JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.

Özet

kolajenlerin glikoprotein ailesi, modern doku mühendisliğinde kullanılan biyomateryallerin anahtar bileşenleri insan vücudunda ana yapısal proteinleri temsil eder ve vardır. Bu özellikle deri modellerinde, bağ dokusu ve daha sonra doku uyum optimal oluşumu ile sonuçlanır, herkesin bildiği gibi yavaş edilen bir teknik bir darboğaz, in vitro olarak kolajen birikmesidir. Burada, kollajen depolanmasının önemli bir gelişme ile sonuçlanan makromoleküler kalabalık (MMC) oluşturmak için cilt kültürlerine diferansiyel boyutlu sükroz ko-polimerlerin eklenmesi içeren bir yöntem açıklanmaktadır. Özel olarak, dermal fibroblastları, kontroller ile karşılaştırıldığında MMC altında kolajen I / IV / VII ve fibronektinin önemli miktarda yatırılır.

protokol, immunocy ile kanıtlandığı gibi kültür yüzey üzerinde muhafaza edildi hücre dışı matrisin (ECM) önemli miktarda açığa kalabalık hücre tabakalarını decellularize için bir yöntem açıklanırtochemistry. Toplam matris kütlesi ve dağılım paterni girişim yansıma mikroskopi kullanılarak incelenmiştir. bileşim ve şekil değişen İlginç bir şekilde, fibroblastlar, keratinositler ve ko-kültürler üretilen hücre kökenli matrisler (CDM). CDM böylece daha klinik olarak anlamlı uygulamalar doğru hareket, kaplamalar veya iskelelerinin mevcut kullanımı genellikle ksenojenik hayvansal kaynaklardan, önlenebilir sekonder hücre ekimi için "biyo-iskeleler" olarak kullanılabilir.

Buna ek olarak, bu protokol, özellikle, dermo-epidermal bileşke (DEJ) ECM birikimini artırmak için yeterli bir 3D-Organotipik bir deri ko-kültürü modeli, kolajen VII, ana bileşen batık aşamasında MMC uygulanmasını tarif etmektedir fibrillerini ankraj. Elektron mikroskobu kontrollere kıyasla, MMC ile geliştirilen kültürlerde fibrillerin ankraj varlığını doğruladı. demirleme fibriller epidermis dermis urgan gibi bu nedenle, önemliBir önceden oluşturulmuş Olgun DEJ greft stabilitesi ve genel olarak yara iyileşme açısından deri dokusu alıcıları yararlanabilir sahip. Ayrıca, kültür süresi maliyetlerini azaltarak, MMC kullanırken, olgun bir yapı elde etmek için 3 hafta 5 hafta yoğunlaştırıldı.

Giriş

Cildin su kaybı ve patojen girişini engelleyerek koruyucu bir bariyer oluşturur. Bu üç ana bileşenden oluşur; stromal zengin dermis 1, katmanlı epidermis bunun üstüne 2,3,4 ve 5,6 arasında dermo-epidermal bileşke. Dermis ölçüde kollajen ve elastik liflerden oluşan ve seyrek fibroblastlar 7 ile doldurulur. Bunun aksine, hücre açısından zengin bir epidermis keratinositleri birden fazla katmandan oluşmaktadır. en iç tabakasının keratinositler proliferatif ve sürekli yenilemeye ve derinin en dış katmana taşımak ve uğrayarak bir kornifiye katman sonuçlanan, kendi çekirdek ve sitoplazmik malzeme kaybetmiş ölümcül ayırt keratinositleri yerine yeni bazal hücre sağlamak deskuamasyon.

dermal-epidermal bileşke, bazal membran belirli bir tip, tethe birbirine matris moleküllerinin, oluşan karmaşık bir yapıdırdermis epidermis rs. dermis kollajen I lifleri kollajen VII kolajen IV zengin lamina densa demirlemiş olan fibriller ankraj ile geçmeliye. sırayla ankraj filamentler (laminin 5, kollajen XVII ve integrinler) bazal keratinosit hemidezmozomlara ile lamina densa bağlayın. Bazal keratinositler (stratum bazale) ayırt etmek ve bazal üstü katmanları oluşturmak için tabakalandırmak yanı sıra çoğalmaya ve yenilemek kapasitesine sahip; çevre ile cildin temas yüzeyini temsil stratum spinosum, stratum granulosum ve nihayet stratum korneum. boynuzlaşan tabakaya bazal tabakadan Yolda, keratinositler Sitokeratin salgılanma modellerini değiştirmek ve nihayet apoptoz geçmesi ve boynuzlaşan kendilerini örten zarf, kovalent transglutaminaz aktivitesi ile çapraz bağlanmış olan özel proteinlerin gövde.

Karmaşık yapıları da dahil olmak üzere, deri ve in vitro katmanlarını yeniden dermal-epidermal bileşke ve dermal ekstraselüler matriks ve kornifikasyonu sürecini taklit etmek, zorlu bir görev olarak uzun ilgisini bilim adamları ve biyo-mühendisler vardır. Örneğin deri doku mühendisliğinde önemli ilerlemeler, olmuştur, hasta biyopsi alınan deri hücrelerinin başarılı çıkarma ve hasta kaynaklı cilt hücrelerini 8 kullanarak deri Organotipik kültürlerin üretimi. Bununla birlikte, çözülmemiş problemler cilt hücreleri tarafından hücre dışı matris proteinlerine zayıf salgılama kendilerini ilgili alt-optimal deri modellerinde elde kalır. Ayrıca, zaman, potansiyel makromoleküler Crowders eklenmesi ile kısaltılmış olabilir bir takvim geçerli protokolleri kullanarak 3D Organotipik cilt ko-kültür üretmek için gerekli dört ila sekiz hafta arasında değişir. kültür süresini azaltmak, reaktif maliyet tasarrufu sağlar, hücre yaşlanması insidansını azaltır ve hastanın bekleme süresi ürün klinikte kullanılması gerektiğini azaltır.

t "> makromoleküler (MMC) kalabalık hariç hacim etkileri. Bu standart sulu kültür koşulları 9-13 altında gecikmiş olan prokollajen proteolitik bölünme içeren enzimatik reaksiyon hızlarını etkileyen. MMC altında, enzimatik reaksiyonlar üretmek için kültür ortamına spesifik makromoleküllere sokulması içerir uncrowded kontrol 10 ile karşılaştırıldığında prokolajen bölünme kalabalık kültürlerinde I molekülleri kolajen artan miktarda durumunda, 14,15 sonuçlanan reaktiflerin miktarını artırmadan acele edilir. kolajen prokollajen dönüşüm olarak kollajen oluşumunu sağlar 48 saat MMC ile kültür meclisleri, fibroblastlar dört hafta 11,16,17 izlenir uncrowded fibroblast kültürleri ile karşılaştırıldığında I önemli ölçüde daha kolajen vermiştir. ECM oluşumu, istikrar ve biçimlenme etkileyen enzimatik aktivite, aynı zamanda MMC üzerindeki etkilerin yanı sıra şirketinden geliştirmek ve kollajen modüle ettiği gösterilmiştirlif oluşumu 18,19.

Biz özellikle, dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositler cilt hücreleri tarafından hücre dışı matriks (ECM) üretimini artırmak için burada bir yöntem mevcut. Buna ek olarak, tek katmanlı kültürler içerisinde MMC altında üretilen zenginleştirilmiş ECM hücresizleştirilmiş ve saf hücresinden türetilen matriks (CDM) halinde kullanılabileceğini göstermektedir.

Biz görselleştirmek için bir konvansiyonel olmayan bir yaklaşım kullanır ve tam MMC ile kültüre deri hücreleri tarafından yatırılan ECM için teşekkür ederiz. Parazit yansıma mikroskopi tipik hücre-matris etkileşimleri ya da hücre-cama temas noktaları çalışmak için kullanılır. Bu teknik, cam yüzeyinde biriken matris toplam miktarını görüntülemek için sistemimizde kullanılmıştır. Parazit yansıma mikroskopi varlığı ve MMC yokluğunda, hücre dışı matris bileşimi ve düzen söz konusu bilgi en fazla miktarda elde etmek üzere floresan immün ile birleştirilmiştir.

OrganotypiCı Cilt ko-kültürler üç boyutlu bir bağlamda in vitro deri modeli için klasik bir yöntemdir. Iki boyutlu eş-kültür önemli bilgiler sağlayabilir Bu veriler çeviri ve arka doğal üç boyutlu bir yapısı olan bir in vivo ortamda, bunu uygulamada, sınırlıdır. Cilt keratinositleri, özellikle, polarize olur ve homeostaz ve hücre yapışması için gerekli olan apikal ve bazal segmentleri içerir. Buna ek olarak, keratin 1, keratin 10 ve filagrin bazal katmanın üzerinde keratinositler, tipik bazal üstü proteinlerin ekspresyonu belirlenmesi ve keratinositlerin farklılaşması sırasında sadece mevcut bulunmaktadır. terminal farklılaşma, tipik tek-tabakalı kültürler içinde hemen hemen mevcut olduğu için, bazal üstü protein ekspresyonu, normal olarak, bu kültür sisteminde elde edilemez. Bu nedenle, organotipik kültürlerinin kültür ortamı içinde daldırılmış başlar, ama daha sonra keratinocyt sürmek için bir hava-sıvı arayüz kaldırılıre farklılaşma. Bu katlama belirteçleri, daha boynuzlaşma ve epidermal fizyolojisinin genellikle daha iyi yansımasını ekspresyonu ile sonuçlanır. diğer gruplar önce başarıyla Organotipik cilt ko-kültürler meydana getirirken, fonksiyonel dermo-epidermal bileşke bölgesinde kurulması bir konu olmuştur. Burada, bir yoğunlaştırılmış bir zaman dilimi içinde, gelişmiş bir bazal membran ile Organotipik bir deri ko-kültürler kültür ve bu yapıları vadesinin ödün vermeden yeni bir yöntem. Bu in vitro model cilt mimetikleri, deri biyoloji çalışma ve eleme deneylerinin yelpazesine sağlayacaktır.

Protokol

1. Makromoleküler Dışlamasını 2D Cilt hücre kültürlerinde

  1. Tohum 50,000 hücre (primer fibroblastlar veya birincil keratinositler veya primer fibroblastlar ve keratinosit ko-kültür), 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için. karşılık gelen hücre tipi büyüme ortamı, 1 ml tohum hücreleri.
  2. Hücreler,% 5 CO2 de 37 ° C inkübatör, gece boyunca yapışmaya izin verin.
  3. Eski medya atın ve 1 ml taze medya makromoleküler Crowders ve 100 uM askorbik asit içeren ile değiştirin. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik ile takviye 37.5 mg DMEM kapsayan / ml Ficoll 70 ve 25 mg / ml Ficoll 400 kullanımlar fibroblast ortamı (FM) oluşan bir crowder kokteyl kullanın. Bir serum ücretsiz medya, KSFM veya CnT-57 keratinositler büyütün. % 50 FM ve% 50 serumsuz ortam karışımı içinde eş-kültür koruyun.
  4. Her 2 günde bir ortam değişikliği ile,% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 gün boyunca kültürler inkübe edin.

Cilt Hücre Kültürleri 2. Floresan immün

  1. 1x PBS ile iki kez hücre kültürleri yıkayın.
  2. metanol veya paraformaldehit (antikor özelliklerine bağlı olarak) ya hücre kültürleri sabitleyin.
    1. Metanol Fiksasyon için
      1. Kısım 500, her oyuğa soğuk metanol ul ve 10 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin. Aspire sabitleştirici ve metanol atık atın. laminer davlumbaz hava kuru.
    2. Paraformaldehyde Fiksasyon için
      1. Kısım her bir kuyuya% 2 paraformaldehit çözeltisi 500 ul ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Aspire sabitleştirici ve paraformaldehid atık atın.
      2. Üç yıkamadan, yıkama başına 5 dakika için 1 x PBS ile yıkayın.
      3. Kısım her bir kuyunun içine 1 x 1 mL PBS.
  3. Antikorlar kullanılarak Floresan immün
    1. Kısım her bir kuyunun içine (1 x PBS içinde seyreltilmiş)% 3 sığır serum albümini 500 ul. 3 için oda sıcaklığında inkübe edilir0 dak. Engelleme çözüm aspire ve atın.
    2. Primer antikor
      1. Kısım 200 birincil antikor ul: plaka üzerine doğrudan görüntüleme için: her kuyuya (1 100 seyrelti,% 10 keçi serumu) çözeltisi oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edilir.
      2. Kısım birincil antikor 50 ul (1: 100 seyreltme,% 10 keçi serumu) çözeltisi Parafilm düz parça üzerine lamelleri. çözüm bakan hücre yan (hücreleri ile lamel parçası) ile, Parafilm üzerine lamel yerleştirin. Hiçbir kabarcıkları ile, tüm hücre tarafı örtün. Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Aspire birincil antikor çözümü ve atma.
    4. Üç yıkamadan, yıkama başına 5 dakika için 1 x PBS ile yıkayın.
    5. İkincil antikor
      1. Kısım sekonder antikor 200 ul: doğrudan plaka görüntüleme için: her kuyuya (1 400 seyreltme,% 10 keçi serumu) çözeltisi ve alüminyum fo ile plaka kaplama, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe il.
      2. Kısım sekonder antikor, 50 ul (1: 400 seyreltme,% 10 keçi serumu) çözeltisi Parafilm düz parça üzerine lamelleri. çözüm bakan hücre yan (hücreleri ile lamel parçası) ile, Parafilm üzerine lamel yerleştirin. Hiçbir kabarcıkları ile, tüm hücre tarafı örtün. Alüminyum folyo ile Parafilm kapsayan, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    6. Aspire sekonder antikor çözeltisi ve atma.
    7. Üç yıkamadan, yıkama başına 5 dakika için 1 x PBS ile yıkayın. Kısım her bir kuyunun içine 1 x 1 mL PBS.
    8. Montaj
      1. plaka doğrudan görüntüleme için: mount yoktur. mikroskop geçin.
      2. Dağı lamelleri, bir cam slayt üzerine, medyayı montaj: lamelleri görüntüleme için. alüminyum folyo ile kaplı bir kapta kuru gece boyunca karıştırılmıştır. mikroskop geçin.
  4. 40X / 1.30 Yağ Amaç bir Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu kullanılarak Görüntüleri kazanır.
e "> 3. Western Blot Cilt Hücre Kültürleri

  1. 1x PBS ile iki kez Hücre katmanlarını yıkayın.
  2. Kısım her bir (6-gözlü plaka) içine liziz tamponu, 100 | il (Malzeme listesine bakınız). Bir mikrosantrifüj tüp içine hücre kazıyıcı ve transfer çözeltisi ile hücre tabakası kazıyın.
  3. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15.330 x g'de santrifüjleyin çözeltisi. Başka bir mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın ve pelet atın.
  4. örnek tamponu, 5 ul ve indirgeme maddesi 2 ul her bir numune için 13 ul karıştırın (Malzeme listesine bakınız). 10 dakika boyunca 95 ° C'de ısı örnekleri.
  5. 1 dakika boyunca 15.330 xg'de santrifüj örnekleri yoğunlaşma suyu toplamak için. Yük öncesi döküm PAGE jeli numuneleri yaklaşık 1 saat boyunca 100 V'ta tutuldu.
  6. bir nitroselüloz zara ayrılan proteinler aktarmak için, kağıt parçaları (aynı boyutta) sünger ile jel ve membran sandviç. jel, membran kağıtları ve sünger arasında hiçbir kabarcıklar vardır emin oluns. sandviç kaseti kapatın ve 2 saatte için 70 V de transferini çalıştırın.
  7. Aktarım tamamlandığında ise,% 0.1 PBS-Tween-20, üç kez, yıkama başına 10 dakika ile 10 ml Ponceau S. Yıkama membran ile membran inkübe kontrol etmek için.
  8. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt, 10 ml ile bloklayın. % 0.1 PBS-Tween-20, üç kez, yıkama başına 10 dk membran yıkayın.
  9. 90 dakika boyunca 10 mi, birincil antikor (: 1000 seyreltme,% 5 süt fare anti-kolajen VII, LH 7.2, 1) kuluçkalayın. % 0.1 PBS-Tween-20, üç kez, yıkama başına 10 dk membran yıkayın.
  10. 30 dakika boyunca, 10 ml ikincil antikor (: 2.000 seyreltme% 5 süt, keçi anti-fare-HRP, 1) kuluçkalayın. % 0.1 PBS-Tween-20, üç kez, yıkama başına 10 dk membran yıkayın.
  11. bir kaset membran transfer ve ECL belirleme reaktifinin 1 ml. Membran üzerinde net, ince plastik levha yerleştirin.
  12. kemilüminesan tespit etmek için, plastik levha üzerinde ışığa duyarlı bir film yer kaseti kapatın. 2 sonra-5 Dakika, kaset filmi çıkarın ve bir geliştirici içine yerleştirin.

4. yapma ve Cep-türetilmiş Matrix kullanma

  1. Tohum 50,000 hücre (primer fibroblastlar veya birincil keratinositler veya primer fibroblastlar ve keratinosit ko-kültür), 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için.
  2. Hücreler,% 5 CO2 de 37 ° C inkübatör, gece boyunca yapışmaya izin verin.
  3. Eski medya atın ve taze medya makromoleküler Crowders ve 100 uM askorbik asit içeren ile değiştirin. crowder kokteyli,% 10 FBS ve% 1 Pen-strep ile takviye edilmiş DMEM oluşur 37.5 mg oluşur / ml Ficoll 70 ve 25 mg / ml Ficoll 400 Fibroblast ortamı (FM). Keratinositler bir serum ücretsiz medya, KSFM veya CnT-57 yetiştirilmektedir. % 50 FM ve% 50 KSFM ya CnT'nin-57 karışımı içinde eş-kültür koruyun.
  4. Her 2 günde bir ortam değiştirme% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 gün boyunca kültürler inkübe edin.
  5. hücre-türevi matri elde etmek için, hücre katmanları DecellularizeX (F-MAT = fibroblastlar ve keratinositleri ihtiva eden bir ko-kültür türetilen fibroblast türevli matris k-mat = keratinosit türetilen matriks, CO-mat = matris).
    1. 1x PBS içinde iki kere Hücre katmanlarını yıkayın.
    2. % 0.5 sodyum deoksikolat, 250 ul ekle. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Aspire hücre lizatı.
    3. Tekrarlayın Adım 4.5.2 üç kez.
    4. Yıkama damıtılmış H2O içinde iki kez matris hücre kökenli 1x PBS içinde hücre kökenli matris tutun. Matrisler 1 haftaya kadar 4 ° C saklanabilir.
  6. (F-mat üstünde keratinositleri tohumlama, Örnek için) İkincil Hücre Süspansiyon hazırlayın.
    1. Aspire 1x PBS.
    2. Hücre kökenli bir matris (F-MAT) üzerine 50.000 keratinositler tohumu. Hücreler,% 5 CO2 de 37 ° C inkübatör, gece boyunca yapışmaya izin verin.
      Not: Deneyler yapışık hücreler üzerinde doğrudan gerçekleştirilebilir.

Hücresel 5. Karakterizasyonutüretilmiş Matrix

  1. Floresan immün: Protokolün 2 başvurun.
  2. Girişim Yansıma Mikroskopi
    1. Protokolün 4,1-4,5 aşağıdaki cam lamelleri, üzerine Tohum hücreleri.
    2. hücre kökenli matris elde ettikten sonra, Protokol 2.2 aşağıdaki örnekleri düzeltmek.
      Not: Antikor boyama isteğe bağlıdır. Gerekirse, Protokolün 2.3 bakın.
    3. 40X / 1.30 petrol amacı ile bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntü elde etme gerçekleştirin. 74 mm iğne deliği ayarlayın.
    4. filtreler için kırmızı kanal uorescence fl için girişim sını fl ection mikroskobu (IRM) kanal ve BP 575-615 IR için LP 505 kullanın. Kullanım IRM kanalı için NT 80/20 ve HFT 405/488/561, NFT 565, kiriş bölücülerin kırmızı kanal uorescence fl için plaka. kırmızı kanal ve HeNe633 IRM kanalı için% 5.0 güçte (dalga boyu 633 nm) uorescence fl için DPSS 561-10 (dalga boyu 561 nm)% 1.1 güçte: Aşağıdaki lazerler kullanın.

6. 3D Organotipik Cilt Co-kültür

  1. Hücre kültür ek parçanın (6-yuvalı plaka formatı), fibroblastlar Encapsulated bir kollajen jel, döküm.
    1. Kısım soğuk behere fare kuyruk kolajeni tip I, 10 ml.
    2. Soğuk DMEM 1 ml ekleyin. asidik kolajen nötralize etmek için 1 M NaOH, 0.5 ml ilave edilir. (1,200,000 fibroblastlar ihtiva eden), fibroblast süspansiyon 0.5 ml ilave edilir.
    3. 6 yuvalı plaka içindeki hücre kültürü ekler için, soğuk bir pipet, çözeltisini. toplam çözeltinin 12 ml eşit 6 hücre kültürü ekler ayrılmıştır.
    4. 1 saat boyunca,% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C kuluçka makinesi içinde jel inkübe edin.
    5. Jel katılaşmış sonra, FM jel daldırın. makromoleküler Crowders içeren, 24 saat sonra, eski medya atmak ve taze medya ile değiştirin. hücre kültürü ucun dış hücre kültürü ucun içine 2 ml ve 2 ml arasında bir hacim.
  2. 24 saat sonra,Kollajen jel üstünde keratinositlerin tohumu.
    1. Tripsinize 37 ° C'de 5 dakika süreyle% 0.125 tripsin / kenetleme maddesi kullanılarak keratinositler. hücreleri çıkarmak ve serum ihtiva eden ortam ile tripsin nötralize etmek için yavaşça şişenin yanlarını hafifçe vurun. hücrelerin sayısı ve keratinosit süspansiyon hazırlamak (jel başına 300.000 keratinositler ve 200 ul medya askıya).
    2. Hücre kültürü insert aspire eski medya. jel üstünde keratinositler ekleyin.
    3. 1 saat boyunca,% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C kuluçka makinesi içinde jel inkübe edin.
    4. keratinositler jel yüzeye bağlı sonra, 2 mi KSFM veya jel daldırın CnT-57 hücre kültürü ucun dış FM hücre kültürü ucun iç tarafına ve 2 mi.
  3. makromoleküler Crowders içeren, 24 saat sonra, eski medya atmak ve taze medya ile değiştirin.
  4. daldırılmış kültürde 7 gün sonra, bir hava-sıvı arayüz kültür kaldırın.
    1. Hücre kültürü ins Transferiderin oyuklu plakaya ert. hücre kültürü ucun dış 10 ml tabakalaşma ortam ekleyin. hücre kültürü eklemek kuru iç tutun.
  5. % 5 CO 2 37 ° C inkübatör kültürleri inkübe ve önümüzdeki 14 gün boyunca, her 3 günde ortamı değiştirmek.
    Not: hava-sıvı arayüzü de 2 hafta sonra, cilt eşdeğer (dondurulmuş veya formalin ile sabit ek olarak) olgun ve hasat edilebilir.

7. Hasat ve Karakterizasyonu organotipik Deri Benzerleri

  1. Aspire tabakalaşma medya.
  2. cımbız kullanarak, bir kağıt havlu üzerine kültür ekler aktarmak ve insert tabanından kalan medyayı uzak hafifçe sürün.
  3. bir neşter kullanarak kültür ucun iç çevresi boyunca kesilmiş.
  4. (PET membran ile birlikte) Organotipik cilt ko-kültür sabitleyin.
    1. Yapış Freeze
      1. Bir cryomold jel yapısı aktarın. OCT ile cryomold iç Kapakbileşik. 10 saniye için sıvı azot içine cryomold yerleştirin.
      2. cımbız kullanarak, sıvı azot dondurulmuş cryomold kaldırmak alüminyum folyo ile sarın ve -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş örnekleri saklamak.
      3. Bölüm 7 um arasında bir kesit kalınlığına sahip bir kriyostat ile örnekleri dondurulmuş.
    2. formalin fiksasyonu
      1. 'Biyopsi kaset' bir 'biyopsi sünger ped' koyun. Jel sünger ped üzerine inşa aktarın. Jel yapısının üstüne hafifçe başka sünger yastık yerleştirin. Kaseti kapatın.
      2. Tam, oda sıcaklığında 48 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde kaseti daldırın. Kaseti çıkarın ve formalin atık atın.
      3. ilk olarak etanol serisi ile dehidre ve sonra yavaş yavaş balmumu ile örnek infiltre bir mum blok içine sabit örnek gömün. Bölüm bir mikrotom ile balmumu blok.
  5. Cilt Karşılığı Karakterizasyonu
    1. immün
      1. Dondurulmuş Bölümler İçin:
        1. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (1 x PBS içinde seyreltilmiş),% 10 keçi serumu bölümleri inkübe edin. 1x PBS içinde yıkayın bölümleri keçi serumu çıkarmak için.
        2. primer antikor ile bölümleri inkübe (1:% 10 keçi serumu, 100 seyreltme) ile oda sıcaklığında 90 dakika karıştırıldı. , 1 x PBS içinde üç kez yıkama başına 5 dakika bölümleri yıkayın.
        3. ikincil antikor ile inkübe bölümleri (1:% 10 keçi serumu, 400 seyreltme) ile oda sıcaklığında 30 dk için alüminyum folyo ile kaplı bir kap içinde. , 1 x PBS içinde üç kez yıkama başına 5 dakika bölümleri yıkayın.
        4. Dağı bir coverglass üzerine, medyayı montaj, slaytlar. alüminyum folyo ile kapak örnekleri ve gece boyunca kurumaya bırakın.
        5. 40X / 1.30 petrol amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntü.
      2. Formalin Sabit Parafin Gömülü Bölüm için:
        1. Dewax bölümleri (ve rehidrate), su, etanol yüzdelerini azalan (ksilen -% 100 etanol-% 90 etanol -% 80 etanol -% 70 etanol - su). Tam çözümler örnekleri daldırın. Her mum alma adımı 3 dk olmalıdır.
        2. 30 dakika süre ile% 1 hidrojen peroksit bölümleri inkübe edin. 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde bölümleri yıkayın.
        3. 20 dakika boyunca 120 ° C de sitrat çözeltisi bölümler (10 mi sitrat solüsyonu 90 ml su içinde çözünmekte) inkübe edin. Slaytlar, oda sıcaklığında, gece boyunca soğumaya bırakın. , 1 x PBS içinde üç kez yıkama başına 5 dakika bölümleri yıkayın.
        4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (1 x PBS içinde seyreltilmiş),% 10 keçi serumu bölümleri inkübe edin. 1x PBS içinde yıkayın bölümleri keçi serumu çıkarmak için.
        5. primer antikor ile bölümleri inkübe (1:% 10 keçi serumu, 100 seyreltme) ile oda sıcaklığında 90 dakika karıştırıldı. , 1 x PBS içinde üç kez, yıkama başına 10 dk bölümleri yıkayın.
        6. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (seyreltilmemiş) HRP-işaretli polimer ile bölümleri inkübe edin. 1x PBS, üç kez, yıkama başına 10 dk ile bölümleri yıkayın.
        7. mikrosantrifüj tüpüne 1 ml kombinekromojen 1 damla DAB Yüzey (3,3'-diaminobenzidin). 15 saniye bu çözüm ile bölümleri inkübe - 5 dk (kahverengi renk = pozitif sinyal).
        8. , Reaksiyonu durdurmak akan su bölümleri yıkayın.
        9. 5 dakika için, hematoksilin ile çekirdekleri karşıt. Akan su bölümleri durulayın.
        10. 1 dakika süre ile, asit alkol çözeltisi bölümleri inkübe edin. Akan su bölümleri durulayın.
        11. 2 dakika boyunca, Scott çeşme suyu çözeltisi içinde bölümleri inkübe edin. Akan su bölümleri durulayın.
        12. İsteğe bağlı: 1 dakika boyunca eosin bölümleri inkübe ve akan suyun altında yıkayın.
        13. ksilen etanol artan yüzdelerinde bölümleri kurutmak (-% 80 etanol -% 70 etanol% 90 etanol -% 100 etanol - ksilen). Numuneler tam kademe başına 3 dakika boyunca su altında olduğundan emin olun.
        14. Dağı bir coverglass için, montaj medyayı kullanarak, slaytlar. Hava kuru bir gecede.
        15. 40X / 1.30 petrol amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntü.
    2. Transmisyon Elektron Mikroskobu (Ankraj fibriller gözünüzde canlandırın için)
      1. 72 saat boyunca% 2.5 gluteraldehit örnekleri sabitleyin.
      2. 1x PBS Yıkama örnekleri, üç kez yıkama başına 10 dk.
      3. Küçük parçalar (1 mm3) halinde kesilir. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 osmiyum tetroksit, pH 7.4, Post-düzeltme örnekleri. damıtılmış su içinde yıkayın örnekler.
        Dikkat: Osmiyum tetroksit zehirli ve toksik bir davlumbaz dikkatle ele alınmalıdır.
      4. (-% 50 etanol -% 75 etanol -% 95 etanol -% 100 etanol - aseton% 25 etanol) adım başı 20 dakika artan bir etanol dizi örnekleri dehydrate.
      5. % 100 aseton örnekleri ıslatılmasıyla sızmak: Araldit reçinesi (1: 1) bir karışımı, 6: 1, ardından 1 saat süreyle 3, 1 daha sonra da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca. 40 ° C'de 1 saat boyunca, taze Araldit reçinesi bir ikinci değişiklik, ardından oda sıcaklığında 2 saat için taze Araldit reçinesi numune bekletin. Üçüncü taze a bırakın45 ° C 'de 1 saat boyunca raldite reçine değişimi ve 50 ° C de 1 saat süre ile, dördüncü, taze Araldit reçinesi değişikliği bırakın.
      6. polimerizasyonun izin vermek için 24 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
      7. Bir cam bıçak kullanarak Madde örnekleri 1 um'lik bir kalınlığa sahip yarı ince kesitler elde edildi. metilen mavisi ile Leke bölümü histoloji gözlemlemek. Bölüm 70 nm ultra-ince kesitler elde etmek ve bir bakır ızgara üzerine her bölümü toplamak için örnek.
      8. 10 dakika süre ile% 3 kurşun sitrat çözeltisi ve ardından 15 dakika boyunca% 5 uranil asetat çözeltisi ile Leke bölümleri.
      9. 30,000X büyütmede bir transmisyon elektron mikroskobu (100 kV) görüntüleri, elde edin.

Sonuçlar

Makromoleküler dışlama, özellikle de ECM birikimi geliştirmek mümkün, fibroblastlar kültürleri kontrol grubuna göre daha fazla kolajen I, IV ve fibronektin tevdi (Şekil 1, Celi tabakası; 1A, kolajen I, 1B, kolajen IV, 1C, fibronektin). Decellularization üzerine, keratinositler (Şekil 1, matris) karşılaştırıldığında fibroblast kollajen I, IV ve fibronektin ana mevduat olduğu açıkt...

Tartışmalar

Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh...

Açıklamalar

The authors have no conflicting interests to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidWako013-12061Cell culture media additive
Cell culture inserts  (6-well format)Greiner Bio-One657610Organotypic cultures
Citrate solutionDakoS2369DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10)
Collagen (rat tail)Corning354236Organotypic cultures
CnT-57CELLnTECCnT-57Cell culture media
DAB Substrate + chromogen kitDakoK3468Histology
Deep-well plate (6-well format)Corning355467Organotypic cultures
ECL detection reagentGE Healthcare Life SciencesRPN2106Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent
Electron microscope (TEM) JEOL  JEM-1010 (100kV)Transmission electron microscopy
Fibroblast media (FM)High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin
Ficoll PM70GE Healthcare Life Sciences17-0310-05Macromolecular crowder
Ficoll PM400GE Healthcare Life Sciences17-0300-05Macromolecular crowder
Keratinocyte serum-free media (KSFM)Life Technologies17005-042Cell culture media
Lysis bufferThermoFisher Scientific89900Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. 
MicroscopeZeissLSM510Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag).
Mounting media (Hydromount)National DiagnosticsHS-106Fluorescent staining
Mounting media (Cytoseal)ThermoFisher Scientific8310-16Histology (HRP)
OCT compound (Tissue Tek)Sakura4583Embedding for cryotomy
Penicillin-streptomycin antibioticsSigma AldrichA5955Cell culture media additive
Primary antibodies
Anti-Collagen I antibodyAbcam#ab6308
Anti-Collagen Type IVNovocastra#NCL-COLL-IV
Anti-collagen VIILH7.2 (in house) 
Anti-Fibronectin antibodyAbcam#ab2413
Reducing agent ThermoFisher ScientificNP0009Western blot
Sample bufferThermoFisher ScientificNP0008Western blot
Secondary antibodies (Immunostaining)
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Sigma Aldrich#D9542
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-11037 
AlexaFluor 594 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific #A-11005
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbitThermoFisher Scientific#A-21441
AlexaFluor 488 goat-anti-mouseThermoFisher Scientific#A-11001
Secondary antibodies (HRP)DakoEnvision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouseundiluted
Sodium deoxycholateProdotti Chimicie AlimentariDecellularization
Stratification media
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
Ham’s F12   Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
10% fetal bovine serum Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
0.4 mg/ml hydrocortisoneUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml insulinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
1.8·10-4 M adenine  Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
5 mg/ml transferrinUsed during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
2·10- 11 M triiodothyronine Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert.
TrypsinBiopolis Shared Facilities0.125% Trypsin/Versene   pH 7.0 + 0.3 Used to trypsinize cells

Referanslar

  1. Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
  2. Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
  3. Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
  4. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  5. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
  6. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
  7. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  8. Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
  9. Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
  10. Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
  11. Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
  12. Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
  13. Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  14. Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
  15. Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
  16. Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  17. Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
  18. Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
  19. Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
  20. Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
  21. Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
  22. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
  23. Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
  24. Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
  25. Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
  26. Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BioengineeringSay 114keratinositlerfibroblastlarmakromolek ler d lama2B h cre k lt r3 boyutlu h cre k lt rderi organotipik ko k lt rlerh cre d matriskolajen tip Ikolajen tip IVkollajen tip VII In vitro Deri modelleridermo epidermal bile ke

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır