التحضير للثقافات الجرذ دبقية قليلة التغصن السلف والكمي لOligodendrogenesis عن طريق ثنائي الأشعة تحت الحمراء الضوئي الإسفار

Summary

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Abstract

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Introduction

التوصيل العصبي فعال في الجهاز العصبي المركزي الثدييات (CNS) يتطلب تكون الميالين من المحاور التي كتبها قليلة التغصن. خلال التنمية، تنشأ قليلة التغصن من بين مجموعة من خلايا دبقية قليلة التغصن السلف (يجد OPCs) التي يعتقد أن الهجرة من مناطق البطين من الدماغ الأمامي تطوير والأنبوب العصبي ^1. بعد تفرق يجد OPCs الهجرة إلى ناضجة، قليلة التغصن myelinating التي تسهل كفاءة نشر الدافع ليس فقط، ولكن أيضا توفير محاور مع الدعم الغذائي ^2. يحافظ على الجهاز العصبي المركزي الكبار أعداد وفيرة من يجد OPCs المنتشرة في جميع أنحاء المادة الرمادية والمادة البيضاء التي تضم حوالي 5-8٪ من جميع الخلايا ^3. بعد إهانة المزيل، يجد OPCs تهاجر إلى موقع الإصابة، تتكاثر، والتفريق ليحل محل الأغماد المايلين المفقودة أو التالفة على المحاور المكشوفة. ومع ذلك، في بعض البيئات مرض / إصابة، تم العثور على هذه العملية أن تكون غير فعالة أو يمكن أن تفشل تماما ^4. في حينويعتقد إزالة الميالين المزمن إضافة إلى عبء المرض، oligodendrogenesis كفاءة وعودة الميالين قد تخفف من أعراض ^5. فقد كان لذلك من مصلحة لدراسة يجد OPCs في المختبر لتحديد تأثير العوامل التجريبية على oligodendrogenesis.

أحرز التبصر في مراحل مختلفة من التمايز دبقية قليلة التغصن ممكن عن طريق تحديد مرحلة علامات معينة من الخلايا. وتعرف الخلايا الاولية في وقت مبكر تجديد الذات من قبل التعبير عنها الصفيحات المستمدة عامل النمو مستقبلات ألفا (PDGFRα)، العصبية / الدبقية مستضد 2 (NG2) وA2B5 ^6-8. كما تبادر يجد OPCs برنامج التمايز وتنسحب من دورة الخلية، فإنها downregulate التعبير عن هذه العلامات والبدء في التعبير عن البروتينات الإرشادية للpremyelinating قليلة التغصن بما في ذلك دائرى-النوكليوتيدات 3'-فسفودايستراز (CNPase) وO4. وأخيرا، والتمايز بهم إلى oligodendroc أكثر نضجايتميز ytes عن طريق التعبير عن البروتينات المرتبطة المايلين، بما في ذلك بروتين سكري المرتبطة المايلين (MAG)، بروتين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي)، والبروتين الأساسي المايلين (ب ب). MBP هو داخل الخلايا الطرفية بروتين الغشاء وعنصرا رئيسيا من غمد المايلين. الفئران التي تفتقر MBP تطوير النمط الظاهري حاد في الجهاز العصبي المركزي والتي تكون الميالين وانخفضت بشكل ملحوظ مما يؤدي إلى هزات، والتشنجات والموت المبكر ^9،10. وقد أدى هذا الدور الهام للMBP في الميالين إلى استخدامه كعلامة للتمييز دبقية قليلة التغصن على حد سواء في التجارب المختبرية والحية ^11.

الكمي لMBP يمكن تحقيقه باستخدام عدة أساليب مختلفة. RT-PCR وتحليل لطخة غربية تسمح لتقدير مستويات MBP تحت نظم العلاج المختلفة. مناعية هو نهج نوعي المشترك الذي يمكن أيضا أن تكون الكمية عندما تستخدم نهج المجهري القائم على الكاميرا. على الرغم من أن هذه الأنظمة هي موثوق بها والأساسية لدراسة التمايز دبقية قليلة التغصن، ولكل من عيوبها الخاصة التي تحد من استخدامها في فحص المخدرات. أولا، كمية من يجد OPCs الأولية أن هناك حاجة لRT-PCR وتحليل لطخة غربية يقلل من عدد من المتغيرات التي يمكن دراستها في وقت واحد. في حين أن الشرط خلية للمناعية أقل من ذلك بكثير، يجب أن تخصص وقت كبير لكل تجربة إذا الكمي هو الهدف. يجب أن يتم القبض على العديد من الصور وبعد ذلك كميا لتسهيل التحليل التجريبي. تصبح هذه المحاذير العقبات الهامة التي يجب مراعاتها للدراسات التي تتطلب تقييم إنتاجية عالية. نحن هنا تصف طريقة التي تستخدم الجوانب الأساسية من كل من مناعية والمنهجيات لطخة غربية لتقدير المايلين، في حين أن الحد بشكل كبير كل من عدد الخلايا المطلوبة والوقت لاستكمال التحليل الكمي.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وجونز هوبكنز من مدرسة الطب.

1. إعداد لوحات الفحص، حلول الأوراق المالية، ومكتب أمين المظالم قاعدة وسائل الإعلام

ملاحظة: استمدت قاعدة الفئران OPC (ساتو) وسائل الاعلام وصفها هنا من الدراسات التي نشرت سابقا ^12،13. قد تكون التركيبات وسائل الإعلام البديلة أيضا متوافقة مع هذا الإجراء.

1. و resuspend بولي-L-ليسين (PLL) إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل في الماء منزوع الأيونات معقمة. ماصة 400 ميكرولتر من PLL مخففة في كل بئر من القاع 24 الأنسجة جيدا طبق ثقافة الصف الأسود الجدران، واضحة.
2. أطباق زراعة الأنسجة معطف لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية الثلاجة.
3. نضح PLL من الأطباق المغلفة السابقة لا يقل عن 20 دقيقة للطلاء. السماح للPLL المتبقية لتجف من البئر عن طريق وضع 24 لوحات جيدة مع الغطاء مواربا جزئيا في زراعة الأنسجةالغطاء. تحقق من أن آبار جافة تماما قبل الطلاء يجد OPCs معزولة. والخلايا لا تلتزم البلاستيك الذي يحتوي السائل PLL الحاضر.
4. إعداد N -Acetyl-L-السيستين (بريدا) حل سهم (1،000x): ذوب 100 ملغم N -Acetyl-L-السيستين (NAC) في 20 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM). قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
5. إعداد محلول المخزون هيدروكورتيزون (1،000x): إضافة 1 مل من الايثانول إلى هيدروكورتيزون 1 ملغ و دوامة حل. إضافة 19 مل من DMEM، مزيج الحل، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية. وقد تبين أن إضافة الهيدروكورتيزون الى وسائل الاعلام قاعدة لتعزيز بقاء الخلايا الدبقية ^14.
6. إعداد د البيوتين حل سهم (5،000x): يذاب 2.5 ملغ من د-البيوتين في 50 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 2/1 × 5 قطرات ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم للمساعدة في حل. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
7. إعداد محلول المخزون الأنسولين (100X): يذاب 25 ملغ الأنسولين في 50 مل من الماء درجة زراعة الأنسجة. إضافة 250 ميكرولتر سو 1 N حمض الهيدروكلوريك وتخلط حتى حل واضح. تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
8. إعداد محلول المخزون ساتو (100X):
   1. إعداد محلول المخزون البروجسترون (25 ميكروغرام / ميكرولتر): يذاب 2.5 ملغ البروجسترون في 100 ميكرولتر من الايثانول.
   2. إعداد الصوديوم محلول المخزون سيلينات (400 نانوغرام / ميكرولتر): ذوب 4 ملغ سيلينات الصوديوم في 100 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 10 مل من DMEM ومزيج.
   3. 100 مل من DMEM، إضافة 1 غرام من البشر APO-ترانسفيرين، 1 غرام من ألبومين المصل البقري، و 160 ملغ من بوتريسين وتخلط إلى حل كامل. إضافة 25 ميكرولتر من محلول المخزون البروجسترون، 1000 ميكرولتر من محلول المخزون سيلينات الصوديوم، وخلط. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
9. إعداد OPC قاعدة وسائل الإعلام: لكل 100 مل من DMEM (مع 4.5 جم / لتر مد الجلوكوز، L-الجلوتامين، و 110 ملغم / لتر الصوديوم البيروفات)، إضافة 100 ميكرولتر حلف شمال الأطلسي، 100 الهيدروكورتيزون ميكرولتر، 20 ميكرولتر د-بيوتين، 1 مل الأنسولين، 1 مل الأسهم ساتو، و 100 ميكرولتر من العناصر النزرة B،2 مل B-27 ملحق (50X)، و 1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (100X). تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
10. إعداد PDGF-AA حل سهم (1،000x): ذوب 250 ميكروغرام في 12.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ زلال المصل البقري (BSA) لجعل 20 ميكروغرام حل / مل. قسامة ومخزن في -80 درجة مئوية.
11. إعداد وسائل الاعلام انتشار OPC: وسائل الإعلام قاعدة OPC تستكمل مع 20 نانوغرام / مل PDGF-AA.
12. إعداد وسائل الإعلام التمايز OPC: وسائل الإعلام قاعدة OPC تستكمل مع 45 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين.
13. إعداد العمود العازلة: 500 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 2.5 غرام من BSA و 2 مل من 0.5 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2. دماغ الفئران تشريح

ملاحظة: يتم استخدام الجراء P5-P7 الفئران في هذا البروتوكول. كل القشرة الفئران الجرو ينتج حوالي 1،5-2،0 × 10 خلايا إيجابية ⁶ A2B5.

1. تعقيم جميع المعدات تشريح باستخدام 2506؛ C حبة ساخنة معقم.
2. إضافة 15-20 مل من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} إلى 50 مل أنابيب مخروطية. واحد 50 مل أنبوب مخروطي يكفي لمدة 3-4 القشور الفئران الجرو. وضع أنابيب مخروطية 50 مل على الجليد. استخدام أنابيب مخروطية 50 مل لعقد أنسجة القشرة مكعبات أثناء تشريح.
3. إضافة برنامج تلفزيوني الباردة إلى 10 سم طبق بتري. وسيتم استخدام هذا الطبق لتشريح تحت المجهر الضوئي.
4. التضحية الفئران الوليدة عن طريق قطع الرأس مع مقص جراحي كبير. رذاذ الرأس مع الايثانول 70٪.
5. استخراج الدماغ كله
   1. قطع باستخدام مقص صغير في الجلد أسفل خط الوسط وخلف الأذنين واللوحات الجلد قشر الظهر. قطع الجمجمة أسفل خط الوسط ابتداء من جذع الدماغ وتنتهي في العينين. يجب الحرص على عدم قطع عميق جدا من أجل الحفاظ على بنية القشرة الكامنة.
   2. جعل اثنين من التخفيضات الجانبية أقل شأنا من المخيخ عن طريق إدراج مقص جراحي صغيرة في الثقبة العظمى. جعل خفض إضافي بين العينين، والنملerior إلى بصيلات الشم.
   3. قشر بعناية كل نصف الجمجمة الخلفي. إزالة الدماغ كله وضعها في طبق بتري 10 سم مملوءة PBS الباردة.
6. تحت المجهر ضوء تشريح، وإزالة بصيلات الشم والمخيخ مع الملقط الجراحية الدقيقة.
7. الوجه الدماغ بحيث السطح البطني هو مرئية تحت المجهر الضوئي.
8. باستخدام ملقط غرامة على التوالي أداء تشريح حادة عن طريق وضع ملقط نصائح المغلقة بين القشرة وتحت المهاد إلى عمق حوالي 2/3 من الدماغ. مرة واحدة ملقط هي في مكان يسمح نهايات لفتح. تكرار لنصف الكرة الأرضية الأخرى.
9. ندف القشرة من منطقة ما تحت المهاد ومنطقة الدماغ المتوسط.
10. إزالة ما تحت المهاد، المهاد، والدماغ المتوسط ​​من خلال عقد الدماغ المتوسط ​​في السطح الخلفي وتقشير نحو نهاية الأمامي من الدماغ. قطع الاتصالات الأمامية.
11. إزالة الحصين من قبل تدوي إلى الخارج ثم قطع ارتباطهالقشرة باستخدام غرامة ملقط تشريح عازمة.
12. إزالة المتبقية المخطط عن طريق التخلص من ذلك من القشرة الكامنة في حركة قطري الخارج باستخدام غرامة ملقط تشريح عازمة.
13. مسح أي الأوعية الدموية والسحايا من السطح البطني من القشرة.
14. الوجه الدماغ بحيث السطح الظهري مرئيا. يجب السحايا والأوعية الدموية يكون واضحا. السحايا قشر من القشرة الكامنة باستخدام ملقط تشريح غرامة. بدء تقشير من حاسة الشم الموقع لمبة المرفق.
15. أكمل الخطوات 2،4-2،14 لما مجموعه 3-4 الفئران الوليدة.
16. ضع 3-4 تشريح القشور الفئران الجرو في طبق بتري جاف وختم بشفرة حلاقة معقمة حتى تتحقق 1 مم قطع × 1 مم. جمع الأنسجة بشطفها الطبق مع برنامج تلفزيوني من واحد 50 مل أنبوب مخروطي (الخطوة 2) ثم ضع مرة أخرى على الجليد.

3. الأنزيمية والميكانيكية تفارق الأنسجة

ملاحظة: للحصول على هذه الخطوة، فمن المستحسن مجموعة التفكك العصبي القائم على غراء. باستخدام نيالاورال كيت التفكك (P)، ووصف خطوات خاصة التي هي الأمثل لعزل OPC.

1. إعداد انزيم تفارق الأول عن طريق تمييع انزيم P مع العازلة المناسبة. سيتم معلق محتويات كل مخروطي 50 مل (1 عينة) مع ما مجموعه 1،950 ميكرولتر من مزيج الانزيم. مكان في مزيج انزيم في C حمام 37 درجة لمدة 10 دقيقة.
   1 عينة: 1900 ميكرولتر من الاحتياطي + 50 ميكرولتر من انزيم غراء
2. تدور جميع أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي على 3-4 مكعبات الفئران القشور الجرو في 300 x ج لمدة 3 دقائق.
3. نضح طاف وإضافة 1950 ميكرولتر من محلول أنزيم لكل أنبوب عينة وتحطيم بيليه من أنبوب للقلب ويهز بلطف.
4. احتضان في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 15 دقيقة مع دوران أنبوب المستمر.
5. خلال 5 دقائق الأخير من الحضانة، وإعداد مزيج انزيم الثاني A. تمييع الانزيم في المخزن المناسب لها. سيتم إضافة ما مجموعه 30 ميكرولترلكل 50 مل أنبوب عينة مخروطي الشكل.
   1 عينة: 20 ميكرولتر من الاحتياطي + 10 ميكرولتر من انزيم
6. بمجرد الانتهاء من حضانة إضافة 30 ميكرولتر من مزيج انزيم الثاني إلى كل أنبوب وعكس إلى المزيج.
7. باستخدام الزجاج ماصة باستير المرفقة إلى وحدة تحكم ماصة، تنأى ميكانيكيا الأنسجة بواسطة pipetting 10-15 مرات أو حتى يتم تخفيض قطعة نسيج في حجم وأصبح الحل غائمة. العودة العينة إلى 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 15 دقيقة مع دوران مستمر.
8. ماصة كل الأنسجة جناسة عينة 10-15 مرات باستخدام ماصة 1 مل.
9. ماصة كل الأنسجة جناسة عينة 15-20 مرات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر
10. إعادة جميع العينات إلى 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 10 دقيقة مع دوران مستمر.
11. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} لكل عينة وتصفية جناسة من خلال مرشح 40 ميكرون المسام وضعت أكثر من 50 مترأنبوب لتر. شطف تصفية مع 1-2 مل إضافية من برنامج تلفزيوني.
12. تجميع جميع العينات جناسة في أنبوب واحد 50 مل مخروطي الشكل والحصول على عدد خلايا العام.
13. بعد أداء عدد الخلايا، وتقسيم جناسة بالتساوي إلى 15 مل أنابيب مخروطية (1 أنبوب لكل عينة). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10-12 دقيقة في 300 × ز.

4. المضادة للA2B5 الخرزة التطبيق، العمود تنقية، والطلاء

1. إجراء عمليات حسابية لعازلة عمود وميكروبيدات مكافحة A2B5. إضافة 7 ميكرولتر العمود العازلة لكل 1 × ¹⁰ 6 خلايا. إضافة 2 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة A2B5 لكل 1 × ¹⁰ 6 خلايا.
2. الجمع بين كل من العينات عن طريق إعادة التعليق الخلايا في حجم ما مجموعه 10 مل من العازلة العمود والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10-12 دقيقة.
3. resuspend الكرية خلية في كمية مناسبة من العازلة العمود المحسوبة في الخطوة 4.1. إذا كان بيليه هو كبير وفضفاض، إضافة ما يقرب من نصف فقط من حجم عازلة عمود للحفاظ على المضادةالجسم في التركيز المناسب في إعادة تعليق الخلية.
4. احتضان تعليق خلية لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
5. إضافة ميكروبيدات مكافحة A2B5 (المحسوبة في الخطوة 4.1)، عكس عدة مرات، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. عكس بلطف الأنبوب عدة مرات كل 10 دقيقة. حضانة مرات أطول قد تزيد الغلة الخلية ولكن قد تزيد غير محددة ملزمة.
6. إضافة 5 مجلدات من العازلة العمود. إذا ومعلق الخلايا في حجم 1 مل، إضافة 5 مل من العازلة العمود، في حين إذا ومعلق الخلايا في 2 مل، إضافة 10 مل من العازلة العمود.
7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز.
8. تحديد عدد الأعمدة ليرة سورية وستكون هناك حاجة لتنقية. عمود واحد LS يكفي لمدة 15-20 × 10 ⁶ مجموع الخلايا.
9. resuspend الكرية خلية في 1000 ميكرولتر من العازلة عمود في العمود LS المستخدمة.
10. رئيس كل عمود LS بإضافة 5 مل من العازلة العمود. جمع من خلال تدفق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. مرة واحدة في بو عمودلقد مر ffer تماما من خلال الغرفة العليا، وتطبيق 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل عمود وتسمح للخلايا لتشغيل من خلال طريق الجاذبية.
    ملاحظة: إذا كانت كثافة الخلايا عالية جدا، والعمود قد تشغيل بطيئة.
11. على الفور بعد أن مرت تعليق الخلية من خلال العمود، إضافة ببطء 3 مل من العازلة العمود إلى كل عمود لغسل الخلايا غير منضم. إذا غسل يعمل بسهولة من خلال العمود (1 قطرة كل 30-45 ثانية)، ويغسل مرتين إضافية مع 3 مل من العازلة العمود.
12. إزالة كل عمود ووضعه على أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 5 مل من العازلة عمود ويغرق المنطقة العازلة من خلال العمود بمعدل سريع باستخدام المكبس البلاستيكية التي يتم حزم مع العمود. سوف تغرق طرد الخلايا ملزمة الإفراج عنهم من العمود.
13. زيادة نقاء طريق تشغيل العينة من خلال الجولة الثانية من الأعمدة ليرة سورية. استخدام ثلث عدد الأعمدة المستخدمة أثناء مرور الأول. رئيس الأعمدة مع 5 مل من العازلة العمود.تسمح المخزن المؤقت العمود بالمرور عبر مجلس الشيوخ.
14. منذ حجم التعليق الخلية ستكون أكبر من ذلك بكثير، تطبق بالتساوي 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل عمود والسماح للتعليق بالمرور عبر الغرفة العليا من العمود قبل تجديد مع 1000 ميكرولتر إضافية.
15. مرة واحدة تعليق خلية تم تطبيقه بشكل كامل في الجولة الثانية من الأعمدة، وغسل 2-3 مرات مع 3 مل من العازلة العمود.
16. إزالة كل عمود ووضعه على العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 5 مل من العازلة عمود ويغرق المخزن المؤقت باستخدام المكبس البلاستيكية التي يتم حزم مع العمود. سوف تغرق طرد الخلايا ملزمة الإفراج عنهم من العمود.
17. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 12-15 دقيقة. يجب أن تظهر بيليه المضغوط.
18. resuspend الكرية خلية في 5-10 مل من وسائل الاعلام OPC انتشار قبل تحسنت (وسائل الإعلام قاعدة OPC تستكمل مع PDGF-AA 20 نانوغرام / مل).
19. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
20. لوحة الخلايا. تمييع الخلايا إلى 60000 خلية / مل مع وسائل الإعلام OPC انتشار الأسلحة النووية. في كل أسود، واضح أسفل 24 أيضا، الماصة 500 ميكرولتر من الخلايا على طول الجانب من البئر للحصول على 30000 خلايا لكل بئر. مزيج من الخلايا عن طريق الهز لوحة أفقيا باستخدام الرقم ثمانية الحركة. إذا كان أداء الفحص في 48، 96، أو 384 جيدا لوحات، إضافة 15000، 7500، أو 1500 خلية لكل جيدا، على التوالي. ويمكن تعديل هذه الأرقام حسب مواصفات لوحة على حدة.
21. إعداد لوحة منفصلة لليوم 0 الثقافات مراقبة خط الأساس. ينبغي أن تكون ثابتة هذه لوحة التحكم مع بارافورمالدهيد 4٪ كما هو موضح في القسم 5.7، عند بدء التمايز في اليوم 0.
22. ثقافة الخلايا في وسائل الاعلام انتشار OPC عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام مع أي تغيير وسائل الاعلام.

5. تحريض OPC التفاضل والارتباط مع 4٪ لامتصاص العرق

ملاحظة: عند اختبار تأثير جزيئات صغيرة على oligodendrogenesis، نحن dissolv بشكل روتينيالمخدرات الإلكترونية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لإعداد 1،000x الأسهم التي يمكن تخزينها بعد ذلك في -80 درجة مئوية، وتضعف مباشرة إلى وسائل الإعلام ساتو للحصول على تركيز النهائي من 0.1٪ DMSO. وقد لاحظنا أي تغيير في أي OPC انتشار أو التمايز تستخدم هذه تركيز DMSO (لا تظهر البيانات).

1. قبل دافئ وسائل الاعلام قاعدة OPC إلى 37 درجة مئوية، وذوبان الجليد الأسهم العلاج من تعاطي المخدرات إلى درجة حرارة الغرفة. عند إجراء العلاج في نسختين، وإعداد ما يقرب من 1.25 مل من وسائل الاعلام في مجموعة العلاج في أنبوب 1.5 مل. للحصول على عينات ثلاث نسخ، استخدام 2 أنابيب قدرة مل الطرد المركزي لحساب الركود.
2. إعداد يمزج سيد العلاج للآبار تكرار عن طريق تمييع الأسهم العلاج مباشرة إلى وسائل الإعلام قاعدة OPC. لفترة وجيزة دوامة أو بلطف مزيج كل mastermix لضمان التوزيع المتجانس لتلقي العلاج.
3. إعداد 45 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين _(T 3)، والسيطرة الإيجابية وسيلة مناسبة كما سيطرة سلبية. تمييع 10 ملي تي ₃ الأسهم1: 1000 في 1 مل من وسائل الاعلام قاعدة OPC ومن ثم مزيد من تمييع في مزيج العلاج الرئيسي للحد من تركيز النهائي من DMSO إذا لزم الأمر.
4. نضح في وسائل الإعلام من الآبار الثقافة مجموعة العلاج في وقت واحد وذلك لتجنب تجفيف الخلايا. استخدام 200 ميكرولتر طرف الماصة على نهاية الماصة الزجاج باستور لتجنب كشط المادة السوداء من جانبي البئر وفي الثقافة.
5. ببطء إضافة 500 ميكرولتر من mastermix العلاج على طول الجانب من البئر باستخدام الماصة 1 مل.
6. احتضان الثقافات لمدة الإطار الزمني المطلوب، وأداء التبادل الاعلامى الكامل مع وسائل الإعلام معاملة جديدة كل 2-3 أيام. ونلاحظ بشكل روتيني م ب ب 30-40٪ ⁺ الثقافة بعد 4 أيام في وسائل الإعلام التمايز.
7. في نهاية فترة العلاج المطلوبة، وإعداد الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) أو ذوبان الجليد الأسهم المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة. تنبيه: PFA غير سامة للغاية ويجب أن يكون مستعدا في غطاء الدخان.
8. نضح في وسائل الاعلام وإضافة ببطء 4001؛ لتر من منهاج العمل إلى جانب البئر لإصلاح الخلايا. احتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. نضح PFA وإضافة ببطء 500 ميكرولتر من العقيمة مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} إلى جانب البئر لغسل الخلايا. تكرار غسل ما مجموعه مرتين أخريين. لا نضح غسل النهائي.
10. التفاف لوحة في بارافيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التجهيز لاحق أو الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية. لوحات يمكن تخزينها لعدة أسابيع.

6. سيتولوجية مناعية والكمي للبروتين النخاعين الأساسي

ملاحظة: عند تنفيذ إجراءات التعامل مع السائل في 24 لوحات جيدة، فمن المستحسن أن نعمل بسرعة لتجنب تجفيف الخلايا. هنا، ينصح استخدام الشافطة فراغ متعدد القنوات ومتعدد القنوات الماصة.

1. جلب لوحة لدرجة حرارة الغرفة، ونضح الآبار، وإضافة 250 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 5٪مصل الماعز العادي (خ ع). احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الهز المداري لطيف.
2. تحضير محلول الحضانة الأولية عن طريق تمييع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للم ب ب الضد 1: 1000 والضد الأرنب بولكلونل مكافحة الأكتين 1: 200 في مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} تحتوي على 5٪ خ ع. بدلا من ذلك، الأرنب بولكلونل مكافحة Olig2 في 1: 1000 ويمكن استخدامها لدبقية قليلة التغصن تطبيع معين في الثقافات الدبقية مختلطة. إعداد الحل الأساسي يكفي لاستيعاب 250 ميكرولتر لكل بئر.
3. احتضان الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية خلال الليل ل16-18 ساعة مع الهز المداري لطيف.
4. نضح الحل حضانة الابتدائي وغسل الخلايا 3 × 10 دقيقة مع 500 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} في درجة حرارة الغرفة مع الهز المداري لطيف.
5. في حين غسل لوحة، وإعداد حل حضانة الثانوي عن طريق تمييع لمكافحة فأر 680 والمضادة للأرنب 800 الأجسام المضادة 1: 500 في مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم ²⁺ والمغنيسيوم ²⁺⁾ تحتوي على 5٪ خ ع. تقليل التعرض للضوء المحيط عند إعداد هذا الحل.
6. نضح غسل النهائي وإضافة 250 ميكرولتر من محلول الحضانة الثانوي. حماية لوحة من الضوء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الهز المداري لطيف.
7. نضح الحل حضانة الثانوية، ويغسل الآبار 3 × 10 دقيقة مع 500 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+)} في درجة حرارة الغرفة مع الهز المداري لطيف.
8. مسح لوحة باستخدام نظام التصوير قادر على الكشف عن 700 نانومتر و 800 نانومتر الانبعاثات مضان. كنقطة انطلاق، تعيين الوصل تعويض إلى 3 والحساسيات إلى 1.5 ل م ب ب، 5.0 لأكتين، و 3.5 لOlig2. ضبط القيم حساسية حسب الحاجة لتجنب التعرض المفرط إشارة.
9. تحديد مدى oligodendrogenesis استخدام أساليب تعتمد على البرمجيات شبه الآلي.
   1. باستخدام البرنامج، تعيين وضع تحليل لوحة ل"24 حسنا" ومواءمة الدوائر حول ركان محيط الخارجي من الآبار الممسوحة ضوئيا. تعيين القناة التطبيع "800" وتصدير الكلية والنسبية كثافة مضان لنانومتر 700 (ب ب) و 800 نانومتر (Olig2 / أكتين) القنوات.
   2. تقسيم كثافة في 700 نانومتر كثافة في 800 نانومتر لإعطاء التعبير MBP تطبيع في وحدات مضان النسبية. حساب متوسط ​​قياسات تكرار وتوسيع نطاق التعبير إلى يوم 0 ضوابط + PDGF حسب الحاجة للتحليل.

النتائج

يتم عزل يجد OPCs-A2B5 إيجابي من خلال تحديد الخلية الإيجابية باستخدام نظام فصل العمود المغناطيسي. قبل إجراء العزل، تتم إزالة كامل الدماغ من الفئران الوليدة التي هي بين P5 وP7. بمجرد فصل الدماغ كله بنجاح من الجمجمة، وإزالة المصابيح حاسة الشم والمخيخ باستخد?...

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة سريعة وموثوق بها لعزل يجد OPCs الفئران وقياس في oligodendrogenesis المختبر استجابة لعوامل التجريبية. عن طريق اختيار إيجابية، وتستخدم عوائد عالية من يجد OPCs قابلة للحياة ونقية مباشرة لأغراض تجريبية. هذه الطريقة يبسط العزلة، زراعة، والخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor