Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per ottenere matrici derivati ​​dalle cellule ricche di proteine ​​della matrice extracellulare, utilizzando Crowders macromolecolari (MMC). Inoltre, vi presentiamo un protocollo che incorpora MMC nella generazione di pelle co-coltura organotipica 3D, che riduce i tempi di cultura, pur mantenendo la maturità di costrutto.

Abstract

La famiglia glicoproteina di collagene rappresenta i principali proteine ​​strutturali del corpo umano, e sono componenti chiave di biomateriali utilizzati in ingegneria dei tessuti moderni. Una strozzatura tecnica è la deposizione di collagene in vitro, come è notoriamente lento, causando formazione sub-ottimale del tessuto connettivo e successiva coesione dei tessuti, soprattutto nei modelli della pelle. Qui, si descrive un metodo che prevede l'aggiunta di copolimeri saccarosio differenzialmente dimensioni per culture pelle per generare macromolecolari affollamento (MMC), che si traduce in un miglioramento drammatico della deposizione di collagene. In particolare, fibroblasti dermici depositato una notevole quantità di collagene I / IV / VII e fibronectina in MMC rispetto ai controlli.

Il protocollo descrive anche un metodo per decellularize strati cellulari affollate, esponendo quantità significative di matrice extracellulare (ECM) che sono stati trattenuti sulla superficie cultura come evidenziato da immunocytochemistry. modello di massa e la distribuzione di matrice totale è stata studiata usando la microscopia interferenze riflessione. È interessante notare che le matrici, i fibroblasti, cheratinociti e co-culture producevano derivati ​​dalle cellule (CDM) di varia composizione e morfologia. CDM potrebbe essere utilizzato come "bio-scaffold" per la semina cella secondaria, dove l'attuale uso di rivestimenti o ponteggi, in genere da fonti animali xenogeniche, può essere evitato, così spostando verso applicazioni più clinicamente rilevante.

Inoltre, questo protocollo descrive l'applicazione della MMC durante la fase di immersione di un modello 3D-organotipica pelle co-coltura che era sufficiente per migliorare la deposizione di ECM nella giunzione dermo-epidermica (GDE), in particolare, collagene VII, il componente principale di ancoraggio fibrille. La microscopia elettronica ha confermato la presenza di ancoraggio fibrille in culture sviluppate con MMC, rispetto ai controlli. Ciò è significativo come fibrille di ancoraggio Tether il derma all'epidermide, di conseguenza,avere un preformato maturo DEJ può beneficiare destinatari trapianto di pelle in termini di stabilità del trapianto e la guarigione delle ferite nel complesso. Inoltre, il tempo di coltura è stato condensato da 5 settimane a 3 settimane per ottenere un costrutto matura, quando si utilizza MMC, riducendo i costi.

Introduzione

La pelle forma una barriera protettiva prevenendo la perdita di acqua e l'ingresso del patogeno. Esso è costituito da tre componenti principali; derma ricchi stromali ^1, un stratificati epidermide ^2,3,4 su di esso, e la giunzione dermo-epidermica tra ^5,6. Il derma è composto in gran parte da fibre collagene ed elastiche ed è scarsamente popolate con fibroblasti ^7. Al contrario, l'epidermide ricco di cellule è composto da più strati di cheratinociti. I cheratinociti dello strato più interno sono proliferative e forniscono nuove cellule basali che rinnovano e sostituiscono cheratinociti terminali di differenziazione che si muovono continuamente al più esterno strato di pelle e hanno perso i nuclei e materiale citoplasmatico, causando uno strato corneo che subisce desquamazione.

La giunzione dermo-epidermica, un tipo specifico di membrana basale, è una struttura complessa composta comunicanti molecole della matrice, che tetheRS l'epidermide al derma. Collagene I fibre del derma si intrecciano con il collagene VII ancoraggio fibrille che sono ancorati al collagene IV ricco lamina densa. filamenti di ancoraggio (laminina 5, collagene XVII e integrine) a loro volta collegano la densa lamina con emidesmosomi di cheratinociti basali. cheratinociti basali (strato germinativo) hanno la capacità di proliferare e rinnovare, nonché differenziare e stratificare per formare gli strati soprabasali; strato spinoso, strato granuloso, ed infine lo strato corneo, che rappresenta la superficie di contatto della pelle con l'ambiente. tragitto dallo strato basale allo strato corneo, cheratinociti passare pattern di espressione di citocheratine e infine apoptosi e si racchiudono in cornified buste, gusci di proteine ​​specifiche che sono covalente reticolati dall'attività transglutaminasi.

Ricreare pelle ed i suoi strati in vitro, incluse le complesse strutture della giunzione dermo-epidermica e della matrice extracellulare dermica, e di emulare il processo di cheratinizzazione, ha gli scienziati lungo incuriosito e bioingegneri come un compito impegnativo. Ci sono stati progressi significativi in ingegneria dei tessuti della pelle, per esempio, l'estrazione di successo di cellule della pelle da biopsie di pazienti e la generazione di colture organotipiche pelle utilizzando le cellule della pelle di pazienti di derivazione ^8. Tuttavia, rimangono problemi irrisolti relativi alla scarsa secrezione di proteine ​​della matrice extracellulare dalle cellule stesse e conseguente modelli di cute sub-ottimali. Inoltre, il tempo necessario per generare co-coltura organotipica pelle 3D utilizzando i protocolli attuali varia tra i quattro a otto settimane, un lasso di tempo che potrebbe potenzialmente essere ridotto con l'incorporazione di Crowders macromolecolari. Ridurre il tempo cultura risparmiare costi reagente, riduce l'incidenza di senescenza cellulare e riduce il tempo di attesa del paziente deve utilizzare il prodotto in clinica.

t "> macromolecolare affollamento (MMC) comporta l'introduzione di macromolecole specifiche al mezzo di coltura per generare effetti di volume esclusi. Questi colpiscono velocità di reazione enzimatici tra cui il taglio proteolitico di procollagene che è tardiva in condizioni di coltura acquose standard di ^9-13. Sotto MMC, reazioni enzimatiche sono accelerato senza aumentare la quantità di reagenti ^14,15 conseguente, nel caso di procollagene clivaggio, una maggiore quantità di collagene I molecole in culture affollate rispetto ai controlli affollate ^10. come la conversione di procollagene al collagene permette la formazione del collagene assemblee, colture di fibroblasti con MMC per 48 ore ha prodotto significativamente più collagene I rispetto a colture di fibroblasti affollate monitorati fino a quattro settimane ^11,16,17. Oltre effetti sulle attività enzimatiche che riguardano la formazione, la stabilizzazione e il rimodellamento della ECM, MMC anche ha dimostrato di migliorare direttamente e modulare collagenela formazione di fibra ^18,19.

Presentiamo qui un metodo per aumentare la produzione di matrice extracellulare (ECM) da parte delle cellule della pelle, in particolare, fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici. Inoltre, dimostriamo che l'ECM arricchito prodotto in MMC in colture monostrato può essere decellularized e usato come matrice di puro derivato dalle cellule (CDM).

Usiamo un approccio non convenzionale di visualizzare e pienamente apprezzare l'ECM depositato da cellule della pelle in coltura con MMC. Interferenza riflessione microscopia è in genere utilizzato per lo studio delle interazioni cellula-matrice o cellula-vetro punti di contatto. Questa tecnica è stata utilizzata nel nostro sistema per visualizzare la quantità totale di matrice depositato sulla superficie del vetro. Interferenza riflessione microscopia è stata accoppiata con immunocolorazione fluorescente avere la maggior quantità di informazioni in termini di composizione della matrice extracellulare e modello, in presenza e assenza di MMC.

Organotypic pelle co-culture è un metodo classico per modellare la pelle in vitro in un contesto tridimensionale. Mentre bidimensionali co-culture possono fornire informazioni significative, è limitato quando traduce questi dati e l'applicazione di nuovo a un ambiente in vivo, che è intrinsecamente una struttura tridimensionale. cheratinociti della pelle, in particolare, sono polarizzati e contengono segmenti apicali e basali che sono essenziali per l'omeostasi e l'adesione cellulare. Inoltre, l'espressione di proteine ​​tipiche soprabasali nei cheratinociti sopra strato basale, come la cheratina 1, cheratina 10 e filaggrina è presente solo nel corso di stratificazione e differenziazione terminale dei cheratinociti. Come differenziazione terminale è poco presente nelle culture tipiche monostrato, espressione della proteina soprabasale è normalmente non raggiunto in questo sistema di coltura. Pertanto, colture organotipiche iniziano immersi in terreno di coltura, ma vengono poi sollevati ad una interfaccia aria-liquido per guidare keratinocyte differenziazione. Ciò si traduce in l'espressione di marcatori di stratificazione, anche cheratinizzazione e un generalmente migliore riflessione della epidermica fisiologia. Mentre altri gruppi hanno generato in precedenza co-colture di pelle organotipica con successo, la creazione di una zona di giunzione dermo-epidermica funzionale è stato un problema. Qui, vi presentiamo un nuovo metodo per la coltura co-colture di pelle organotipica con una membrana basale maggiore, in un lasso di tempo condensato e senza compromettere la maturità di questi costrutti. Ciò fornirebbe mimetici della pelle per la modellazione in vitro, lo studio della biologia della pelle e un assortimento di test di screening.

Protocollo

1. macromolecolare affollamento in 2D Culture delle cellule della pelle

1. Seme 50.000 cellule (fibroblasti primarie o cheratinociti primari o co-coltura di fibroblasti e cheratinociti primari) per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. cellule seme in 1 ml di mezzi di crescita tipo di cella corrispondente.
2. Consentono alle cellule di aderire durante la notte, in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2.
3. Eliminare vecchi media e sostituirlo con 1 ml mezzi freschi contenente Crowders macromolecolari e acido ascorbico 100 micron. Utilizzare un cocktail Crowder comprensivi di 37,5 mg / ml Ficoll 70 e 25 mg / ml Ficoll 400. Uso fibroblasti supporti (FM) costituito da DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di antibiotici penicillina-streptomicina. Crescere cheratinociti in un supporto privo di siero, KSFM o CNT-57. Mantenere co-culture in una miscela di 50% FM e supporto privo di siero 50%.
4. Incubare culture per 6 giorni in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2, con una media cambia ogni 2 giorni.

2. Immunocolorazione fluorescente su colture cellulari della pelle

1. Lavare colture di cellule due volte con PBS 1x.
2. Fissare colture cellulari con metanolo o paraformaldeide (a seconda delle specifiche anticorpi).
   1. Per Metanolo Fixation
      1. Aliquota 500 ml di metanolo freddo in ogni canale e incubare a -20 ° C per 10 minuti. Aspirare fissativo e scartare rifiuti metanolo. aria secca in una cappa laminare fumi.
   2. Per Paraformaldeide Fixation
      1. Aliquotare 500 ml di soluzione di paraformaldeide al 2% in ogni pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 15 min. Aspirare fissativo e scartare rifiuti paraformaldeide.
      2. Lavare con PBS 1x, per tre lavaggi, a 5 minuti a lavaggio.
      3. Aliquota 1 ml di PBS 1x in ogni pozzetto.
3. Immunocolorazione fluorescente utilizzando anticorpi
   1. Aliquotare 500 ml di 3% di albumina sierica bovina (diluito in PBS 1x) in ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Aspirare la soluzione di saturazione e scartare.
   2. anticorpo primario
      1. Per l'imaging direttamente dalla piastra: Aliquotare 200 ml di anticorpo primario (diluizione 1: 100 in 10% siero di capra) soluzione in ciascun pozzetto e incubare per 90 min a temperatura ambiente.
      2. Per coprioggetto: Aliquota 50 ml di anticorpo primario (diluizione 1: 100 nel 10% siero di capra), soluzione su un pezzo di Parafilm. Posizionare coprioggetto sul Parafilm, con la cellula-laterale (parte del vetrino con le cellule) rivolto verso la soluzione. Coprire l'intera cella-side, senza bolle. Incubare per 90 minuti a temperatura ambiente.
   3. soluzione anticorpo primario Aspirare e scartare.
   4. Lavare con PBS 1x, per tre lavaggi, a 5 minuti a lavaggio.
   5. anticorpo secondario
      1. Per l'imaging direttamente dalla piastra: Aliquotare 200 ml di anticorpo secondario (1: 400 diluizione 10% siero di capra) soluzione in ogni pozzetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente, che copre la piastra in alluminio fo I l.
      2. Per coprioggetto: Aliquota 50 ml di anticorpo secondario (1: 400 diluizione nel 10% siero di capra), soluzione su un pezzo di Parafilm. Posizionare coprioggetto sul Parafilm, con la cellula-laterale (parte del vetrino con le cellule) rivolto verso la soluzione. Coprire l'intera cella-side, senza bolle. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, che copre il Parafilm con un foglio di alluminio.
   6. soluzione di anticorpo secondario Aspirare e scartare.
   7. Lavare con PBS 1x, per tre lavaggi, a 5 minuti a lavaggio. Aliquota 1 ml di PBS 1x in ogni pozzetto.
   8. Montaggio
      1. Per l'imaging direttamente dal piatto: non montare. Procedere al microscopio.
      2. Per l'imaging di vetrini coprioggetto: Montagna, in mezzo di montaggio, su un vetrino. asciugare per una notte in un recipiente coperto con un foglio di alluminio. Procedere al microscopio.
4. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un 40X / 1.30 Obiettivo olio.

e "> 3. Western Blotting di colture di cellule della pelle

1. Lavare strati di cellule due volte con PBS 1x.
2. Aliquota 100 ml di tampone di lisi (vedi Materiali List) in ciascuna (formato 6 pozzetti) bene. Raschiare lo strato di cellule con un raschietto cellulare e la soluzione di trasferimento in una provetta.
3. soluzione Centrifugare a 15.330 xg per 30 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un'altra provetta e scartare il pellet.
4. Mescolare 13 ml di ogni campione con 5 ml di tampone campione e 2 ml di agente riducente (vedi Lista dei materiali). campioni di calore a 95 ° C per 10 min.
5. Centrifugare i campioni a 15.330 xg per 1 min per la raccolta dell'acqua di condensa. Caricare i campioni in un gel PAGINA prefabbricati e funzionare a 100 V per circa 1 ora.
6. Per trasferire proteine ​​separate su una membrana di nitrocellulosa, a sandwich il gel e la membrana tra pezzi di carta e spugne (della stessa dimensione). Assicurarsi che non vi siano bolle tra i gel, membrane, carte e spugnaS. Chiudere la cassetta panino ed eseguire il trasferimento a 70 V per a 2 ore.
7. Per verificare se il trasferimento è stato completato, incubare la membrana con 10 ml di membrana Ponceau S. Lavare con 0,1% di PBS-Tween-20, per tre volte, a 10 minuti a lavaggio.
8. Blocco con 10 ml di 5% di latte per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare membrana con 0,1% PBS-Tween-20, per tre volte, 10 min a lavaggio.
9. Incubare con 10 ml anticorpo primario per 90 min (topo anti-collagene VII, LH 7.2, 1: 1000 diluizione 5% latte). Lavare membrana con 0,1% PBS-Tween-20, per tre volte, 10 min a lavaggio.
10. Incubare con 10 ml anticorpo secondario per 30 min (capra anti-topo-HRP, 1: 2.000 diluizione 5% latte). Lavare membrana con 0,1% PBS-Tween-20, per tre volte, 10 min a lavaggio.
11. Trasferire la membrana di una cassetta e aggiungere 1 ml di ECL Detection Reagent. Posizionare un chiaro foglio sottile di plastica sopra la membrana.
12. Per rilevare la chemiluminescenza, inserire una pellicola fotosensibile sopra il foglio di plastica e chiudere il cassetto. dopo 2-5 Min, togliere la pellicola dalla cassetta e posto in uno sviluppatore.

4. Fare e utilizzo di una matrice di celle di derivazione

1. Seme 50.000 cellule (fibroblasti primarie o cheratinociti primari o co-coltura di fibroblasti e cheratinociti primari) per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
2. Consentono alle cellule di aderire durante la notte, in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2.
3. Eliminare vecchi media e sostituirli con mezzi freschi contenente Crowders macromolecolari e acido ascorbico 100 micron. Il cocktail Crowder consiste di 37,5 mg / ml Ficoll 70 e 25 mg / ml Ficoll 400. mezzi di fibroblasti (FM) è costituito da DMEM supplementato con 10% FBS e 1% pen-strep. Cheratinociti sono coltivate in un mezzo privo di siero, KSFM o CNT-57. Mantenere co-culture in una miscela di 50% e 50% FM KSFM o CNT-57.
4. Incubare culture per 6 giorni in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2, cambiando i media ogni 2 giorni.
5. Decellularize strati di cellule per ottenere un Matri derivato dalle cellulex (f-mat = matrice di fibroblasti di derivazione, k-mat = matrice cheratinociti di derivazione, co-mat = matrice derivata da un co-coltura di fibroblasti e cheratinociti).
   1. Lavare strati di cellule due volte in PBS 1x.
   2. Aggiungere 250 ml di desossicolato di sodio allo 0,5%. Incubare, in ghiaccio, per 10 min. lisato cellulare Aspirare.
   3. Ripetere il passaggio 4.5.2 tre volte.
   4. Matrix Wash derivato dalle cellule due volte in H ₂ O distillata O. Mantenere matrice derivato dalle cellule in PBS 1x. Le matrici possono essere conservati fino a 1 settimana a 4 ° C.
6. Preparare secondaria sospensione cellulare (per esempio, semina cheratinociti sulla parte superiore di f-mat).
   1. Aspirare 1x PBS.
   2. Seed 50.000 cheratinociti sulla parte superiore della matrice cellulare di derivazione (F-mat). Consentono alle cellule di aderire durante la notte, in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2.
      Nota: I saggi possono essere eseguite direttamente sulle cellule aderenti.

5. Caratterizzazione del celluloMatrix derivato

1. immunostaining Fluorescente: Fare riferimento al protocollo 2.
2. Interferenza Riflessione Microscopia
   1. cellule seme su di vetrini, seguito protocollo 4,1-4,5.
   2. Dopo aver ottenuto la matrice di celle di derivazione, fissare i campioni seguenti Protocol 2.2.
      Nota: colorazione anticorpale è opzionale. Se necessario, fare riferimento al protocollo 2.3.
   3. Eseguire acquisizione immagine utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo olio 40X / 1.30. Impostare il foro stenopeico a 74 mm.
   4. Utilizzare LP 505 per la ri fl essione microscopia (IRM) del canale interferenze e BP 575-615 IR per la fluorescenza canale rosso per i filtri. Usa NT 80/20 per il canale IRM e HFT 405/488/561, NFT 565, piatto per la fluorescenza canale rosso per i divisori di fascio. Utilizzare i seguenti laser: DPSS 561-10 (lunghezza d'onda 561 nm) all'accensione 1,1% per la fluorescenza canale rosso e HeNe633 (lunghezza d'onda 633 nm) a potenza 5,0% per il canale IRM.

6. 3D Organotipica pelle Co-cultura

1. Cast a gel di collagene, con fibroblasti Encapsulated, in una cella-cultura Inserisci (formato 6 pozzetti).
   1. Aliquota 10 ml di coda di topo collagene di tipo I per un bicchiere freddo.
   2. Aggiungere 1 ml di DMEM freddo. Aggiungere 0,5 ml di 1 M NaOH per neutralizzare l'acido collagene. Aggiungere 0,5 ml di sospensione dei fibroblasti (contenente 1.200.000 fibroblasti).
   3. Trasferire la soluzione, in una pipetta fredda, agli inserti di coltura cellulare in una piastra da 6 pozzetti. 12 ml di soluzione totale è equamente divisi in 6 inserti di coltura cellulare.
   4. Incubare il gel in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2, per 1 ora.
   5. Dopo il gel è solidificato, immergere il gel in FM. Dopo 24 ore, eliminare i vecchi media e sostituirli con mezzi freschi, contenente Crowders macromolecolari. Aggiungere un volume di 2 ml per l'interno dell'inserto coltura cellulare e 2 ml all'esterno dell'inserto coltura cellulare.
2. Dopo 24 ore,Seed cheratinociti sopra il gel di collagene.
   1. Trypsinize cheratinociti usando 0,125% agente tripsina / chelante per 5 min a 37 ° C. Toccare i lati del pallone delicatamente per rimuovere le cellule e neutralizzare la tripsina con i media siero contenente. Contare le celle e preparare la sospensione dei cheratinociti (300.000 cheratinociti per gel e sospeso in 200 microlitri mezzi).
   2. Aspirare vecchi media da inserto cella-cultura. Aggiungere cheratinociti sulla parte superiore del gel.
   3. Incubare il gel in un incubatore a 37 ° al 5% di CO _2, per 1 ora.
   4. Dopo cheratinociti hanno attaccato alla superficie del gel, immergere il gel con KSFM 2 ml o CNT-57 all'interno dell'inserto coltura cellulare e 2 ml di FM all'esterno dell'inserto coltura cellulare.
3. Dopo 24 ore, eliminare i vecchi media e sostituirli con mezzi freschi, contenente Crowders macromolecolari.
4. Dopo 7 giorni di coltura sommersa, aumentare la coltura a un'interfaccia aria-liquido.
   1. Trasferire gli angoli delle cellule-culturaert ad una piastra profondo bene. Aggiungere 10 ml supporti stratificazione all'esterno dell'inserto coltura cellulare. Mantenere l'interno della cellula-coltura inserto secca.
5. Incubare culture in un incubatore a 37 ° al 5% di CO ₂ e cambiare i media ogni 3 giorni, per i prossimi 14 giorni.
   Nota: Dopo 2 settimane all'interfaccia aria-liquido, la pelle equivalente è maturo e può essere raccolto (o scatto congelato o formalina fisso).

7. Raccolta e caratterizzazione di Organotipica equivalenti pelle

1. mezzi Aspirare stratificazione.
2. Usando le pinzette, trasferire inserisce la cultura su un tovagliolo di carta e tamponare via supporti rimanenti dalla base dell'inserto.
3. Usando un bisturi, tagliare lungo la circonferenza interna dell'inserto cultura.
4. Fissare il organotipica pelle co-coltura (insieme con la membrana PET).
   1. Snap Fermo
      1. Trasferire il costrutto gel per un cryomold. Coprire l'interno della cryomold con ottobrecomposto. Posizionare il cryomold in azoto liquido per 10 sec.
      2. Usando le pinzette, rimuovere il cryomold congelato dal azoto liquido, avvolgerlo in un foglio di alluminio e conservare i campioni congelati in un freezer C -80 °.
      3. Sezione campioni congelati con un criostato, con uno spessore della sezione di 7 micron.
   2. formalina Fixation
      1. Posizionare un 'pad spugna biopsia' nella 'cassetta biopsia'. Trasferire il gel costruire sul tampone spugna. Posizionare un altro spugna pad delicatamente sulla sommità del costrutto gel. Chiudere la cassetta.
      2. Completamente immergere la cassetta in 10% formalina tamponata neutra per 48 ore, a temperatura ambiente. Rimuovere la cassetta e gettare rifiuti in formalina.
      3. Incorporare il campione fissato in un blocco di cera per primo disidratazione con una serie di etanolo e poi infiltrarsi gradualmente il campione con la cera. Sezione il blocco di cera con un microtomo.
5. Caratterizzazione del Equivalente pelle
   1. immunocolorazione
      1. Per sezioni congelate:
         1. Incubare sezioni in siero di capra 10% (diluito in PBS 1x) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le sezioni in 1x PBS per rimuovere il siero di capra.
         2. Incubare sezioni con anticorpo primario (diluizione 1: 100 in 10% siero di capra) per 90 min a temperatura ambiente. Lavare le sezioni in PBS 1x, per tre volte, 5 minuti a lavaggio.
         3. Incubare sezioni con anticorpo secondario (1: 400 diluizione 10% siero di capra) per 30 min a temperatura ambiente, in un contenitore coperto con un foglio di alluminio. Lavare le sezioni in PBS 1x, per tre volte, 5 minuti a lavaggio.
         4. Monte scivola, con mezzo di montaggio, su un coprioggetti. campioni Coprire con un foglio di alluminio e lasciare asciugare durante la notte.
         5. Immagine utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di olio 40X / 1.30.
      2. Per fissati in formalina paraffina Sezioni embedded:
         1. sezioni DEWAX (e reidratare) in ordine decrescente percentuali di etanolo all'acqua (xilene - 100% di etanolo- 90% di etanolo - etanolo 80% - 70% di etanolo - acqua). Completamente immergere i campioni in soluzioni. Ogni passo deparaffinazione dovrebbe essere di 3 min.
         2. Incubare sezioni in perossido di idrogeno 1% per 30 min. Lavare le sezioni in PBS 1x per 5 min.
         3. Incubare sezioni in soluzione di citrato (10 ml di soluzione di citrato viene disciolto in 90 ml di acqua) a 120 ° C per 20 min. Lasciare le diapositive raffreddare durante la notte, a temperatura ambiente. Lavare le sezioni in PBS 1x, per tre volte, 5 minuti a lavaggio.
         4. Incubare sezioni in siero di capra 10% (diluito in PBS 1x) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le sezioni in 1x PBS per rimuovere il siero di capra.
         5. Incubare sezioni con anticorpo primario (diluizione 1: 100 in 10% siero di capra) per 90 min a temperatura ambiente. Lavare le sezioni in PBS 1x, per tre volte, a 10 minuti a lavaggio.
         6. Incubare sezioni con polimero HRP-marcato (non diluito) per 30 minuti, a temperatura ambiente. Lavare le sezioni con PBS 1x, per tre volte, a 10 minuti a lavaggio.
         7. Per una provetta, unire 1 mlDAB Substrate (3,3 'Diaminobenzidina) con 1 goccia di cromogeno. Incubare le sezioni con questa soluzione per 15 sec - 5 min (colore marrone = segnale positivo).
         8. Per fermare la reazione, lavare sezioni in acqua corrente.
         9. nuclei Controcolorare con ematossilina, per 5 min. Sciacquare sezioni in acqua corrente.
         10. Incubare sezioni in soluzione alcolica acida, per 1 min. Sciacquare sezioni in acqua corrente.
         11. Incubare sezioni in soluzione acqua di rubinetto di Scott, per 2 min. Sciacquare sezioni in acqua corrente.
         12. Opzionale: incubare sezioni in eosina per 1 min e lavare in acqua corrente.
         13. Disidratare sezioni in percentuali crescenti di etanolo per xilene (70% di etanolo - 80% di etanolo - 90% di etanolo - 100% di etanolo - xilene). Assicurarsi che i campioni siano completamente sommersi per 3 minuti per ogni fase.
         14. Monte diapositive, utilizzando supporti di montaggio, ad un coprioggetti. Air asciugare per una notte.
         15. Immagine utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di olio 40X / 1.30.
   2. Microscopia elettronica a trasmissione (per visualizzare ancoraggio fibrille)
      1. Fissare i campioni in glutaraldeide al 2,5% per 72 ore.
      2. Lavare i campioni in 1x PBS, tre volte, 10 min a lavaggio.
      3. Tagliare a piccoli pezzi (1 mm ^3). campioni post-fix in 1% tetrossido di osmio, pH 7,4, per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i campioni in acqua distillata.
         Attenzione: tetrossido di osmio è velenoso e tossico e devono essere maneggiati con cura in una cappa aspirante.
      4. Disidratare i campioni attraverso una serie ascendente di etanolo (25% di etanolo - 50% di etanolo - 75% di etanolo - etanolo al 95% - 100% di etanolo - acetone) per 20 minuti per passo.
      5. Infiltrati immergendo campioni in 100% acetone: resina araldite (1: 1) per 30 minuti a temperatura ambiente e poi a 1: 3 per 1 ora, seguito da 1: 6 overnight. Immergere campione in resina araldite fresco per 2 ore a temperatura ambiente, seguito da un secondo cambiamento di resina araldite fresco per 1 ora a 40 ° C. Lasciare il terzo un frescocambiamento resina raldite per 1 ora a 45 ° C e lasciare il quarto cambiamento resina araldite fresco per 1 ora a 50 ° C.
      6. Incubare i campioni a 60 ° C per 24 ore per permettere la polimerizzazione.
      7. campioni sezione utilizzando un coltello di vetro, per ottenere sezioni semi-sottili con spessore di 1 micron. sezione macchia con blu di metilene per osservare l'istologia. Sezione del campione per ottenere sezioni ultra-sottili di 70 nm e raccogliere ogni sezione su una griglia di rame.
      8. sezioni macchia con soluzione di acetato di uranile 5% per 15 minuti seguiti da soluzione citrato di piombo 3% per 10 min.
      9. Acquisire immagini con un microscopio elettronico a trasmissione (100 kV), con un ingrandimento di 30,000X.

Risultati

Affollamento macromolecolare è stato in grado di migliorare la deposizione di ECM, in particolare, fibroblasti depositati più collagene I, IV e fibronectina rispetto controllare culture (Figura 1, strato cellulare, 1A, collagene I, 1B, collagene IV; 1C, fibronectina). Su decellularization, era evidente che i fibroblasti sono stati i principali depositanti di collagene I, IV e fibronectina rispetto ai cheratinociti

Discussione

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks²⁰. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Wako	013-12061	Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)	Greiner Bio-One	657610	Organotypic cultures
Citrate solution	Dako	S2369	DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)	Corning	354236	Organotypic cultures
CnT-57	CELLnTEC	CnT-57	Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kit	Dako	K3468	Histology
Deep-well plate (6-well format)	Corning	355467	Organotypic cultures
ECL detection reagent	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM)	JEOL	JEM-1010 (100kV)	Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)			High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70	GE Healthcare Life Sciences	17-0310-05	Macromolecular crowder
Ficoll PM400	GE Healthcare Life Sciences	17-0300-05	Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)	Life Technologies	17005-042	Cell culture media
Lysis buffer	ThermoFisher Scientific	89900	Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer.
Microscope	Zeiss	LSM510	Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)	National Diagnostics	HS-106	Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)	ThermoFisher Scientific	8310-16	Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)	Sakura	4583	Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibiotics	Sigma Aldrich	A5955	Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibody	Abcam	#ab6308
Anti-Collagen Type IV	Novocastra	#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VII			LH7.2 (in house)
Anti-Fibronectin antibody	Abcam	#ab2413
Reducing agent	ThermoFisher Scientific	NP0009	Western blot
Sample buffer	ThermoFisher Scientific	NP0008	Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma Aldrich	#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	#A-11037
AlexaFluor 594 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific	#A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit	ThermoFisher Scientific	#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouse	ThermoFisher Scientific	#A-11001
Secondary antibodies (HRP)	Dako	Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse	undiluted
Sodium deoxycholate	Prodotti Chimicie Alimentari		Decellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisone			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrin			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine			Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Trypsin	Biopolis Shared Facilities	0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3	Used to trypsinize cells