الكيراتينية على أعلى F-حصيرة).
    1. نضح برنامج تلفزيوني 1X.
    2. البذور 50،000 الكيراتينية على رأس مصفوفة المشتقة من خلية (و حصيرة). السماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها، في مئوية الحاضنة 37 درجة في 5٪ CO 2.
      ملاحظة: يمكن إجراء فحوصات مباشرة على الخلايا الملتصقة.

5. توصيف الخلويمصفوفة المشتقة

  1. المناعية فلوري: ارجع إلى بروتوكول 2.
  2. تدخل انعكاس المجهر
    1. خلايا البذور إلى coverslips الزجاج، وبعد بروتوكول 4،1-4،5.
    2. بعد الحصول على مصفوفة المشتقة من الخلايا، وتحديد العينات التالية بروتوكول 2.2.
      ملاحظة: تلطيخ الجسم المضاد هو اختياري. إذا لزم الأمر، الرجوع إلى بروتوكول 2.3.
    3. أداء الحصول على الصور باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر مع الهدف النفط 40X / 1.30. تعيين الثقب في 74 ملم.
    4. استخدام LP 505 لإعادة فلوريدا ection المجهري (IRM) قناة تدخل وبي بي 575-615 الأشعة تحت الحمراء لفلوريدا uorescence القناة الحمراء للمرشحات. استخدام NT 80/20 لقناة IRM وهفت 405/488/561، NFT 565، لوحة لفلوريدا uorescence القناة الحمراء للمقسم الأشعة. استخدام الليزر التالية: DPSS 561-10 (الطول الموجي 561 نانومتر) في قوة 1.1٪ لفلوريدا uorescence القناة الحمراء وHeNe633 (الطول الموجي 633 نانومتر) في قوة 5.0٪ للقناة IRM.

6. 3D عضوي الجلد المشارك الثقافة

  1. يلقي الكولاجين جل، مع الخلايا الليفية مغلف، في خلية ثقافة إدراج (6-جيدا شكل لوحة).
    1. قسامة 10 مل من ذيل فأر نوع الكولاجين أنا إلى دورق البارد.
    2. إضافة 1 مل من DMEM البارد. إضافة 0.5 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم لتحييد الكولاجين الحمضية. إضافة 0.5 مل من تعليق الخلايا الليفية (التي تحتوي على 1،200،000 الخلايا الليفية).
    3. نقل الحل، في ماصة البرد، إلى إدراج خلية الثقافة في لوحة 6 جيدا. 12 مل من محلول الكلي ينقسم بالتساوي إلى 6 إدراج خلية ثقافة.
    4. احتضان جل في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، لمدة 1 ساعة.
    5. بعد أن عزز الجل، غمر جل في FM. بعد 24 ساعة، تجاهل وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة، التي تحتوي على crowders الجزيئات. إضافة حجم 2 مل إلى الداخل من إدراج خلية ثقافة و 2 مل إلى الخارج من إدراج خلية ثقافة.
  2. بعد 24 ساعة،البذور الخلايا الكيراتينية على رأس جل الكولاجين.
    1. يعرض للتريبسين القرنية باستخدام 0.125٪ كيل التربسين / مخلبية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استفادة الجانبين من القارورة بلطف لإزاحة الخلايا وتحييد التربسين مع وسائل الاعلام المصل يحتوي على. عد الخلايا وإعداد تعليق الخلايا الكيراتينية (300،000 الخلايا الكيراتينية في هلام، وعلقت في 200 وسائل الاعلام ميكرولتر).
    2. نضح وسائل الإعلام القديمة من إدراج خلية ثقافة. إضافة الكيراتينية على أعلى من هلام.
    3. احتضان جل في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، لمدة 1 ساعة.
    4. بعد الكيراتينية وتعلق على سطح هلام، غمر هلام مع KSFM 2 مل أو CNT-57 إلى الداخل من إدراج خلية ثقافة و 2 مل من وزير الخارجية إلى الخارج من إدراج خلية ثقافة.
  3. بعد 24 ساعة، تجاهل وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة، التي تحتوي على crowders الجزيئات.
  4. بعد 7 أيام من ثقافة المغمورة، ورفع الثقافة إلى واجهة الهواء السائل.
    1. نقل خصوصيات خلية ثقافةERT إلى لوحة في آبار عميقة. إضافة 10 مل سائل الإعلام الطبقية إلى الخارج من إدراج خلية ثقافة. الحفاظ على المناطق الداخلية من خلية ثقافة إدراج الجافة.
  5. احتضان الثقافات في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 وتغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام، لمدة 14 يوما القادمة.
    ملاحظة: بعد 2 أسابيع في واجهة الهواء السائل، أي ما يعادل الجلد ناضجة ويمكن حصاده (إما المفاجئة المجمدة أو الفورمالين ثابتة).

7. الحصاد وتوصيف عضوي حكمه الجلد

  1. وسائل الاعلام نضح الطبقية.
  2. باستخدام الملقط، ونقل إدراج الثقافة على منشفة ورقية وربت بعيدا سائل الإعلام المتبقية من قاعدة إدراج.
  3. باستخدام مشرط، وقطع على طول محيط الداخلي للإدراج الثقافة.
  4. إصلاح عضوي النمط الجلد شارك في ثقافة (جنبا إلى جنب مع غشاء PET).
    1. التقط تجميد
      1. نقل بناء هلام لcryomold. تغطية المناطق الداخلية من cryomold مع أكتوبرمركب. وضع cryomold في النيتروجين السائل لمدة 10 ثانية.
      2. باستخدام الملقط، وإزالة cryomold المجمدة من النيتروجين السائل، والتفاف في رقائق الألومنيوم وتخزين العينات المجمدة في الفريزر -80 درجة مئوية.
      3. قسم تجميد العينات مع ناظم البرد، مع سمك الباب من 7 ميكرون.
    2. الفورمالين التثبيت
      1. وضع "الاسفنج وسادة الخزعة 'في' كاسيت خزعة". نقل هلام بناء على لوحة الاسفنج. وضع الاسفنج وسادة أخرى بلطف على أعلى بناء هلام. إغلاق الكاسيت.
      2. يغرق بالكامل الكاسيت في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لمدة 48 ساعة، في درجة حرارة الغرفة. إزالة كاسيت والتخلص من النفايات من الفورمالين.
      3. تضمين عينة ثابتة في كتلة الشمع من قبل التجفيف أولا مع سلسلة الايثانول ومن ثم التسلل تدريجيا العينة مع الشمع. قسم كتلة الشمع مع مشراح.
  5. توصيف ما يعادل الجلد
    1. المناعية
      1. لأقسام المجمدة:
        1. احتضان المقاطع في مصل الماعز 10٪ (المخفف في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أقسام غسيل في برنامج تلفزيوني 1X لإزالة مصل الماعز.
        2. احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية (1: 100 التخفيف في مصل الماعز 10٪) لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X، ثلاث مرات، 5 دقائق لكل يغسل.
        3. احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية (1: 400 التخفيف في مصل الماعز 10٪) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في وعاء مغطى بورق الألمنيوم. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X، ثلاث مرات، 5 دقائق لكل يغسل.
        4. جبل الشرائح، مع تصاعد وسائل الإعلام، على ساترة. عينات غطاء بورق الألمنيوم وتسمح لتجف بين عشية وضحاها.
        5. صورة باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف النفط 40X / 1.30.
      2. لالفورمالين الثابتة البارافين أقسام جزءا لا يتجزأ من:
        1. أقسام Dewax (وترطيب) في تنازلي النسب المئوية من الايثانول في الماء (الزيلين - الإيثانول بنسبة 100٪- 90٪ من الإيثانول - 80٪ من الإيثانول - 70٪ من الإيثانول - الماء). غمر تماما العينات في الحلول. يجب أن تكون كل خطوة dewaxing 3 دقائق.
        2. احتضان المقاطع في 1٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 30 دقيقة. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق.
        3. احتضان المقاطع في حل سترات (يذوب 10 مل من محلول سترات في 90 مل من الماء) في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تسمح الشرائح لتهدئة بين عشية وضحاها، في درجة حرارة الغرفة. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X، ثلاث مرات، 5 دقائق لكل يغسل.
        4. احتضان المقاطع في مصل الماعز 10٪ (المخفف في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. أقسام غسيل في برنامج تلفزيوني 1X لإزالة مصل الماعز.
        5. احتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية (1: 100 التخفيف في مصل الماعز 10٪) لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
        6. احتضان المقاطع مع البوليمر المسمى HRP (لم تهذبها) لمدة 30 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
        7. إلى أنبوب microcentrifuge، والجمع بين 1 ملDAB الركيزة (3،3'-diaminobenzidine) مع 1 قطرة من مولد اللون. احتضان المقاطع مع هذا الحل لمدة 15 ثانية - 5 دقيقة (اللون البني = إشارة إيجابية).
        8. لوقف رد الفعل، وغسل المقاطع في المياه الجارية.
        9. مباين نوى مع الهيماتوكسيلين، لمدة 5 دقائق. شطف المقاطع في المياه الجارية.
        10. احتضان المقاطع في حل الكحول الحمضية، لمدة 1 دقيقة. شطف المقاطع في المياه الجارية.
        11. احتضان المقاطع في حل ماء الصنبور سكوت، لمدة 2 دقيقة. شطف المقاطع في المياه الجارية.
        12. اختياري: احتضان المقاطع في يوزين لمدة 1 دقيقة، ويغسل في الماء الجاري.
        13. يذوى المقاطع في نسب تصاعدي من الإيثانول حتى الزيلين (الايثانول 70٪ - 80٪ من الإيثانول - 90٪ من الإيثانول - 100٪ من الإيثانول - زيلين). التأكد من أن العينات وغرقت بالكامل لمدة 3 دقائق لكل مرحلة.
        14. جبل الشرائح، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة، إلى ساترة. الهواء الجاف بين عشية وضحاها.
        15. صورة باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف النفط 40X / 1.30.
    2. انتقال المجهر الإلكتروني (لتصور رسو الألياف)
      1. إصلاح عينات في 2.5٪ غلوتارالدهيد لمدة 72 ساعة.
      2. غسل العينات في برنامج تلفزيوني 1X، ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل يغسل.
      3. مقطعة إلى قطع صغيرة (1 ملم 3). عينات ما بعد الإصلاح في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل العينات في الماء المقطر.
        تحذير: رباعي أكسيد الأوزميوم غير سامة وسامة ويجب التعامل معه بحرص شديد في غطاء الدخان.
      4. يذوى العينات من خلال سلسلة تصاعدي الإيثانول (25٪ من الإيثانول - 50٪ من الإيثانول - 75٪ من الإيثانول - 95٪ من الإيثانول - 100٪ من الإيثانول - الأسيتون) لمدة 20 دقيقة لكل خطوة.
      5. التسلل عن طريق نقع العينات في 100٪ الأسيتون: الراتنج araldite (1: 1) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم في 1: 3 لمدة 1 ساعة، تليها 1: 6 ليلة وضحاها. نقع العينة في الراتنج araldite جديدة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، تليها التغيير الثاني من راتنج araldite جديدة لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية. مغادرة الطازجة الثالثتغيير الراتنج raldite لمدة 1 ساعة على 45 درجة مئوية، ويترك الطازجة تغيير الراتنج araldite الرابع لمدة 1 ساعة عند 50 درجة مئوية.
      6. احتضان العينات عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح البلمرة.
      7. عينات القسم باستخدام سكين الزجاج، للحصول على أقسام شبه رقيقة بسمك 1 ميكرون. قسم صمة عار مع الميثيلين الأزرق لمراقبة الأنسجة. القسم العينة للحصول على أقسام رقيقة جدا من 70 نانومتر، وجمع كل قسم على شبكة النحاس.
      8. أقسام وصمة عار مع 5٪ من محلول خلات اليورانيل لمدة 15 دقيقة تليها 3٪ محلول الرصاص سترات لمدة 10 دقيقة.
      9. الحصول على صور مع المجهر الإلكتروني النافذ (100 كيلو فولت)، في التكبير من 30،000X.

النتائج

كان الزحام الجزيئات قادرة على تعزيز ECM الترسيب، وعلى وجه الخصوص، الخلايا الليفية أودعت المزيد من الكولاجين الأول والرابع والفيبرونكتين مقارنة للسيطرة على الثقافات (الشكل 1، طبقة الخليوي، 1A، والكولاجين الأول؛ 1B، الكولاج...

Discussion

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

Disclosures

The authors have no conflicting interests to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidWako013-12061Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)Greiner Bio-One657610Organotypic cultures
Citrate solutionDakoS2369DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)Corning354236Organotypic cultures
CnT-57CELLnTECCnT-57Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kitDakoK3468Histology
Deep-well plate (6-well format)Corning355467Organotypic cultures
ECL detection reagentGE Healthcare Life SciencesRPN2106Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM) JEOL  JEM-1010 (100kV)Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70GE Healthcare Life Sciences17-0310-05Macromolecular crowder
Ficoll PM400GE Healthcare Life Sciences17-0300-05Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)Life Technologies17005-042Cell culture media
Lysis bufferThermoFisher Scientific89900Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. 
MicroscopeZeissLSM510Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)National DiagnosticsHS-106Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)ThermoFisher Scientific8310-16Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)Sakura4583Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibioticsSigma AldrichA5955Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibodyAbcam#ab6308
Anti-Collagen Type IVNovocastra#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VIILH7.2 (in house) 
Anti-Fibronectin antibodyAbcam#ab2413
Reducing agent ThermoFisher ScientificNP0009Western blot
Sample bufferThermoFisher ScientificNP0008Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma Aldrich#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-11037 
AlexaFluor 594 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific #A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific#A-11001
Secondary antibodies (HRP)DakoEnvision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouseundiluted
Sodium deoxycholateProdotti Chimicie AlimentariDecellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12   Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisoneUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
TrypsinBiopolis Shared Facilities0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3 Used to trypsinize cells

References

  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114 2D 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved