大鼠少突胶质祖文化的制备和使用双红外荧光扫描Oligodendrogenesis的量化

摘要

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

摘要

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

引言

在哺乳动物中枢神经系统（CNS）高效神经传导需要通过少突胶质细胞轴突的髓鞘。在开发过程中，少突胶质细胞从被认为来自发展中国家前脑和神经管¹的心室区迁移少突胶质细胞祖细胞（OPCs的）池出现。迁移后的OPCs分化为成熟的，少突胶质细胞髓鞘不仅方便高效的冲动传播，而且还提供与轴突营养支持^2。成人CNS认为，分散在包括所有的细胞³约5-8％的灰质和白质的OPC充裕的人口。以下脱髓鞘损伤，OPCs的迁移到损伤部位，增殖和分化，以取代在暴露轴突丢失或损坏的髓鞘。然而，在一些疾病/损伤设置，这一过程被发现是低效率的，或者可以完全失败^4。而慢性脱髓鞘被认为是增加性疾病，高效oligodendrogenesis和髓鞘再生的负担可能减轻症状^5。因此它一直感兴趣的研究的OPCs 体外测定对oligodendrogenesis实验因素的影响。

洞察少突胶质细胞分化的不同阶段已经由阶段细胞特异性标记物的鉴定成为可能。自我更新的早期祖细胞可以通过（PDGFRα）血小板衍生的生长因子受体α的表达式定义，神经/神经胶质细胞抗原2（NG2）和A2B5 ^{6 - 8。}作为OPCs的启动其分化程序，并从细胞周期的撤回，它们下调这些标记物的表达，并开始表达指示premyelinating少突胶质细胞，包括环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNPase）和O4的蛋白质。最后，它们分化成更成熟oligodendrocytes特征是髓鞘相关蛋白，包括髓鞘相关糖蛋白（MAG），蛋白脂质蛋白（PLP）和髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达。 MBP是细胞内周膜蛋白和髓鞘的主要组成部分。缺乏MBP小鼠发展严重的表型在中枢神经系统髓鞘是显著下降导致震颤，抽搐和过早死亡^9,10。在髓鞘形成的MBP这个重要作用，导致其作为在体外和体内 ¹¹少突胶质细胞分化的标记物使用。

可以使用多种不同的方法来实现的MBP的定量。 RT-PCR和Western blot分析允许在不同的治疗方案MBP水平的定量。免疫细胞化学是一种常见的定性方法，当使用基于相机的显微镜方法也可以是定量的。虽然这些系统是可靠的，根本少突胶质细胞分化的研究中，他们每个人都有自己的缺点限制了它在药物筛选使用。首先，所需的RT-PCR和Western印迹分析的主要的OPCs量减少，能同时被检查变量数。而进行免疫​​细胞化学电池的要求低得多，如果量化是目标相当长的时间，必须专门用于每次实验。众多的图像必须被捕获，然后量化，以方便实验分析。这些警告成为考虑需要高吞吐量评估研究的重要障碍。在这里，我们描述了利用来自免疫细胞化学和髓鞘定量Western印迹方法都基本方面的方法，而显著减少所需的细胞的数量和时间来完成定量分析。

研究方案

涉及受试动物的程序已通过机构动物护理和使用委员会（IACUC）和医学的约翰霍普金斯学院。

1.检测板，股票解决方案，和OPC基本媒体的制备

注:此处描述的大鼠OPC基地（佐藤）媒体已经从先前公布的研究得出^12,13。替代媒体制剂也可以是与此过程相兼容。

1. 悬浮聚-L-赖氨酸（PLL），以在无菌去离子水中10微克/ ml的浓度。吸移管400微升稀释的PLL成黑色壁，透明底的24孔组织培养级培养皿的每个孔中。
2. 在37℃组织培养箱中或在4℃冰箱中过夜2小时外套组织培养皿。
3. 吸PLL从涂层菜至少20分钟前电镀。允许通过将24孔板与盖部分微开在组织培养的其余PLL来从井干引擎盖。验证井电镀孤立的OPC之前完全干燥。细胞不会粘附到具有液体PLL目前塑料。
4. 制备 N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）原液（1000倍）:在20ml Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的溶解100 毫克 N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）。分装和储存在-20°C。
5. 制备氢化可的松原液（1000倍）:1毫升乙醇添加到1毫克氢化可的松和漩涡溶解。添加19毫升DMEM中，在-20℃搅拌该溶液中，等分试样并储存。加入氢化可的松到基础介质的已被显示增强神经胶质细胞¹⁴的存活。
6. 制备D-生物素原液（5000倍）:将2.5毫克d-生物素的50ml PBS中。加入0.1N NaOH中的1-2×5微升滴在溶解的作用。分装和储存在-20°C。
7. 制备胰岛素原液（100×）:在50毫升的组织培养级水中溶解25mg的胰岛素。加入250微升Ø˚F的1N HCl并混合直到溶液澄清。用0.22微米的过滤器，并储存于4℃下长达6周消毒。
8. 制备佐藤原液（100×）:
   1. 制备孕酮原液（25微克/微升）:在100μl的乙醇溶解2.5毫克孕酮。
   2. 准备亚硒酸钠储备液（400纳克/微升）:在100微升的0.1N氢氧化钠溶解4毫克亚硒酸钠。加入10 mL的DMEM混匀。
   3. 向100ml的DMEM，补充1克人脱辅基转铁蛋白，1克牛血清清蛋白，和160毫克的腐胺和混合到完全溶解。加入25微升黄体酮原液，1000微升亚硒酸钠原液，混匀。分装和储存在-20°C。
9. 制备的OPC基媒体:每100毫升的DMEM（4.5 g / L的D-葡萄糖，L-谷氨酰胺，和110毫克/升丙酮酸钠），加入100微升的NAC，加入100μl氢化可的松，20微升D-生物素，将1ml胰岛素1毫升佐藤股票，100微升微量元素B，2毫升的B-27补充物（50×），和1ml青霉素/链霉素（100倍）的。用0.22微米的过滤器，并储存在4℃下灭菌。
10. 制备PDGF-AA储液（1000倍）:将250微克12.5毫升的PBS与0.1％牛血清白蛋白（BSA），以使20微克/毫升的溶液。分装和储存在-80℃。
11. 准备OPC增殖媒体:OPC基地媒体辅以20毫微克/毫升PDGF-AA。
12. 准备OPC分化培养基:辅以45纳米碘甲状腺原氨酸OPC基地的媒体。
13. 制备柱缓冲液:向500毫升的PBS中，添加2.5克的BSA和2的0.5M乙二胺四乙酸中的溶液（EDTA）和调节pH值至7.2。用0.22微米的过滤器，并储存在4℃下灭菌。

2.大鼠脑解剖

注:P5-P7幼鼠在本协议所使用。各大鼠小狗皮质产生约^1.5-2.0×10 6 A2B5阳性细胞。

1. 消毒使用250的所有清扫设备6;℃加热珠灭菌。
2. 加15-20毫升的PBS（不含Ca ²⁺和Mg ^2+）到50毫升锥形管中。一个50ml锥形管中是足够3-4大鼠小狗皮层。将50ml锥形管冰。使用50ml锥形管清扫期间举行切块皮层组织。
3. 加入冷PBS到10cm培养皿。这道菜将在光学显微镜下可用于解剖。
4. 通过与大型手术剪刀斩首牺牲幼鼠。喷雾头，用70％的乙醇。
5. 提取全脑
   1. 用小剪刀切开皮肤下的中线和耳朵和剥离皮瓣背后。切开头盖骨下来中线从脑干开始到结束的眼睛。小心不要太过严厉，以维护底层皮层的结构。
   2. 使两侧切口插入小型手术剪入枕骨大孔逊色于小脑。使眼睛之间的附加切口，蚂蚁erior至嗅球。
   3. 小心剥离颅骨各占一半回来。在10cm培养皿填充有冷PBS取出全脑和地点。
6. 根据解剖光镜下取出嗅球和小脑用细镊子手术。
7. 翻转大脑以便腹面是在光学显微镜下可见的。
8. 用细镊子直通过将皮质和下丘脑之间封闭的镊子技巧的深度关于大脑的2/3进行钝性分离。一旦镊子到位允许的端部打开。重复其他半球。
9. 挑逗下丘脑和中脑区皮层。
10. 通过保持脑在其后表面和剥离它朝向脑的前端去掉下丘脑，丘脑，中脑。切断前的连接。
11. 向外洪亮地传颂着，然后切断其连接删除海马皮质用细弯夹层镊子。
12. 用细弯夹层镊子向外斜向运动从底层皮质再杀它删除剩余纹状体。
13. 清除任何血管和脑膜从皮质腹面。
14. 翻转大脑使得背表面是可见的。脑膜和血管应当是显而易见的。用细镊子剥离从底层皮层剥离脑膜。开始从嗅球连接位置剥离。
15. 总共3-4幼鼠完整步骤2.4-2.14。
16. 放置3-4解剖鼠小狗皮质成干培养皿用无菌刀片切碎直至1毫米×1mm的块被实现。通过从一个50ml锥形管（第2步），然后放回到冰上用PBS漂洗菜收集组织。

3.酶和机械组织解离

注意:对于这个步骤，建议使用基于木瓜蛋白酶解离的神经套件。使用氖乌拉尔解离试剂盒（P）时，这是最适合的OPC隔离特殊步骤进行说明。

1. 通过稀释酶P与适当的缓冲液制备第一离解酶。每50ml锥形（1样品）中的内容将与总的1,950微升酶混合物的再悬浮。地点在一个37℃浴中的酶混合物10分钟。
   1样品:1900微升缓冲+ 50微升木瓜酶
2. 自旋所有50ml含3-4切丁大鼠小狗皮质锥形管在300×g离心3分钟。
3. 吸出上清液，并添加1,950微升酶溶液，以每个样品管中，颠倒试管并轻轻晃动掰开沉淀。
4. 孵育在37℃组织培养孵化用于与连续的管旋转15分钟。
5. 在过去的5分钟的孵化，准备第二酶混合物A.稀释在适当的缓冲酶。共30微升将被添加以每次50ml锥形样品管中。
   1样品:20微升缓冲液+10μl的酶的
6. 一旦温育完成添加30微升第二酶组合，以每管并颠倒混合。
7. 使用连接到吸移管控制器的玻璃巴斯德移液管，机械吹打10-15倍或直到组织片尺寸减小，并且溶液变得混浊离解的组织。返回样品到37℃组织培养孵化与连续旋转15分钟。
8. 使用1毫升吸管吸取各组织匀浆样品10-15次。
9. 用200微升吸管吸取各组织匀浆样品15-20倍
10. 返回所有样品至37℃组织培养孵化10分钟以连续旋转。
11. 加入10毫升的PBS（以^钙离子和^镁离子）向每个样品和过滤匀浆通过放置在一个50微米的40微米的微孔过滤升管。用另外1-2毫升的PBS冲洗过滤器。
12. 池中的所有样品匀浆成1个50毫升的锥形管，并获得总细胞数。
13. 在进行细胞计数后，平分匀浆成的15毫升锥形管中（1管每个样品）。离心机在300×g的10-12分钟。

4.抗A2B5珠应用，柱纯化，以及电镀

1. 执行列缓冲器和抗A2B5微珠计算。加7微升柱缓冲液为每^1×10 6个细胞。添加2微升反A2B5微珠为每^1×10 6个细胞。
2. 在300 xg离心重悬细胞以10ml柱缓冲液和离心机的总体积为10〜12分钟，结合所有样品。
3. 重悬在柱缓冲液适量细胞沉淀如在步骤4.1计算。如果颗粒是大的和松散，只添加柱缓冲液的体积的约一半，以保持反体在细胞再悬浮在适当的浓度。
4. 孵育细胞悬浮液在4℃10分钟。
5. 添加抗A2B5微珠（在步骤4.1计算的），颠倒几次，并在4℃下孵育30-60分钟。轻轻颠倒管每10分钟几次。较长的孵育时间可能会增加细胞产量，但会增加非特异性结合。
6. 加入5倍体积的柱缓冲。如果将细胞再悬浮于1毫升的体积，加入5 ml柱缓冲液中，而如果再悬浮于2ml的细胞，加入10 ml柱缓冲液中。
7. 离心机在300×g下10分钟。
8. 确定多少LS柱将需要的纯化。其中LS柱足以15-20×10 ⁶个细胞。
9. 重悬在1000微升每LS柱的柱缓冲液的细胞沉淀被使用。
10. 素通过加入5ml柱缓冲液的各LS柱。收集通过在50ml锥形管中的流动。一旦该列卜FFER已完全通过上部腔室通过，应用1000微升的细胞悬液到每一列和允许细胞通过重力运行。
    注意:如果细胞的密度太高，则该列可能运行缓慢。
11. 细胞悬浮液已通过该柱后，立即缓慢3毫升柱缓冲液添加到每个列以洗涤未结合的细胞。如果洗涤容易通过塔（1滴为每30-45秒）运行时，用3ml柱缓冲液洗两次。
12. 删除每一列，并将其放置在一个15毫升的锥形管。加入5 ml柱缓冲液中，并在使用该包装与该列的塑料柱塞以很快的速度扎通过该柱的缓冲液中。插铣会打跑结合的细胞从柱释放他们。
13. 通过第二轮LS列运行示例增加纯度。使用第一遍期间使用列数的三分之一。素用5ml柱缓冲液中的列。允许柱缓冲液穿过上部腔室。
14. 自细胞悬浮液的体积会大得多，均匀涂抹1000微升细胞悬液，以每列，并且允许该悬浮液用额外的1000微升补充之前通过该柱的上部腔室通过。
15. 一旦进入细胞悬浮液已完全施加到第二轮列，用3ml柱缓冲液洗2-3次。
16. 删除每一列，并将其放置在一个无菌的15毫升锥形管。加入5 ml柱缓冲液中，沉浸使用打包与列塑料柱塞缓冲区。插铣会打跑结合的细胞从柱释放他们。
17. 离心在300 xg离心所述细胞悬浮液为12-15分钟。小球应该出现紧凑。
18. 重悬细胞沉淀在5-10毫升预热的OPC扩散介质（辅以PDGF-AA 20毫微克/毫升的OPC基础媒体）的。
19. 算使用血球细胞。
20. 板上的细胞。稀释细胞使用OPC扩散介质60,000个细胞/毫升。进入每个黑色，透明底24孔，吸管500微升沿井的侧细胞获得每孔30,000个细胞。通过水平摇动板采用八字形运动混合细胞。如果在48，96，或384孔板进行测定，添加15,000，7500或1500细胞每孔，分别。这些数字可以根据个人板的规格进行调整。
21. 准备一个单独的盘为0天，基线控制文化。这个控制板应用4％多聚甲醛如在第5.7节描述的，当分化在第0天开始。
22. 培养细胞中的OPC增殖培养基中于37℃下进行3天，没有媒体的变化。

5.诱导分化OPC和固​​定用4％多聚甲醛

注:当测试小分子对oligodendrogenesis的影响，我们经常dissolvÈ药物的二甲亚砜（DMSO）中，制备1000倍的股票，然后可以保存在-80℃，并直接稀释到佐藤媒体，以获得0.1％的DMSO的最终浓度。我们观察到在任一OPC增殖或分化用DMSO中该浓度没有改变（数据未显示）。

1. 预暖的基础OPC媒体至37°C和解冻药物治疗股至室温。当在重复执行处理，在1.5ml管准备大约将1.25ml每个治疗组的介质。对于一式三份样品，使用2个毫升容量离心管占松弛。
2. 通过稀释处理股直接进入OPC基础媒体准备重复孔治疗预混液。简言之涡或轻轻拌匀每个mastermix，保证了治疗的均匀分布。
3. 制备45纳米甲状腺素（T _3）作为阳性对照和相应的车辆作为阴性对照。稀释10毫米_T第3股1:1000于1ml的OPC基础介质中，然后在治疗主混合物进一步稀释如果需要降低的DMSO的最终浓度。
4. 吸从培养孔中一个治疗组的媒体在一个时间，以避免干燥的细胞。使用在玻璃巴斯德吸管的端部的200微升吸管尖以避免从井的侧面和向培养刮掉黑色材料。
5. 慢慢加入500μl治疗反应体系的沿井使用1毫升移液管的侧面。
6. 孵化培养所需的时间内，用新鲜的处理介质进行完整媒体交换每2-3天。后分化媒体4中的日子里我们经常观察到30-40％的MBP ⁺文化。
7. 在所需的治疗期结束时，准备新鲜的4％多聚甲醛（PFA）或解冻冷冻的储存到室温。注意:PFA是剧毒的，必须在通风橱来制备。
8. 吸媒体，并慢慢加入4001，L的PFA到孔以固定细胞的侧面。将培养板在室温下20分钟。
9. 吸出PFA和慢慢加入500μl无菌的D-PBS（与^钙离子和^镁离子）的添加到井侧以洗涤细胞。重复洗涤共两次。不要吸出最后的清洗。
10. 包裹在封口膜和存储该板在4℃下用于以后的处理，或直接进入下一个步骤。板可以储存数周。

6.免疫组化和定量髓鞘碱性蛋白

注意:在24孔板进行液体处理程序时，推荐的工作速度快，以避免干燥的细胞。这里，建议使用多通道真空吸气器和多通道吸管的。

1. 使板至室温，吸出孔中，并加入250微升的D-PBS（与^钙离子和^镁离子）的含有0.1％的Triton X-100和5％正常山羊血清（NGS）。在室温下孵育该板1小时，轻轻轨道振荡。
2. 通过稀释的小鼠单克隆抗-MBP抗体1制备主培养溶液:1000和兔多克隆抗肌动蛋白抗体1:含5％NGS 200中的D-PBS（与^钙离子和^镁离子）。可替代地，兔多克隆抗Olig2的以1:1000，可用于在混合胶质细胞培养少突胶质细胞特异性正常化。准备足够首要解决，以适应每孔250微升。
3. 在4℃孵育第一抗体过夜16-18小时轻轻轨道振荡。
4. 吸出主培养溶液中并在室温下洗涤细胞3×10分钟用500μlD-PBS（与^钙离子和^镁离子）的温和轨道振荡。
5. 而洗涤平板，通过稀释抗鼠680和抗兔800抗体1准备辅助孵化的解决方案:在D-PBS 500（有^钙 和Mg ^2+）含5％NGS。编制本解决方案时，最大限度地减少环境光曝光。
6. 吸出最后的清洗，并添加250微升二次孵化的解决方案。从光保护板并在室温下孵育其1小时轻轻轨道振荡。
7. 吸辅助孵化溶液并用500μlD-PBS（与^钙离子和^镁离子）的，在室温下，通过温和轨道振荡洗孔3×10分钟。
8. 扫描使用能够检测700纳米和800纳米的荧光发射的成像系统的板。作为一个起点，将焦点偏移3和敏感性1.5 MBP，5.0肌动蛋白和3.5 Olig2的。根据需要，以避免信号过度调整灵敏度值。
9. 量化oligodendrogenesis使用半自动化的基于软件的方法的程度。
   1. 使用该软件，设置板块分析模式，以"24井"，并调整围绕牛逼的圈子扫描的井，他外缘。将正常化通道"800"和出口总量和相对荧光强度为700纳米（MBP）和800纳米（Olig2的/肌动蛋白）通道。
   2. 由强度在800nm​​处划分在700nm的强度，得到在相对荧光单位的归一化的MBP表达。计算重复测量的平均值，并根据需要进行了分析缩放表达到第0天+ PDGF控制。

结果

A2B5阳性的OPC使用磁性柱分离系统通过积极的小区选择隔离。在此之前的分离步骤，整个大脑从幼鼠是P5和P7之间除去。一旦整个大脑成功从头骨分离，嗅球和小脑使用精细外科镊子（图1A）中除去。为了分离大脑皮质组织下丘脑，丘脑和中脑被小心剥离（图1B）切除。接下来，海马和纹状体使用弯钳手术（ - D图 1C）<...

讨论

这里介绍的协议描述了分离的大鼠的OPCs并响应实验因素体外 oligodendrogenesis定量了快速和可靠的方法。用积极的选择，可行的和纯粹的OPC的高收益直接用于实验目的。此方法简化了隔离，培养和分化的步骤到1周的时间帧，并固定细胞可以方便地储存在4℃下数周而不在测定灵敏度的任何损失。

与基于扫描器荧光测定法的一个主要优点是，数据采集和分析被大大加快与传?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor