JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

Abstract

משפחת גליקופרוטאין של collagens מייצג את חלבונים מבניים העיקרי בגוף האדם, והם מרכיבים מרכזיים של חומרים ביולוגיים בשימוש בהנדסת רקמות המודרנית. צוואר בקבוק טכני הוא בתצהיר של קולגן במבחנה, כפי שהוא איטי לשמצה, וכתוצאה מכך ההיווצרות תת אופטימלי של רקמות חיבור ולכידות רקמות שלאחר מכן, במיוחד במודלי עור. כאן, אנו מתארים שיטה אשר תהיה כרוכה בתוספת-פולימרים שיתוף סוכרוז דיפרנציאלי בגודל לתרבויות העור לייצר macromolecular מצטופפים (MMC), שתוצאתה לשדרוג דרמטי של בתצהיר קולגן. במיוחד, פיברובלסטים העור שהופקדו כמות משמעותית של קולגן I / IV / VII ו- פיברונקטין תחת MMC בהשוואה לקבוצת ביקורת.

הפרוטוקול גם מתואר שיטה decellularize שכבות תאים צפופות, חשיפת כמויות משמעותיות של תאי מטריקס (ECM) אשר נשמרו על פני שטח התרבות כפי שמעיד immunocytochemistry. דפוס המוני והפצת מטריקס סה"כ נחקר באמצעות מיקרוסקופ הפרעת השתקפות. מעניין, פיברובלסטים, קרטינוציטים ושיתוף תרבויות המיוצר מטריצות תאים שמקורם (CDM) של משתנים הרכב ומורפולוגיה. CDM יכול לשמש "ביו-פיגומים" עבור זריעת תאים משנית, שבהם השימוש הנוכחי של ציפוי או פיגומים, בדרך כלל מן חי xenogenic, ניתן להימנע, ובכך לנוע לעבר יישומים קליניים רלוונטי יותר.

בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את היישום של MMC בשלב השקוע של מודל התרבות שיתוף עור 3D-organotypic שהיה מספיק כדי לשפר בתצהיר ECM בצומת דרמו-אפידרמיס (DEJ), בפרט, קולגן VII, המרכיב העיקרי עיגון סיבים. במיקרוסקופ אלקטרונים אישר את נוכחותו של עיגון הסיבים בתרבויות פותח עם MMC, בהשוואה לקבוצת הביקורת. זה משמעותי כמו סיבי עיגון לקשור הדרמיס לאפידרמיס, ומכאן,בעל DEJ הבוגר מראש יצר עשויה להועיל מקבלי שתל עור מבחינת יציבות שתל וריפוי פצע כולל. יתר על כן, זמן התרבות היה מרוכז מ -5 שבועות עד 3 שבועות כדי לקבל מבנה בוגר, בעת שימוש MMC, הפחתת עלויות.

Introduction

העור מהווה מחסום הגנה באמצעות מניעת אובדן מים וכניסה הפתוגן. הוא מורכב משלושה חלקים עיקריים; הדרמיס העשיר סטרומה 1, האפידרמיס מרובדת 2,3,4 על גבי זה, לבין צומת דרמו-אפידרמיס בין 5,6. הדרמיס מורכב ברובו קולגן וסיבים אלסטיים מאוכלס בדלילות עם 7 פיברובלסטים. לעומת זאת, האפידרמיס עשיר התא מורכב משכבות מרובות של קרטינוציטים. קרטינוציטים של השכבה הפנימית-ביותר הם שגשוג ולספק תאי הבזליים חדשים אשר לחדש ולהחליף סופני הבחנה קרטינוציטים כי כל זמן לנוע על השכבה הכי החיצונית של העור ואבדו הגרעינים שלהם וחומר cytoplasmic, וכתוצאה מכך שכבת cornified אשר עוברת קלוף.

צומת עורי-אפידרמיס, סוג מסוים של קרום במרתף, הוא מבנה מורכב מורכב ממולקולות מטריקס מקשרות, אשר tetheRS האפידרמיס אל הדרמיס. סיבי קולגן I של הדרמיס לשזור עם VII קולגן עיגון סיבים מעוגנים אל Densa lamina העשיר קולגן IV. חוטים עיגון (laminin 5, י"ז קולגן integrins) בתורו לחבר את Densa lamina עם hemidesmosomes של קרטינוציטים הבזליים. קרטינוציטים בסל (basale שכבה) יש את היכולת להתרבות ולחדש, כמו גם להבדיל לרבד כדי ליצור את שכבות suprabasal; השכבה spinosum, שכבת granulosum, ולבסוף השכבה קרנית, אשר מייצג את שטח המגע של העור עם הסביבה. מסלול צמוד משכבת ​​הבסיס לשכבת cornified, קרטינוציטים לעבור דפוסי ביטוי של cytokeratins ולבסוף עוברים אפופטוזיס ו לשים בארגז עצמם cornified מעטפות, קליפות של חלבונים ספציפיים crosslinked קוולנטית ידי פעילות transglutaminase.

יצירה מחדש עור שכבותיו במבחנה, לרבות המבנים המורכבים של עורי-אפידרמיס צומת מטריקס עורי, וכדי לחקות את תהליך cornification, יש ארוך מסוקרן מדענים ביו-מהנדסים כמו משימה מאתגרת. הייתה התקדמות משמעותית הנדסת רקמות עור, למשל, החילוץ המוצלח של תאי עור מפני ביופסיות חולות לבין הדור של תרבויות העור organotypic באמצעות תאי עור נגזרות חולים 8. עם זאת, בעיות לא פתורות להישאר הנוגעים הפרשת העניים של חלבונים תאי מטריקס ידי תאי העור עצמם וכתוצאה מכך מודלים העור תת אופטימלית. יתר על כן, את הזמן דרוש כדי ליצור עור 3D organotypic שיתוף תרבות תוך שימוש בפרוטוקולים נוכחיים נע בין ארבעה עד שמונה שבועות, פרק זמן אשר עלול להתקצר עם השילוב של crowders macromolecular. הפחתת זמן תרבות חוסך עלויות מגיב, מפחית את שכיחות הזדקנות התא ומפחית את זמן ההמתנה של החולה צריך המוצר לשמש במרפאה.

t "> Macromolecular מצטופפים (MMC) כרוך החדרת מקרומולקולות ספציפי עד בינוני התרבות כדי ליצור אפקטים נפח נשלל. אלה להשפיע על שיעורי התגובה האנזימטית כולל מחשוף פרוטאוליטים של procollagen שהוא מפגר בתנאים תרבות מימית תקן 9-13. תחת MMC, תגובות אנזימטיות הם מהרו מבלי להגדיל את כמות ריאגנטים 14,15 וכתוצאה מכך, במקרה של מחשוף procollagen, בסכום של קולגן גדל לי מולקולות בתרבויות צפופות בהשוואה לקבוצת ביקורת צפופה 10. כפי ההמרה של procollagen לקולגן מאפשר ההיווצרות של קולגן מכלולים, פיברובלסטים תרבותיים עם MMC במשך 48 שעות ניב משמעותי יותר קולגן אני לעומת תרבויות פיברובלסטים צפופות במעקב במשך עד ארבעה שבועות 11,16,17. מלבד השפעות על פעילות אנזימטית המשפיעה על ההיווצרות, ייצוב ועיצוב מחדש של ECM, MMC גם הוכח כדי לשפר ולווסת ישירות קולגןהיווצרות סיבים 18,19.

אנו מציגים כאן שיטה כדי לשפר את תאי מטריקס (ECM) הייצור על ידי תאי העור, בפרט, פיברובלסטים עורי קרטינוציטים אפידרמיס. בנוסף, אנו מראים כי ECM מועשר מיוצר תחת MMC בתרבויות בשכבה ניתן decellularized ושימש מטריקס תאים שמקורם טהור (CDM).

אנו משתמשים בגישה בלתי קונבנציונלית כדי לחזות להעריך במלואה את ECM שהופקד על ידי תאי עור תרבותיים עם MMC. השתקפות מיקרוסקופיה הפרעות בדרך כלל משמשת ללימוד אינטראקציות מטריקס תא או תא אל זכוכית נקודות מגע. טכניקה זו נוצלה במערכת שלנו כדי להציג את הסכום הכולל של מטריקס שהופקד על משטח הזכוכית. השתקפות מיקרוסקופיה הפרעות לוותה immunostaining ניאון כדי להשיג תוצאות מקסימאליות כמות המידע מבחינת הרכב תאי מטריקס דפוס, בנוכחות והיעדר MMC.

Organotypiג העור שיתוף תרבויות היא שיטה קלאסית מודל העור במבחנה בהקשר תלת ממדי. בעוד דו ממדי שיתוף תרבויות עשויות לספק מידע משמעותי, היא מוגבלת כאשר תרגום הנתונים הללו וליישם אותו בחזרה לסביבה in vivo, שמטבעו אינו מבנה תלת-ממדי. קרטינוציטים עור, בפרט, הם מקוטבים ומכילים קטעי apical ואת הבסיס שחיוניים הומאוסטזיס ודבקות תא. בנוסף, ביטוי של חלבונים suprabasal טיפוסי קרטינוציטים מעל שכבת הבסיס, כגון קרטין 1, קרטין 10 ו filaggrin קיים רק במהלך ריבוד והבחנה הטרמינל של קרטינוציטים. כמו בידול הטרמינל כמעט בהווה בתרבויות בשכבה טיפוסית, ביטוי חלבון suprabasal הוא בדרך כלל לא מושג במערכת התרבות הזאת. לכן, תרבויות organotypic מתחילות שקועות בינוני תרבות, אבל אז הם הרימו על ידי יצירת ממשק אוויר נוזלי לנהוג keratinocytבידול דואר. התוצאה היא ביטוי של סמנים ריבוד, אפילו cornification ו השתקפות בדרך כלל גבוהה יותר של הפיזיולוגיה אפידרמיס. בעוד קבוצות אחרות בעבר יצרו שיתוף תרבויות עור organotypic בהצלחה, הקמת אזור צומת דרמו-אפידרמיס תפקודית כבר בעיה. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה culturing עור organotypic שיתוף תרבויות עם קרום במרתף משופר, בתוך מסגרת זמן מרוכזת ללא התפשרות על הבגרות בין שני המושגים הללו. זה יספק mimetics העור עבור מודלים במבחנה, בחקר הביולוגיה העור וכן מבחר של מבחני המיון.

Protocol

1. Macromolecular צפיפות תא תרבויות עור 2D

  1. זרע 50,000 תאים (פיברובלסטים ראשוניים או קרטינוציטים ראשוניים או שיתוף תרבות של פיברובלסטים ראשוני קרטינוציטים) לכל גם צלחת 24 באר. תאי זרע ב 1 מיליליטר של תקשורת צמיחת סוג התא המקבילה.
  2. אפשר תאים לדבוק למשך הלילה, 37 מעלות צלזיוס חממה ב 5% CO 2.
  3. בטל המדיה הישנה ולהחליף עם התקשורת טרי 1 מ"ל המכיל crowders macromolecular וחומצה אסקורבית 100 מיקרומטר. השתמש קוקטייל קראודר המורכב 37.5 מ"ג / מ"ל ​​Ficoll 70 ו -25 מ"ג / מ"ל ​​התקשורת פיברובלסטים השתמש Ficoll 400. (FM) המורכב DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה פניצילין, סטרפטומיצין. לגדול קרטינוציטים בתוך סרום ללא מדיה, KSFM או CNT-57. לשמור על שיתוף תרבויות בתערובת של 50% FM ו -50% סרום ללא מדיה.
  4. דגירה תרבויות עבור 6 ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, עם התקשורת לשנות כל 2 ימים.

2. Immunostaining פלורסנט על תרביות תאי עור

  1. לשטוף בתרביות תאים פעמיים עם 1x PBS.
  2. תקן בתרביות תאים עם או מתנול או paraformaldehyde (תלוי במפרט נוגדנים).
    1. עבור קיבעון מתנול
      1. Aliquot 500 μl של מתנול קר לתוך זה היטב דגירה ב -20 ° C במשך 10 דקות. לשאוב מקבע להשליך פסולת מתנול. אוויר יבש במנדף למינרית.
    2. לקבלת Paraformaldehyde קיבוע
      1. Aliquot 500 μl של פתרון paraformaldehyde 2% לבאר כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לשאוב מקבע להשליך פסולת paraformaldehyde.
      2. לשטוף עם PBS 1x, עבור שלושה שוטף, 5 דקות לכל לשטוף.
      3. Aliquot 1 מ"ל של 1x PBS לבאר כל אחד.
  3. Immunostaining פלורסנט באמצעות נוגדנים
    1. Aliquot 500 μl של אלבומין 3% שור (מדולל PBS 1x) לתוך כל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשאוב את הפתרון חוסם וזורקים.
    2. נוגדן ראשוני
      1. עבור הדמיה ישירות מהצלחת: Aliquot 200 μl של נוגדן ראשוני (דילול 1: 100 ב 10% נסיוב עז) פתרון זה לתוך זה היטב דגירה במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. עבור coverslips: Aliquot 50 μl של נוגדן ראשוני (1: 100 דילול ב 10% נסיוב עז) פתרון אל חתיכת אבן שטוחה של Parafilm. מניחים coverslip על Parafilm, עם הצד התא (חלק coverslip עם תאים) מול הפתרון. מכסה את התא בצד כולו, ללא בועות. דגירה של 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לשאוב פתרון נוגדן ראשוני וזורקים.
    4. לשטוף עם PBS 1x, עבור שלושה שוטף, 5 דקות לכל לשטוף.
    5. נוגדנים משני
      1. עבור הדמיה ישירות מהצלחת: Aliquot 200 μl של נוגדנים משני (1: 400 דילול ב 10% נסיוב עז) פתרון זה לתוך זה היטב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את הצלחת עם אלומיניום fo il.
      2. עבור coverslips: Aliquot 50 μl של נוגדנים משני (1: 400 דילול ב 10% נסיוב עז) פתרון אל חתיכת אבן שטוחה של Parafilm. מניחים coverslip על Parafilm, עם הצד התא (חלק coverslip עם תאים) מול הפתרון. מכסה את התא בצד כולו, ללא בועות. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את Parafilm ברדיד אלומיניום.
    6. לשאוב פתרון נוגדנים משני וזורקים.
    7. לשטוף עם PBS 1x, עבור שלושה שוטף, 5 דקות לכל לשטוף. Aliquot 1 מ"ל של 1x PBS לבאר כל אחד.
    8. הַרכָּבָה
      1. הדמיה ישירות מהצלחת: לא הר. משך המיקרוסקופ.
      2. עבור הדמיה של coverslips: coverslips ההר, ב תקשורת גוברת, על גבי זכוכית נושאת. לילה יבש במיכל מכוסה בנייר אלומיניום. משך המיקרוסקופ.
  4. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר Confocal עם המטרה שמן 40X / 1.30.
דואר "> 3. מערבי סופג של תרביות תאי עור

  1. לשטוף שכבות תאים פעמיים עם 1x PBS.
  2. Aliquot 100 μl של חיץ תמוגה (ראה רשימת חומרים) לתוך כל טוב (פורמט 6-גם צלחת). לגרד את שכבת תאים עם מגרד תא פתרון טרנספר לתוך צינור microcentrifuge.
  3. פתרון צנטריפוגה ב 15,330 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant צינור אחר microcentrifuge וזורקים את הכדור.
  4. מערבבים 13 μl של כל דגימה עם 5 μl של חיץ מדגם ו -2 μl של צמצום סוכן (ראה רשימת חומרים). דגימות מחממים על 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  5. דגימות צנטריפוגה ב 15,330 XG דקות 1 כדי לאסוף מי עיבוי. דגימות טען לג'ל עמוד מראש יצוק ולהפעיל ב -100 V עבור כ 1 שעה.
  6. כדי להעביר חלבונים מופרדים כדי קרום nitrocellulose, כריך הג'ל קרום בין פיסות נייר וספוגים (באותו גודל). ודא שאין בועות בין ג'ל, הקרום, ניירות ספוגיםים. סגור את קלטת כריך ולהפעיל את ההעברה 70 V במשך שעה 2.
  7. כדי לבדוק אם ההעברה הושלמה, דגירה הממברנה עם 10 מ"ל Ponceau ס לשטוף הממברנה עם 0.1% PBS-Tween-20, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
  8. חסום עם 10 מ"ל של חלב 5% במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף הממברנה עם 0.1% PBS-Tween-20, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
  9. דגירה עם נוגדן ראשוני 10 מ"ל במשך 90 דקות (VII אנטי-קולגן העכבר, 7.2 LH, 1: 1,000 דילול בחלב 5%). לשטוף הממברנה עם 0.1% PBS-Tween-20, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
  10. דגירה עם נוגדנים משני 10 מ"ל במשך 30 דקות (עז אנטי עכבר HRP, 1: דילול 2,000 בחלב 5%). לשטוף הממברנה עם 0.1% PBS-Tween-20, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
  11. מעבירים את הממברנה כדי קלטת ולהוסיף 1 מ"ל של מגיב איתור ECL. מניחים יריעת פלסטיק שקופה, דקה על הממברנה.
  12. כדי לזהות chemiluminescence, למקם סרט רגיש לאור על יריעת פלסטיק ולסגור את הקלטת. אחרי 2דקות -5, הסירו את הסרט מתוך הקלטת ולמקם אותו לתוך מפתח.

4. ביצוע ושימוש מטריקס תא הנגזרות

  1. זרע 50,000 תאים (פיברובלסטים ראשוניים או קרטינוציטים ראשוניים או שיתוף תרבות של פיברובלסטים ראשוני קרטינוציטים) לכל גם צלחת 24 באר.
  2. אפשר תאים לדבוק למשך הלילה, 37 מעלות צלזיוס חממה ב 5% CO 2.
  3. בטל המדיה ישנה ולהחליף עם תקשורת טריה המכילה crowders macromolecular וחומצה אסקורבית 100 מיקרומטר. קוקטייל קראודר מורכב 37.5 מ"ג / מ"ל ​​Ficoll 70 ו -25 מ"ג / מ"ל ​​Ficoll 400. התקשורת פיברובלסטים (FM) מורכב DMEM בתוספת 10% FBS ו -1%-סטרפטוקוקוס עט. קרטינוציטים גדלים בתוך סרום ללא מדיה, KSFM או CNT-57. לשמור על שיתוף תרבויות בתערובת של 50% FM ו -50% KSFM או CNT-57.
  4. דגירה תרבויות עבור 6 ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, שינוי התקשורת כל 2 ימים.
  5. Decellularize שכבות תאים להשיג מטרי תא הנגזרותx (f-מחצלת = מטריצה ​​נגזרת פיברובלסטים, k-מחצלת = מטריצה ​​נגזרת keratinocyte, שיתוף מחצלת = מטריצה ​​נגזרת שיתוף תרבות של פיברובלסטים ו קרטינוציטים).
    1. לשטוף שכבות תאים פעמיים 1x PBS.
    2. הוסף 250 μl של deoxycholate נתרן 0.5%. דגירה, על קרח, למשך 10 דקות. lysate התא לשאוב.
    3. חזור על שלב 4.5.2 שלוש פעמים.
    4. לשטוף תא נגזר מטריקס פעמי H המזוקק 2 O. שמור מטריקס תאים שמקורם ב 1x PBS. מטריצות ניתן לאחסן עד 1 שבוע ב 4 ° C.
  6. הכין תרחיף תא משני (למשל, מתזמן קרטינוציטים עליון של מחצלת ו).
    1. לשאוב 1x PBS.
    2. זרעים 50,000 קרטינוציטים על גבי מטריצה ​​תאים שמקורם (f-מחצלת). אפשר תאים לדבוק למשך הלילה, 37 מעלות צלזיוס חממה ב 5% CO 2.
      הערה: מבחנים יכולים להתבצע ישירות על התאים החסידים.

אפיון 5. Cell-מטריקס נגזר

  1. immunostaining פלורסנט: עיין פרוטוקול 2.
  2. מיקרוסקופי השתקפות הפרעה
    1. תאי זרע על coverslips זכוכית, בעקבות פרוטוקול 4.1-4.5.
    2. לאחר קבלת מטריקס התאים שמקורם, לתקן דגימות הבאות פרוטוקול 2.2.
      הערה: מכתים נוגדן הוא אופציונלי. במידת הצורך, עיין בפרוטוקול 2.3.
    3. בצע רכישת התמונה באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר confocal עם מטרה שמן 40X / 1.30. הגדר את החריר 74 מ"מ.
    4. השתמש LP 505 על ההפרעה מחדש השיקוף מיקרוסקופיה (IRM) ערוץ ו- BP 575-615 IR עבור fl uorescence מסלול אדום למסננים. השתמש NT 80/20 עבור הערוץ IRM ו HFT 405/488/561, NFT אזור 565, צלחת עבור fl uorescence מסלול אדום עבור מפצלי קרן. השתמש לייזרים הבאים: DPSS 561-10 (ננומטר אורך גל 561) בהספק 1.1% עבור fl uorescence מסלול אדום HeNe633 (ננומטר אורך גל 633) בהספק 5.0% עבור ערוץ IRM.

6. עור 3D Organotypic Co-תרבות

  1. עופרת ג'ל קולגן, עם פיברובלסטים כמוס, בתרבות-Cell הכנס (פורמט 6-גם צלחת).
    1. Aliquot 10 מיליליטר של קולגן מסוג זנב עכברוש לי מבחנה קרה.
    2. הוסף 1 מ"ל של DMEM קר. הוסף 0.5 מ"ל של 1 M NaOH לנטרל את הקולגן חומצי. הוסף 0.5 מ"ל של השעיה פיברובלסטים (המכיל 1,200,000 פיברובלסטים).
    3. מעבירים את הפתרון, בתוך פיפטה קר, אל מוסיף תרבית תאים בתוך צלחת 6-היטב. 12 מיליליטר של תמיסת הכולל התפלג 6 מוסיף תרבית תאים.
    4. דגירה ג'ל בתוך 37 ° C חממה ב 5% CO 2, 1 שעה.
    5. אחרי הג'ל יש הקרושה, להטביע את הג'ל FM. לאחר 24 שעות, להשליך את המדיה הישנה ולהחליף עם תקשורת טריה, המכיל crowders macromolecular. הוספת נפח של 2 מ"ל אל פנים של להכניס תרבית תאים ו -2 מ"ל החיצוני של הכנס תא-תרבות.
  2. לאחר 24 שעות,זרעים קרטינוציטים על גבי ג'ל קולגן.
    1. Trypsinize קרטינוציטים באמצעות סוכן 0.125% טריפסין / chelating במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הקש צידי הבקבוק בעדינות כדי לסלק תאים ולנטרל טריפסין עם מדיה המכילה סרום. ספירת תאים ולהכין השעית keratinocyte (300,000 קרטינוציטים לכל ג'ל ותלוי 200 מדיה μl).
    2. המדיה הישנה לשאוב להכניס תרבית תאים. להוסיף קרטינוציטים על גבי הג'ל.
    3. דגירה ג'ל בתוך 37 ° C חממה ב 5% CO 2, 1 שעה.
    4. אחרי קרטינוציטים יש מצורפים אל פני שטח ג'ל, להטביע את הג'ל עם 2 מיליליטר KSFM או CNT-57 לחלק הפנימי של להכניס תרבית תאים ו -2 מיליליטר של FM כדי החיצוני של כנס תא-התרבות.
  3. לאחר 24 שעות, להשליך את המדיה הישנה ולהחליף עם תקשורת טריה, המכיל crowders macromolecular.
  4. לאחר 7 ימים של תרבות השקועה, להעלות את תרבות ממשק נוזל אוויר.
    1. העבר את כל הפרטים-תרבית תאיםERT לצלחת עמוקה היטב. הוסף מדיה ריבוד 10 מ"ל החיצוני של הכנס תא-תרבות. שמור על הפנים של יבש להכניס תרבית תאים.
  5. דגירת תרבויות בתוך 37 ° C חממה ב 5% CO 2 ולשנות תקשורת כל 3 ימים, עבור 14 הימים הבאים.
    הערה: לאחר 2 שבועות על הממשק אוויר נוזלי, המקבילה העור הוא בוגר ניתן לקצור (בין הצמד קפוא או פורמלין קבוע).

7. קציר ושווי עור אפיון Organotypic

  1. תקשורת ריבוד לשאוב.
  2. בעזרת פינצטה, להעביר את התרבות מוסיפה על מגבת נייר ולמחות את תקשורת הנותרים מהבסיס של הכנס.
  3. באמצעות אזמל, לחתוך לאורך ההיקף הפנימי של להכניס את התרבות.
  4. תקן את העור organotypic שיתוף תרבות (יחד עם קרום PET).
    1. הצמד להקפיא
      1. מעביר את המבנה הג'ל על cryomold. מכסים את הפנים של cryomold עם אוקטוברמתחם. מניחים את cryomold לתוך חנקן נוזלי במשך 10 שניות.
      2. בעזרת פינצטה, להסיר את cryomold הקפוא מן החנקן הנוזלי, לעטוף בנייר אלומיניום ולאחסן את הדגימות הקפואות במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
      3. סעיף קפוא דגימות עם cryostat, עם עובי סעיף של 7 מיקרומטר.
    2. קיבוע פורמלין
      1. מניח 'כרית ספוג ביופסיה' אל 'קלטת הביופסיה'. מעביר את הג'ל לבנות על הכרית הספוגה. מניח כרית ספוג אחרת בעדינות על גבי המבנה ג'ל. סגור את הקלטת.
      2. מלא להטביע את הקלטת 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו במשך 48 שעות, בטמפרטורת החדר. הסר את הקלטת וזורקים פסולים פורמלין.
      3. שבץ מדגם קבוע לתוך גוש שעווה ידי dehydrating הראשון עם סדרת אתנול ולאחר מכן בהדרגה שחדר מדגם בשעווה. סעיף לחסום שעווה עם microtome.
  5. אפיון של Equivalent העור
    1. immunostaining
      1. עבור חלקים קפואים:
        1. דגירה סעיפים בסרום עיזים 10% (בדילול מלא PBS 1x) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. חלקים לשטוף 1x PBS להסיר את בסרום עיזים.
        2. סעיפים דגירה עם נוגדן ראשוני (1: 100 דילול בסרום 10% עז) למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף מקטעים PBS 1x, שלוש פעמים, 5 דקות לכל לשטוף.
        3. סעיפים דגירה עם נוגדנים משני (1: 400 דילול בסרום 10% עז) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בתוך מכולה מכוסה בנייר אלומיניום. לשטוף מקטעים PBS 1x, שלוש פעמים, 5 דקות לכל לשטוף.
        4. הר שקופיות, עם תקשורת גוברת, על גבי coverglass. דגימות מכסים ברדיד אלומיניום ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה.
        5. תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרה שמן 40X / 1.30.
      2. עבור סעיפים Embedded פרפין קבוע פורמלין:
        1. סעיפי Dewax (ו רעננותם) יורדים אחוזי אתנול למים (קסילן - 100% אתנול- 90% אתנול - 80% אתנול - 70% אתנול - מים). לגמרי לצלול דגימות בפתרונות. כל צעד dewaxing צריך להיות 3 דקות.
        2. דגירת מקטעים מי חמצן 1% למשך 30 דקות. לשטוף מקטעים 1x PBS במשך 5 דקות.
        3. סעיפים דגירה בתמיסה ציטרט (פתרון ציטראט 10 מ"ל הוא מומס 90 מ"ל מים) ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. אפשר שקופיות להתקרר לילה, בטמפרטורת החדר. לשטוף מקטעים PBS 1x, שלוש פעמים, 5 דקות לכל לשטוף.
        4. דגירה סעיפים בסרום עיזים 10% (בדילול מלא PBS 1x) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. חלקים לשטוף 1x PBS להסיר את בסרום עיזים.
        5. סעיפים דגירה עם נוגדן ראשוני (1: 100 דילול בסרום 10% עז) למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף מקטעים PBS 1x, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
        6. סעיפים דגירה עם פולימר שכותרתו HRP (חי) למשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר. לשטוף חלקים עם PBS 1x, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
        7. כדי צינור microcentrifuge, לשלב 1 מ"לDAB המצע (3,3'-diaminobenzidine) עם 1 טיפה של אַב צֶבַע. דגירה חלקה עם הפתרון הזה במשך 15 שניות - 5 דקות (צבע חום = איתות חיובית).
        8. כדי לעצור את התגובה, לשטוף את החלקים במים זורמים.
        9. Counterstain גרעינים עם hematoxylin, במשך 5 דקות. לשטוף חלקים במים זורמים.
        10. סעיפי דגירה בתמיסת אלכוהול חומצה, 1 דקות. לשטוף חלקים במים זורמים.
        11. סעיפי דגירה בתמיסה מי ברז של סקוט, למשך 2 דקות. לשטוף חלקים במים זורמים.
        12. אופציונליים: דגירת מקטעי eosin עבור 1 דקות ולשטוף במים זורמים.
        13. מייבשי סעיפים באחוזים עולים של אתנול קסילן (70% אתנול - 80% אתנול - 90% אתנול - 100% אתנול - קסילן). ודא כי דגימות שקועות לחלוטין במשך 3 דקות לכל שלב.
        14. הר שקופיות, באמצעות תקשורת הרכבה, על coverglass. לילה יבש אוויר.
        15. תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרה שמן 40X / 1.30.
    2. הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (כדי דמיינו עיגון סיבים)
      1. תקן דגימות glutaraldehyde 2.5% למשך 72 שעות.
      2. לשטוף דגימות ב PBS 1x, שלוש פעמים, 10 דקות לכל לשטוף.
      3. חותכים לחתיכות קטנות (1 מ"מ 3). דגימות פוסט לתקן ב tetroxide אוסמיום 1%, pH 7.4, עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף דגימות במים מזוקקים.
        זהירות: tetroxide אוסמיום רעיל רעיל וצריך להיות מטופל בזהירות במנדף.
      4. מייבשים דגימות באמצעות בסדרה עולה אתנול (25% אתנול - 50% אתנול - 75% אתנול - 95% אתנול - 100% אתנול - אצטון) במשך 20 דקות לכל פעולה.
      5. חדור על ידי השריית דגימות אצטון 100%: שרף araldite (1: 1) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בבית 1: 3 עבור שעה 1, ואחריו 1: 6 לילה. משרי מדגם araldite בטרי עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר, ואחריו שינוי שני של שרף araldite הטרי עבור שעה 1 ב 40 מעלות צלזיוס. השאירו את טרי השלישישינוי שרף raldite עבור שעה 1 ב 45 ° C ולהשאיר את שינוי שרף araldite הטרי הרביעי עבור שעה 1 ב 50 מעלות צלזיוס.
      6. דגירה דגימות ב 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר פילמור.
      7. דגימות סעיף בעזרת סכין זכוכית, להשיג חלקים דקים חצי בעובי של 1 מיקרומטר. סעיף הכתם עם מתילן כחול להתבונן היסטולוגיה. סעיף מדגם להשיג חלקים דקים של 70 ננומטר ולאסוף כל קטע על גבי רשת נחושת.
      8. כתם בסעיפים עם פתרון יצטט uranyl 5% במשך 15 דקות ואחריו פתרון ציטראט 3% עופרת במשך 10 דקות.
      9. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (100 קילו וולט), בהגדלה של 30,000X.

תוצאות

הצפיפות Macromolecular הצליח לשפר בתצהיר ECM, בפרט, פיברובלסטים שהופקדו ככל שאני קולגן, IV ו- פיברונקטין לעומת לשלוט תרבויות (איור 1, שכבת התאים; 1A, קולגן אני; 1B, קולגן IV; 1C, פיברונקטין). עם decellularization, היה ברור כי פיברובלסטים הי...

Discussion

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

Disclosures

The authors have no conflicting interests to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidWako013-12061Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)Greiner Bio-One657610Organotypic cultures
Citrate solutionDakoS2369DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)Corning354236Organotypic cultures
CnT-57CELLnTECCnT-57Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kitDakoK3468Histology
Deep-well plate (6-well format)Corning355467Organotypic cultures
ECL detection reagentGE Healthcare Life SciencesRPN2106Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM) JEOL  JEM-1010 (100kV)Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70GE Healthcare Life Sciences17-0310-05Macromolecular crowder
Ficoll PM400GE Healthcare Life Sciences17-0300-05Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)Life Technologies17005-042Cell culture media
Lysis bufferThermoFisher Scientific89900Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. 
MicroscopeZeissLSM510Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)National DiagnosticsHS-106Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)ThermoFisher Scientific8310-16Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)Sakura4583Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibioticsSigma AldrichA5955Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibodyAbcam#ab6308
Anti-Collagen Type IVNovocastra#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VIILH7.2 (in house) 
Anti-Fibronectin antibodyAbcam#ab2413
Reducing agent ThermoFisher ScientificNP0009Western blot
Sample bufferThermoFisher ScientificNP0008Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma Aldrich#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-11037 
AlexaFluor 594 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific #A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific#A-11001
Secondary antibodies (HRP)DakoEnvision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouseundiluted
Sodium deoxycholateProdotti Chimicie AlimentariDecellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12   Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisoneUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
TrypsinBiopolis Shared Facilities0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3 Used to trypsinize cells

References

  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering1142D3DorganotypicIIVVII

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved