JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для получения клеточных производных матрицы, богатые белками внеклеточного матрикса, используя высокомолекулярные crowders (MMC). Кроме того, мы приводим протокол, который включает MMC в 3D органотипического поколения кожи сокультуры, что сокращает время, сохраняя при этом культуру зрелости конструкции.

Аннотация

Гликопротеина семейство коллагенов представляет основные структурные белки в организме человека, и являются ключевыми компонентами биоматериалов, используемых в современной тканевой инженерии. Технический узкое место является отложение коллагена в пробирке, как это известно , медленно, что приводит к неоптимальной образованию соединительной ткани и последующего сцепления тканей, особенно в моделях кожи. Здесь мы опишем метод, который включает в себя добавление дифференцированно размера сахарозы сополимеров в культурах кожи для создания макромолекулярных Crowding (MMC), что приводит к резкому повышению отложения коллагена. В частности, дермальные фибробласты на хранение значительное количество коллагена I / IV / VII и фибронектина при MMC, по сравнению с контрольной группой.

Протокол также описывает способ decellularize переполненном клеточных слоев, подвергая значительные количества внеклеточного матрикса (ЕСМ), которые были сохранены на поверхности культуры, о чем свидетельствует immunocytochemistry. Общая картина матрицы масс и распределение было изучено с использованием интерференции отражения микроскопии. Интересно, что фибробласты, кератиноциты и сокультурах полученные клеточные производные матрицы (МЧР) различного состава и морфологии. МЧР может быть использован как "био-строительные леса» для вторичного посева клеток, где текущее использование покрытий или строительных лесов, как правило, от ксеногенных животных источников, можно избежать, таким образом, переход к более клинически значимых приложений.

Кроме того, этот протокол описывает применение MMC при глубинном фазы 3D-Органотипической кожи модели совместного культивирования, который достаточен, чтобы усилить осаждение ЕСМ в кожно-эпидермального соединения (DEJ), в частности, коллаген VII, основным компонентом анкерных фибриллы. Электронная микроскопия подтвердила наличие анкерных фибриллы в культурах, разработанных с MMC, по сравнению с контрольной группой. Это имеет большое значение в качестве анкерных фибриллы привязывать дермы в эпидермис, следовательно,имеющий предварительно сформированный зрелый DEJ может льготники кожный трансплантат с точки зрения стабильности трансплантата и общего заживления раны. Кроме того, время культивирования конденсируют от 5 недель до 3-х недель, чтобы получить зрелую конструкцию, при использовании MMC, снижая затраты.

Введение

Кожа образует защитный барьер, предотвращая потерю воды и поступление патогенных микроорганизмов. Она состоит из трех основных компонентов; стромальные богатые дермы 1, стратифицированной эпидермис 2,3,4 поверх него, а также кожно-эпидермального соединения между 5,6. Дерма состоит в основном из коллагена и эластичных волокон и является малонаселенной с фибробластами 7. В противоположность этому, клеточные богатые Эпидермис состоит из нескольких слоев кератиноцитов. В кератиноцитов самого внутреннего слоя являются пролиферативная и обеспечивают новые базальные клетки, которые обновляют и заменяют терминально дифференцирующие кератиноциты, которые постоянно перемещаются к наружному-самый слой кожи и потеряли их ядра и цитоплазматического материала, в результате чего в ороговевший слой, который подвергается шелушение.

Кожный-эпидермального соединения, определенный тип базальной мембраны, представляет собой сложную структуру, состоящую из взаимосвязанных молекул матрицы, которые tetheRs эпидермис в дерму. Волокна коллагена I дермы сплетаются с коллагеном VII анкерных фибриллы, которые прикреплены к коллагена IV богатых пластинкой Densa. Якорные нити (ламинин 5, коллаген XVII и интегрины), в свою очередь подключить пластинку Densa с гемидесмосома базальных кератиноцитов. Базальных кератиноцитов (базальный слой) обладают способностью к пролиферации и возобновить, а также дифференцируются и наслаиваются с образованием супрабазальном слоев; слой Spinosum, зернистого слоя, и , наконец , роговой слой, который представляет собой контактную поверхность кожи с окружающей средой. следовавшего из базального слоя рогового слоя, кератиноциты переключаться паттерны экспрессии цитокератины и , наконец , подвергаются апоптозу и упаковывают себя в роговой конверты, шелуха специфических белков, которые ковалентно поперечно-сшитыми с помощью трансглутаминазы активностью.

Воссоздание кожи и ее слоев в лабораторных условиях , в том числе сложных структур дермально-эпидермального соединения и кожная внеклеточный матрикс, и эмулировать процесс ороговения, уже давно заинтриговал ученых и биоинженеры как сложной задачей. Там были достигнуты значительные успехи в коже тканевой инженерии, например, успешное извлечение клеток кожи из биопсий пациентов и генерирование органотипических кожи культур с использованием клеток кожи пациента , полученных 8. Тем не менее, нерешенные проблемы остаются, относящиеся к плохой секреции белков внеклеточного матрикса клетками кожи себя и приводит к неоптимальной модели кожи. Кроме того, время, необходимое для создания 3D органотипической кожи совместно культуры, используя современные протоколы колеблется от четырех до восьми недель, а временные рамки, которые потенциально могут быть укороченный с включением макромолекулярных crowders. Сокращение времени культивирования снижает стоимость реагентов, снижает частоту клеточного старения и уменьшает время ожидания пациента должны продукт использоваться в клинике.

т "> Макромолекулярный скученности (MMC) , включает в себя введение специфических макромолекулы к культуральной среде для создания эффектов исключенного объема. Они влияют на ферментативные скорости реакции , включая протеолитического расщепления проколлагена , который запаздывает в стандартных условиях культивирования водных 9-13. Под ММС, ферментативные реакции которые ускорили без увеличения количества реагентов 14,15 в результате чего, в случае проколлагена расщепления, повышенное количество коллагена молекул I в перенаселенных культурах по сравнению с безлюдных управления 10. в качестве превращения проколлагена в коллаген обеспечивает образование коллагена узлы, фибробласты , культивированные с ММС в течение 48 часов получали значительно больше коллагена I по сравнению с безлюдных культур фибробластов мониторинг в течение четырех недель 11,16,17. Помимо воздействия на ферментативной активности , которые влияют на формирование, стабилизацию и ремоделирование ECM, MMC также было показано, что непосредственно усиливать и модулировать коллагенформирование волокна 18,19.

Мы представляем здесь способ повышения производства внеклеточного матрикса (ЕСМ) клетками кожи, в частности, дермальные фибробласты и кератиноциты эпидермиса. Кроме того, мы покажем, что обогащенная ECM выпускается под MMC в однослойных культурах могут быть decellularized и использовать в качестве чистого клеток полученной матрицы (МЧР).

Мы используем нетрадиционный подход к визуализации и в полной мере оценить ЕСМ, осажденный клетками кожи, культивируемых с MMC. отражения интерференционной микроскопии обычно используется для изучения клетка-матрица взаимодействий или клетка-стекло точек контакта. Этот метод был использован в нашей системе, чтобы просмотреть общую сумму матрицы, нанесенной на поверхность стекла. отражение помех микроскопию в сочетании с флуоресцентным иммунным окрашиванием, чтобы получить наибольшее количество информации в терминах внеклеточной матрицы композиции и рисунка, в присутствии и в отсутствие MMC.

OrganotypiC кожи сокультурах является классическим методом для моделирования кожи в пробирке в трехмерном контексте. В то время как двумерные сокультурах может обеспечить существенную информацию, оно ограничено при переводе эти данные и применять его обратно в окружающую среду в естественных условиях, которая по своей природе является трехмерной структурой. кератиноциты кожи, в частности, являются поляризованными и содержат апикальные и базальные сегменты, которые имеют важное значение для гомеостаза и присоединения клеток. Кроме того, экспрессия типичных супрабазальных белков в кератиноцитах над базальным слоем, такие как кератин 1, кератин 10 и Filaggrin присутствует только в процессе стратификации и терминальной дифференцировки кератиноцитов. Как терминальная дифференцировка вряд ли присутствует в типичных культурах монослоя, супрабазальном экспрессии белка обычно не достигается в этой системе культуры. Поэтому органотипической культуры начинают погружена в культуральной среде, но затем поднимается до воздушно-жидкостной интерфейс к вождению keratinocytе дифференциация. Это приводит к экспрессии маркеров стратификации, даже ороговения и в целом лучше отразить эпидермального физиологии. В то время как другие группы ранее генерироваться Органотипической кожи сопутствующих культур успешно, создание функционального кожно-эпидермального соединения зоны была проблема. Здесь мы представляем новый метод культивирования Органотипической кожи сопутствующих культур с повышенной базальной мембраны, в конденсированной сроки и без ущерба для погашения этих конструкций. Это обеспечит миметики кожи для моделирования в лабораторных условиях , изучение биологии кожи и ассортимент скрининговых анализов.

протокол

1. Макромолекулярные Давка в 2D культур клеток кожи

  1. Семенной 50000 клеток (первичные фибробласты или первичные кератиноциты или совместное культивирование первичных фибробластов и кератиноцитов) на лунку 24-луночного планшета. Семенной клеток в 1 мл соответствующего питательной среды, типа клеток.
  2. Разрешить клетки придерживаться в течение ночи в 37 ° C инкубаторе при 5% CO 2.
  3. Выбросьте старые средства массовой информации и заменить 1 мл свежей среды, содержащей высокомолекулярные crowders и 100 мкМ аскорбиновой кислоты. Используйте Crowder коктейль, состоящий из 37,5 мг / мл Ficoll 70 и 25 мг / мл Ficoll 400. Использование фибробласты носителя (FM), состоящую из DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина антибиотиков, дополненной. Grow кератиноцитов в не содержащей сыворотки среде, KSFM или CNT-57. Поддерживать совместное культивирование в смеси 50% FM и 50% сыворотки среды.
  4. Инкубируйте культур в течение 6 дней в инкубаторе C 37 ° в 5% CO 2, с изменением среды каждые 2 дня.

2. Люминесцентные Иммунологическое на клетки кожи культур

  1. Промыть культур клеток дважды 1x PBS.
  2. Фикс клеточные культуры либо с метанолом или параформальдегида (в зависимости от технических характеристик антител).
    1. Для Метанол Фиксации
      1. Аликвоты 500 мкл холодного метанола в каждую лунку и инкубировали при -20 ° С в течение 10 мин. Отберите фиксаж и выбросить метанол отходов. Воздух сухой в ламинарном вытяжном шкафу.
    2. Для ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ Фиксации
      1. Алиготе 500 мкл 2% -ного раствора параформальдегида в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин. Отберите фиксаж и выбросить параформальдегида отходов.
      2. Мытье с 1x PBS, в течение трех стирок, 5 мин на каждую промывку.
      3. Алиготе 1 мл 1x PBS в каждую лунку.
  3. Флуоресцентные Иммунологическое с использованием антител
    1. Аликвоты в 500 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (разведенного в 1x PBS) в каждую лунку. Выдержите при комнатной температуре в течение 30 мин. Аспирируйте блокирующий раствор и выбросить.
    2. Первичные антитела
      1. Для получения изображения непосредственно из пластины: аликвоту 200 мкл первичного антитела (разведение 1: 100 в 10% козьей сыворотки) раствора в каждую лунку и инкубировать в течение 90 мин при комнатной температуре.
      2. Для покровных: аликвотами по 50 мкл первичного антитела (разведение 1: 100 в 10% козьей сыворотки, в) раствора на плоский кусок Parafilm. Поместите покровное на Parafilm, с сотовым стороне (часть покровного с клетками), обращенной раствора. Покройте всю клеточную сторону, без пузырьков. Инкубировать в течение 90 мин при комнатной температуре.
    3. Решение Аспирируйте первичное антитело и выбросьте.
    4. Мытье с 1x PBS, в течение трех стирок, 5 мин на каждую промывку.
    5. Вторичные антитела
      1. Для получения изображения непосредственно из пластины: Аликвоту 200 мкл вторичного антитела (разведение 1: 400 в 10% козьей сывороткой) раствора в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, накрывая планшету с алюминием Fo ил.
      2. Для покровных: аликвотами по 50 мкл вторичного антитела (разведение 1: 400 в 10% козьей сыворотки, в) раствора на плоский кусок Parafilm. Поместите покровное на Parafilm, с сотовым стороне (часть покровного с клетками), обращенной раствора. Покройте всю клеточную сторону, без пузырьков. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре, покрытие парафином с алюминиевой фольгой.
    6. Решение Аспирируйте вторичное антитело и выбросьте.
    7. Мытье с 1x PBS, в течение трех стирок, 5 мин на каждую промывку. Алиготе 1 мл 1x PBS в каждую лунку.
    8. монтаж
      1. Для получения изображения непосредственно из пластины: не устанавливайте. Перейдите к микроскопом.
      2. Для визуализации покровных: Mount покровные, в монтаже средств массовой информации, на предметное стекло. Сухой ночь в контейнере, покрытой алюминиевой фольгой. Перейдите к микроскопом.
  4. Получение изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с 40X / 1.30 Oil Цель.
е "> 3. Вестерн-блоттинг клеточных культур кожи

  1. Вымойте клеточные слои дважды с 1x PBS.
  2. Алиготе 100 мкл буфера для лизиса (см список материалов) в каждую лунку (6-луночного формата пластины). Выскоблите слой клеток с помощью скребка и клеточного переноса раствора в микроцентрифужных трубки.
  3. Центрифуга решение при 15,330 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Передача супернатант в другую пробирку микроцентрифужных и отбросить осадок.
  4. Смешайте 13 мкл каждого образца с 5 мкл буфера для образцов и 2 мкл восстановителя (см список материалов). Образцы тепла при 95 ° С в течение 10 мин.
  5. Центрифуга образцов при 15,330 мкг в течение 1 мин для сбора конденсата. Загружают образцы в страницу геля Сборный и работать при 100 В в течение приблизительно 1 ч.
  6. Для передачи Разделенные белки на нитроцеллюлозную мембрану, сэндвич-гель и мембрану между кусками бумаги и губок (одного и того же размера). Убедитесь, что нет пузырей между гелем, мембраны, бумаги и губкиs. Закройте сандвич кассету и запустить передачу на 70 В для в 2 ч.
  7. Для того, чтобы проверить, если передача была завершена, инкубировать мембрану с 10 мл Понсо S. промывочного мембраны с 0,1% PBS-Tween-20, три раза, 10 мин на каждую промывку.
  8. Блок с 10 мл 5% -ного молока в течение 1 ч при комнатной температуре. Мытье мембрану с 0,1% PBS-Tween-20, в три раза, 10 мин на каждую промывку.
  9. Выдержите с 10 мл первичного антитела в течение 90 мин (мыши анти-коллаген VII, LH 7.2, 1: 1000 разведение в 5% молока). Мытье мембрану с 0,1% PBS-Tween-20, в три раза, 10 мин на каждую промывку.
  10. Инкубируют 10 мл вторичного антитела в течение 30 мин (козий анти-мыши-HRP, 1: 2000 разбавление в 5% молока). Мытье мембрану с 0,1% PBS-Tween-20, в три раза, 10 мин на каждую промывку.
  11. Перенесите мембрану на кассету и добавьте 1 мл ECL Detection реактивом. Поместите прозрачный, тонкий пластиковый лист над мембраной.
  12. Для обнаружения хемилюминесценции, поместить светочувствительный пленку поверх пластикового листа и закройте кассету. После того, как 2-5 Мин, удалите пленку из кассеты и поместить его в качестве разработчика.

4. Создание и использование сотового происхождения Matrix

  1. Семенной 50000 клеток (первичные фибробласты или первичные кератиноциты или совместное культивирование первичных фибробластов и кератиноцитов) на лунку 24-луночного планшета.
  2. Разрешить клетки придерживаться в течение ночи в 37 ° C инкубаторе при 5% CO 2.
  3. Выбросьте старые средства массовой информации и заменить свежей средой, содержащей высокомолекулярные crowders и 100 мкМ аскорбиновой кислоты. Crowder коктейль состоит из 37,5 мг / мл Ficoll 70 и 25 мг / мл Ficoll 400. фибробластов медиа (FM), состоит из DMEM, дополненной 10% FBS и 1% перо-стрептококк. Кератиноцитов выращивают в бессывороточной СМИ, KSFM или CNT-57. Поддерживать совместное культивирование в смеси 50% FM и 50% KSFM или CNT-57.
  4. Инкубируйте культур в течение 6 дней в инкубаторе C 37 ° при 5% СО 2, изменение средств массовой информации каждые 2 дня.
  5. Decellularize клеточных слоев для получения клеток, полученных Матрих (е-мат = фибробласты полученный матрица, K-мат = кератиноцитов , полученных матрица, со-мат = матрица получена из совместной культуры фибробластов и кератиноцитов).
    1. Вымойте клеточные слои дважды в 1x PBS.
    2. Добавить 250 мкл 0,5% деоксихолатом натрия. Выдержите, на льду, в течение 10 мин. Отберите лизат клеток.
    3. Повторите шаг 4.5.2 трижды.
    4. Вымойте клеток , полученных матрицу дважды в дистиллированной H 2 O. Держите клеток, полученных в матрицу 1x PBS. Матрицы могут быть сохранены в течение 1 недели при температуре 4 ° С.
  6. Подготовка вторичной клеточной суспензии (например, Посев Кератиноциты на вершине ф-мата).
    1. Отберите 1x PBS.
    2. Семенной 50000 кератиноцитов поверх клеток , полученных матрице (F-мат). Разрешить клетки придерживаться в течение ночи в 37 ° C инкубаторе при 5% CO 2.
      Примечание: Анализы могут быть выполнены непосредственно на прилипшие клетки.

5. Характеристика сотовомМатрица получена

  1. Флуоресцентные иммунное: Обратитесь к Протоколу 2.
  2. Помехи Отражение Микроскопия
    1. Семенной клетки на стеклянных покровных, в соответствии с протоколом 4.1-4.5.
    2. После получения клеток, полученных матрицу, фиксируют образцы в соответствии с протоколом 2.2.
      Примечание: Антитело окрашивание не является обязательным. При необходимости обратитесь к протоколу 2.3.
    3. Выполните получение изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с целью масл 40X / 1.30. Установите крошечное отверстие на 74 мм.
    4. Используйте LP 505 для интерференционной рефлексия микроскопии (IRM) канала и BP 575-615 ИК для флуоресценции красного канала для фильтров. Использование NT 80/20 для канала IRM и HFT 405/488/561, NFT 565, пластина для флуоресценции красного канала для светоделителях. Используйте следующие лазеры: DPSS 561-10 (длина волны 561 нм) на 1,1% мощности для флуоресценции красного канала и HeNe633 (длина волны 633 нм) на 5,0% мощности для канала IRM.

6. 3D Органотипической кожи Co-культуры

  1. Литые коллагеновый гель, с фибробластами инкапсулированные, в клеточной культуре Вставка (6-луночный планшет).
    1. Алиготе 10 мл крысы хвост коллагена типа I в холодный стакан.
    2. Добавляют 1 мл холодной DMEM. Добавить 0,5 мл 1 М NaOH для нейтрализации кислотного коллагена. Добавить 0,5 мл суспензии фибробластов (содержащей 1200000 фибробласты).
    3. Переносят раствор в холодном пипетку, к вставкам клеточных культур в течение 6-луночный планшет. 12 мл общего раствора равномерно разделены на 6 клеточных культур вставок.
    4. Инкубируйте геля в инкубаторе C 37 ° при 5% СО 2, в течение 1 часа.
    5. После того, как гель затвердеет, погрузить гель в FM. Через 24 часа, выбросьте старые средства массовой информации и заменить свежей средой, содержащие высокомолекулярные crowders. Добавить объем 2 мл во внутреннюю часть вставки культивирования клеток и 2 мл на наружной стороне вставки клеточной культуры.
  2. Через 24 часа,Семенной Кератиноциты на вершине коллагеновый гель.
    1. Trypsinize кератиноцитов с использованием 0,125% трипсина / хелатирующего агента в течение 5 мин при 37 ° С. Нажмите стороны колбы осторожно, чтобы вытеснять клетки и нейтрализовать трипсина с сывороточным средах. Граф клеток и подготовить кератиноцитов суспензии (300000 кератиноциты за гель и суспендировали в 200 мкл среды).
    2. Отберите старые медиа из клеточной культуры вставки. Добавить кератиноцитов поверх геля.
    3. Инкубируйте геля в инкубаторе C 37 ° при 5% СО 2, в течение 1 часа.
    4. После того, как кератиноциты присоединили к поверхности геля, погрузить гель с 2 мл KSFM или CNT-57 к внутренней поверхности вставки культивирования клеток и 2 мл FM к наружной стороне вставки клеточной культуры.
  3. Через 24 часа, выбросьте старые средства массовой информации и заменить свежей средой, содержащие высокомолекулярные crowders.
  4. Через 7 дней погруженной культуре, поднять культуру на воздухе жидкость.
    1. Передача плюсами клеточной культурыERT к глубокому-луночного планшета. Добавьте 10 мл послойного средства массовой информации к наружной стороне вставки клеточной культуры. Держите внутреннюю часть клеточной культуры вставки сухой.
  5. Инкубируйте культур в инкубаторе C 37 ° при 5% CO 2 и изменение среды каждые 3 дня, в течение следующих 14 дней.
    Примечание: Через 2 недели на границе раздела воздух-жидкость, эквивалентная кожа является зрелым и могут быть собраны (либо быстро замораживают или фиксированных формалином).

7. Сбор урожая и характеристика Органотипической Эквиваленты кожи

  1. Отберите стратификации СМИ.
  2. С помощью пинцета, передачи культуры вставляет на бумажное полотенце и промокните прочь оставшиеся средства массовой информации от основания вставки.
  3. Используя скальпель, разрезанной вдоль внутренней окружности вставки культуры.
  4. Закрепить органотипической кожи совместное культивирование (вместе с мембраной ПЭТ).
    1. мгновенного замораживания
      1. Перенести конструкцию геля в cryomold. Накройте интерьер cryomold с ОКТсоединение. Поместите cryomold в жидкий азот в течение 10 сек.
      2. С помощью пинцета удалите замерзший cryomold из жидкого азота, завернуть в алюминиевую фольгу и хранить замороженные образцы в C морозильнике -80 °.
      3. Раздел замороженные образцы с криостата, с толщиной секции 7 мкм.
    2. Формалин Фиксирование
      1. Поместите 'биопсии губка площадку' в '' биопсии кассеты. Перенесите гель построить на губку площадку. Поместите другой губки подушку аккуратно поверх конструкции геля. Закройте кассету.
      2. Полностью погрузить кассету в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 ч, при комнатной температуре. Извлеките кассету и выбросить формалина отходов.
      3. Встраивание установленного образца в восковой блок сначала дегидратацией с серии этанола, а затем постепенно пропитывая образец с воском. Раздел воск блок с микротома.
  5. Характеристика эквивалента кожи
    1. Иммунологическое
      1. Для замороженных секций:
        1. Инкубируйте секций в 10% сыворотки козьего (разведенного в 1x PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Стирать в секции 1x PBS для удаления сыворотки козы.
        2. Инкубировать срезы с первичным антителом (разведение 1: 100 в 10% козьей сывороткой) в течение 90 мин при комнатной температуре. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 5 мин на промывку.
        3. Инкубировать срезы с вторичным антителом (разведение 1: 400 в 10% козьей сывороткой) в течение 30 мин при комнатной температуре, в контейнере, покрытой алюминиевой фольгой. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 5 мин на промывку.
        4. Маунт-сползает, с монтажными СМИ, на более покровного стекла. Образцы крышка с алюминиевой фольгой и дать высохнуть в течение ночи.
        5. Изображение с помощью конфокальной микроскопии с целью масл 40X / 1.30.
      2. Для фиксированных формалином и залитых парафином:
        1. разделы депарафинизации (и регидратации) в нисходящем процент этанола в воде (Ксилол - 100% этанол- 90% этанол - 80% этанол - 70% этанол - вода). Полностью погрузить образцы в растворах. Каждый шаг должен быть депарафинизации 3 мин.
        2. Инкубируйте разделы в 1% перекиси водорода в течение 30 мин. Промыть секции в 1х PBS в течение 5 мин.
        3. Инкубируйте разделы в растворе цитрата (10 мл раствор цитрата растворяют в 90 мл воды) при 120 ° С в течение 20 мин. Разрешить слайды остыть в течение ночи при комнатной температуре. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 5 мин на промывку.
        4. Инкубируйте секций в 10% сыворотки козьего (разведенного в 1x PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Стирать в секции 1x PBS для удаления сыворотки козы.
        5. Инкубировать срезы с первичным антителом (разведение 1: 100 в 10% козьей сывороткой) в течение 90 мин при комнатной температуре. Вымойте секций в 1x PBS, три раза, 10 мин на промывку.
        6. Инкубировать срезы с HRP-меченым полимером (в неразбавленном виде) в течение 30 мин при комнатной температуре. Вымойте секций с 1x PBS, три раза, 10 мин на промывку.
        7. Для микроцентрифужных трубки, смешайте 1 млДАБ Субстрат (3,3'-диаминобензидин) с 1 каплей хромогена. Инкубируйте разделы с этим раствором в течение 15 сек - 5 мин (коричневый цвет = положительный сигнал).
        8. Для того, чтобы остановить реакцию, мыть секций в проточной воде.
        9. Проводят контрастное ядер гематоксилином, в течение 5 мин. Промыть участки в проточной воде.
        10. Инкубировать срезы в кислотном растворе спирта, в течение 1 мин. Промыть участки в проточной воде.
        11. Инкубировать срезы в растворе водопроводной воды Скотта, в течение 2 мин. Промыть участки в проточной воде.
        12. Дополнительно: Инкубируйте разделы в эозином в течение 1 мин и промойте в проточной воде.
        13. Дегидрировать секции в восходящих процентах этанола ксилола (70% этанола - 80% этанола - 90% этанол - 100% этанол - ксилол). Убедитесь, что образцы полностью погружена в течение 3 мин на ступень.
        14. Mount сползает, используя крепежные средства массовой информации, к покровного стекла. Воздух сухой в течение ночи.
        15. Изображение с помощью конфокальной микроскопии с целью масл 40X / 1.30.
    2. Просвечивающей электронной микроскопии (для визуализации анкеровки фибрилл)
      1. Фикс образцы в 2,5% глутаральдегида в течение 72 ч.
      2. Образцы Стирать в 1x PBS, три раза, 10 мин на промывку.
      3. Нарезать на мелкие кусочки (1 мм 3). Образцы после починки в 1% осмия, рН 7,4, в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы Стирать в дистиллированной воде.
        Внимание: осмий Четырехокись ядовит и токсичен и следует обращаться осторожно в вытяжном шкафу.
      4. Высушить образцов через серии восходящий этанол (25% этанол - 50% этанол - 75% этанол - 95% этанол - 100% этанол - ацетон) в течение 20 мин на шаг.
      5. Инфильтрат путем вымачивания образцов в 100% ацетона: Araldite смолы (1: 1) в течение 30 мин при комнатной температуре и затем в соотношении 1: 3 в течение 1 ч, а затем 1: 6 в течение ночи. Замачивание образец в свежей Araldite смолы в течение 2 ч при комнатной температуре, с последующей второй сменой свежей Araldite смолы в течение 1 часа при 40 ° C. Оставьте третий свежеraldite изменение смолы в течение 1 ч при 45 ° С и оставляют четвертый свежие изменения Araldite смолы в течение 1 часа при 50 ° С.
      6. Инкубируйте образцы при температуре 60 ° С в течение 24 ч, чтобы обеспечить полимеризацию.
      7. Образцы раздел с использованием стеклянного ножа, чтобы получить полу-шлифы толщиной 1 мкм. Пятно секция с метиленовым синим, чтобы наблюдать за гистологию. Раздел образец, чтобы получить ультратонкие срезы 70 нм и собирают каждую секцию на медную сетку.
      8. Пятно секции с 5% -ным раствором уранилацетате в течение 15 мин, а затем 3% -ным раствором цитратом свинца в течение 10 мин.
      9. Серии изображений с помощью просвечивающего электронного микроскопа (100 кВ) при увеличении 30,000X.

Результаты

Макромолекулярный сгущение удалось усилить осаждение ЕСМ, в частности, фибробласты осаждается больше коллагена I, IV и фибронектина по сравнению с контрольными культурами (рисунок 1, клеточный слой; 1A, коллаген I, 1B, коллаген IV; 1C, фибр...

Обсуждение

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

Раскрытие информации

The authors have no conflicting interests to disclose.

Благодарности

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidWako013-12061Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)Greiner Bio-One657610Organotypic cultures
Citrate solutionDakoS2369DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)Corning354236Organotypic cultures
CnT-57CELLnTECCnT-57Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kitDakoK3468Histology
Deep-well plate (6-well format)Corning355467Organotypic cultures
ECL detection reagentGE Healthcare Life SciencesRPN2106Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM) JEOL  JEM-1010 (100kV)Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70GE Healthcare Life Sciences17-0310-05Macromolecular crowder
Ficoll PM400GE Healthcare Life Sciences17-0300-05Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)Life Technologies17005-042Cell culture media
Lysis bufferThermoFisher Scientific89900Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. 
MicroscopeZeissLSM510Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)National DiagnosticsHS-106Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)ThermoFisher Scientific8310-16Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)Sakura4583Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibioticsSigma AldrichA5955Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibodyAbcam#ab6308
Anti-Collagen Type IVNovocastra#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VIILH7.2 (in house) 
Anti-Fibronectin antibodyAbcam#ab2413
Reducing agent ThermoFisher ScientificNP0009Western blot
Sample bufferThermoFisher ScientificNP0008Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma Aldrich#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-11037 
AlexaFluor 594 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific #A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific#A-11001
Secondary antibodies (HRP)DakoEnvision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouseundiluted
Sodium deoxycholateProdotti Chimicie AlimentariDecellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12   Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisoneUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
TrypsinBiopolis Shared Facilities0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3 Used to trypsinize cells

Ссылки

  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1142D3DIIVVII

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены