Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Resumen

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Resumen

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Introducción

conducción nerviosa eficiente en el sistema nervioso central de los mamíferos (CNS) requiere la mielinización de los axones por oligodendrocitos. Durante el desarrollo, surgen los oligodendrocitos a partir de un conjunto de células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que se cree que la migración de las zonas ventriculares del cerebro anterior en desarrollo y el tubo neural ^1. Después de los OPC de migración se diferencian en oligodendrocitos maduros, myelinating que no sólo facilitar la propagación del impulso eficiente, sino que también proporcionan los axones con soporte trófico ^2. El sistema nervioso central adulto mantiene una abundante población de los OPC que están dispersos en toda la sustancia gris y blanco que comprende aproximadamente el 5-8% de todas las células ^3. Luego de una lesión desmielinizante, los OPC migran al sitio de la lesión, proliferan y se diferencian para sustituir a las vainas de mielina perdidos o dañados en los axones expuestos. Sin embargo, en algunos lugares la enfermedad / lesión, este proceso se encuentra para ser ineficaz o puede fallar por completo ^4. Mientrasdesmielinización crónica se cree que añadir a la carga de morbilidad, la remielinización oligodendrogenesis y eficiente puede aliviar los síntomas ^5. Por ello, ha sido de interés para estudiar los OPC in vitro para determinar el efecto de los factores experimentales sobre oligodendrogenesis.

La comprensión de las diferentes fases de la diferenciación de oligodendrocitos ha sido posible gracias a la identificación de marcadores específicos de células de la etapa. Auto-renovación de células progenitoras tempranas se definen por su expresión de alfa derivado de plaquetas receptor del factor de crecimiento (PDGFR), el antígeno neuronal / glía 2 (NG2) y A2B5 ^{6 - 8.} Como OPCs inician su programa de diferenciación y se retiran del ciclo celular, que regulan negativamente la expresión de estos marcadores y comienzan a expresar proteínas indicativas de premielinizantes oligodendrocitos incluyendo cíclico de nucleótidos 3'-fosfodiesterasa (CNPase) y O4. Por último, su diferenciación en oligodendroc más maduroytes se caracteriza por la expresión de proteínas asociados a la mielina, incluyendo la glicoproteína asociada a la mielina (MAG), proteína proteolipídica (PLP), y la proteína básica de la mielina (MBP). MBP es una proteína de membrana periférica intracelular y un componente principal de la vaina de mielina. Los ratones que carecen MBP desarrollan un fenotipo grave en el que la mielinización del SNC está disminuida significativamente dando lugar a temblores, convulsiones y muerte temprana ^9,10. Este importante papel de la MBP en la mielinización ha llevado a su uso como un marcador de la diferenciación de oligodendrocitos in vitro e in vivo ^11.

La cuantificación de MBP se puede lograr usando varias metodologías diferentes. RT-PCR y análisis de transferencia Western permiten la cuantificación de los niveles de MBP bajo diferentes regímenes de tratamiento. La inmunocitoquímica es un enfoque cualitativo común que también puede ser cuantitativa cuando se usan enfoques de microscopía basados ​​en cámaras. Aunque estos sistemas son fiables y fundamental parael estudio de la diferenciación de oligodendrocitos, cada uno de ellos tiene sus propias desventajas que limitan su uso en la detección de drogas. En primer lugar, la cantidad de OPCs principales que se necesitan para RT-PCR y análisis de transferencia Western reduce el número de variables que se pueden examinar simultáneamente. Mientras que el requisito para inmunocitoquímica de células es mucho más bajo, un tiempo considerable se debe dedicar a cada experimento si la cuantificación es la meta. Numerosas imágenes deben ser capturados y luego cuantificados para facilitar el análisis experimental. Estas advertencias se convierten en obstáculos importantes a tener en cuenta para los estudios que requieren una evaluación de alto rendimiento. Aquí se describe un método que utiliza aspectos fundamentales tanto de la inmunocitoquímica y metodologías de Western blot para la cuantificación de la mielina, mientras que reduce significativamente tanto el número de células requeridas y el tiempo para completar el análisis cuantitativo.

Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) y Johns Hopkins School of Medicine.

1. Preparación de placas de ensayo, solución madre, y OPC base para medios

Nota: La base de rata (OPC) Sato medios descritos aquí viene de los estudios previamente publicados ^12,13. formulaciones de medios alternativos también pueden ser compatibles con este procedimiento.

1. Resuspender poli-L-lisina (PLL) a una concentración de 10 mg / ml en agua desionizada estéril. Pipetear 400 l de la PLL diluido en cada pocillo de un 24 pocillos de fondo en el tejido plato negro de paredes, claro gradiente de cultivo.
2. placas de cultivo de tejidos de la capa durante 2 horas en una incubadora de 37 ° C o cultivo de tejidos durante la noche en un refrigerador de 4 ° C.
3. Aspirar PLL de platos recubiertos al menos 20 min antes de chapado. Permitir que el PLL restante se seque del pozo mediante la colocación de placas de 24 pocillos con la tapa parcialmente abierta en un cultivo de tejidocapucha. Compruebe que los pozos estén completamente secas antes de chapado OPC aisladas. Las células no se adhieren al plástico que tiene líquido PLL presente.
4. Preparar N-acetil-L-cisteína (NAC) solución madre (1,000x): Disolver 100 mg de N-acetil-L-cisteína (NAC) en 20 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Alícuota y almacenar a -20 ° C.
5. Preparar la solución madre de hidrocortisona (1,000x): Añadir 1 ml de etanol a 1 mg de hidrocortisona y agitar para disolver. Añadir 19 ml de DMEM, mezclar la solución, alícuota y se almacena a -20 ° C. La adición de hidrocortisona a los medios de base se ha mostrado para mejorar la supervivencia de las células gliales ^14.
6. Preparar d-biotina solución madre (5.000x): Disolver 2,5 mg de d-biotina en 50 ml de PBS. Añadir 1-2 x 5 gotas mu l de NaOH 0,1 N para ayudar a la disolución. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
7. Preparar la solución madre de insulina (100x): Disolver 25 mg de insulina en 50 ml de agua de calidad para el cultivo de tejidos. Añadir 250 l Of 1 N de HCl y se mezcla hasta que la solución es clara. Esterilizar con un filtro de 0,22 micras y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 semanas.
8. Preparar Sato solución madre (100x):
   1. Preparar la solución de progesterona de valores (25 g / l): Se disuelven 2,5 mg de progesterona en 100 l de etanol.
   2. Preparar una solución de sodio selenito de valores (400 ng / l): Disolver selenita de sodio 4 mg en 100 l de NaOH 0,1 N. Añadir 10 ml de DMEM y mezclar.
   3. A 100 ml de DMEM, añadir 1 g de humano de la apo-transferrina, 1 g de albúmina de suero bovino, y 160 mg de putrescina y mezclar para disolver completamente. Añadir 25 l de solución de stock de progesterona, 1.000 l de solución de selenita de sodio de valores, y mezclar. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
9. Preparar OPC Medios Base: por 100 ml de DMEM (con 4,5 g / L de D-glucosa, L-glutamina, y 110 mg / L piruvato de sodio), añadir 100 l NAC, 100 hidrocortisona l, 20 l d-biotina, 1 ml insulina, 1 ml Sato acción, 100 l oligoelementos B,2 ml B-27 suplemento (50x), y 1 ml de penicilina / estreptomicina (100x). Esterilizar con un filtro de 0,22 micras y almacenar a 4 ° C.
10. Preparar PDGF-AA solución madre (1,000x): Disolver 250 g en 12,5 ml de PBS con 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) para hacer una solución 20 mg / ml. Alícuota y almacenar a -80 ° C.
11. Preparar medios proliferación OPC: OPC medios de base suplementado con 20 ng / ml de PDGF-AA.
12. Preparar medio de diferenciación OPC: OPC medios de base suplementado con 45 nM de triyodotironina.
13. Preparar la columna Buffer: Para 500 ml de PBS, añadir 2,5 g de BSA y 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético 0,5 M (EDTA) y ajustar el pH a 7,2. Esterilizar con un filtro de 0,22 micras y almacenar a 4 ° C.

2. cerebro de rata La disección

Nota: Las crías de rata P5-P7 se usan en este protocolo. Cada corteza cría de rata rinde aproximadamente 1,5-2,0 x 10 ⁶ células positivas A2B5.

1. Esterilizar todo el equipo de disección usando un 2506; C grano climatizada esterilizador.
2. Añadir 15-20 ml de PBS (sin Ca ^{2 + y Mg2} +) para tubos de 50 ml cónicos. Un 50 ml tubo cónico es suficiente para 3-4 cortezas de las crías de rata. Introducir 50 ml tubos cónicos en hielo. Utilice tubos de 50 ml cónicos para sostener tejido de la corteza en dados durante la disección.
3. Añadir PBS frío a una placa de Petri de 10 cm. Este plato se utilizará para la disección en el microscopio de luz.
4. Sacrificar las crías de ratas por decapitación con grandes tijeras quirúrgicas. Cabeza de pulverización con etanol al 70%.
5. Se extrae el cerebro entero
   1. Utilizando pequeñas tijeras cortan la piel hacia abajo de la línea media y detrás de las orejas y los colgajos de piel de cáscara de espalda. Cortar el cráneo por la línea media a partir del tronco cerebral y terminando en los ojos. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundamente con el fin de preservar la estructura de la corteza subyacente.
   2. Hacer dos cortes laterales inferiores al cerebelo mediante la inserción de pequeñas tijeras quirúrgicas en el foramen magnum. Haga un corte adicional entre los ojos, la hormigaerior a los bulbos olfatorios.
   3. Retire con cuidado cada mitad del cráneo hacia atrás. Retire todo el cerebro y en el lugar 10 cm placa de Petri llena de PBS frío.
6. Bajo el microscopio de luz disección, quitar los bulbos olfatorios y el cerebelo con pinzas quirúrgicas finas.
7. Da la vuelta al cerebro de manera que la superficie ventral es visible bajo el microscopio óptico.
8. Utilizando unas pinzas rectas finas realizan una disección roma mediante la colocación de puntas de las pinzas cerradas entre la corteza y el hipotálamo a una profundidad de 2/3 del cerebro. Una vez que los fórceps están en su lugar permitir que los extremos se abran. Repita para el otro hemisferio.
9. Se burlan de la corteza del hipotálamo y regiones del cerebro medio.
10. Retire el hipotálamo, tálamo, mesencéfalo y sosteniendo el cerebro medio en su superficie posterior y pelado hacia el extremo anterior del cerebro. Cortar las conexiones anteriores.
11. Retire el hipocampo por despegando hacia afuera y luego cortar su conexión con elcórtex utilizando pinzas de disección finas dobladas.
12. Retire el cuerpo estriado restante por el desguace de la corteza subyacente en un movimiento hacia afuera en diagonal con unas pinzas de disección finas dobladas.
13. Borre los vasos sanguíneos y las meninges de la superficie ventral de la corteza.
14. Da la vuelta al cerebro de manera que la superficie dorsal es visible. Meninges y los vasos sanguíneos deben ser evidentes. Pelar las meninges de la corteza subyacente utilizando pinza de disección finas. Iniciar la peladura de la posición de unión bulbo olfatorio.
15. Complete los pasos 2.4 a 2.14 para un total de 3-4 crías de rata.
16. Coloque 3-4 disecados cortezas cría de rata en una placa Petri seco y cortar con una cuchilla de afeitar esterilizada hasta que se alcancen 1 mm x 1 mm trozos. Recoger el tejido de un enjuague con PBS plato de un tubo cónico de 50 ml (paso 2) a continuación, colocar de nuevo en hielo.

3. enzimática y disociación mecánica Tissue

Nota: Para este paso, se recomienda un kit de disociación neuronal basada en la papaína. con NeKit de disociación ural (P), se describen los pasos especiales que son óptimas para el aislamiento OPC.

1. Preparar la primera enzima de disociación mediante la dilución de la enzima P con el tampón apropiado. El contenido de cada cónica 50 ml (1 muestra) se resuspendieron con un total de 1.950 l de mezcla de enzimas. Lugar en la mezcla de enzimas en un baño María a 37 ° C durante 10 minutos.
   1 muestra: 1.900 l de tampón + 50 l de la enzima papaína
2. Girar todos los tubos de 50 ml cónicos que contengan cortezas 3-4 crías de rata en cubitos a 300 xg durante 3 min.
3. Aspirar el sobrenadante y añadir 1.950 l de solución de enzima a cada tubo de muestra y separar el sedimento invirtiendo el tubo y agitando suavemente.
4. Incubar en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos de 15 min con rotación del tubo continuo.
5. Durante los últimos 5 minutos de la incubación, preparar la segunda mezcla de enzimas A. Diluir la enzima en su tampón apropiado. Se añadirá un total de 30 la cada tubo de muestra cónico de 50 ml.
   1 Muestra: 20 l de tampón + 10 l de enzima
6. Una vez se completa la incubación añadir 30 l de la segunda mezcla de enzima a cada tubo y se invierte para mezclar.
7. Usando una pipeta Pasteur de vidrio unido a un controlador de pipeta, disociar mecánicamente el tejido pipeteando 10-15 veces o hasta que las piezas de tejido se reducen de tamaño y la solución se ha convertido en nublado. De nuevo la muestra a la 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 15 minutos con rotación continua.
8. Pipetear cada muestra de tejido homogeneizado 10-15 veces usando una pipeta de 1 ml.
9. Pipetear cada muestra de tejido homogeneizado 15-20 veces usando una pipeta de 200 l
10. Volver todas las muestras a la 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 10 minutos con rotación continua.
11. Añadir 10 ml de PBS (con Ca y Mg ^{2+ 2 +)} a cada muestra y filtrar el homogeneizado a través de un filtro de 40 micras de poro se coloca sobre un 50 ml tubo. Enjuague el filtro con un adicional de 1-2 ml de PBS.
12. Piscina todo de las muestras de homogeneizado en un tubo cónico de 50 ml y adquirir un recuento de células en general.
13. Después de realizar el recuento de células, dividir el homogeneizado uniformemente en tubos de 15 ml cónicos (1 tubo para cada muestra). Centrifugar durante 10-12 min a 300 x g.

4. Anti-A2B5 Aplicación del grano, la purificación en columna, y Chapado

1. Realizar cálculos de tampón de columna y microperlas anti-A2B5. Añadir 7 l Tampón de Columna células por cada 1 x 10 ^6. Añadir 2 l microperlas anti-A2B5 células por cada 1 x 10 ^6.
2. Combinar todas las muestras resuspendiendo las células en un volumen total de 10 ml de tampón de columna y centrifugar a 300 xg durante 10 a 12 min.
3. Resuspender el sedimento celular en la cantidad apropiada de tampón de columna tal como se calcula en el paso 4.1. Si la pastilla es grande y suelto, solamente añadir aproximadamente la mitad del volumen de tampón de columna para mantener la lucha contracuerpo a la concentración apropiada en la resuspensión celular.
4. Incubar la suspensión de células durante 10 min a 4 ° C.
5. Añadir microperlas anti-A2B5 (calculado en el paso 4.1), invertir varias veces y se incuba a 4 ° C durante 30-60 min. Invertir suavemente el tubo varias veces cada 10 min. tiempos de incubación más largos pueden aumentar los rendimientos celulares pero pueden aumentar la unión no específica.
6. Añadir 5 volúmenes de tampón de columna. Si las células se resuspenden en un volumen de 1 ml, añadir 5 ml de tampón de columna, mientras que si las células se resuspendieron en 2 ml, añadir 10 ml de tampón de columna.
7. Centrifugar durante 10 min a 300 x g.
8. Determinar el número de columnas LS será necesario para la purificación. Una columna LS es suficiente para 15-20 x 10 ⁶ células totales.
9. Resuspender el sedimento celular en 1.000 l de tampón de columna por columna LS que se utiliza.
10. Primer cada columna LS mediante la adición de 5 ml de tampón de columna. Recoger el flujo a través de un tubo cónico de 50 ml. Una vez que los bu columnaffer ha pasado completamente a través de la cámara superior, aplicar 1.000 l de la suspensión celular a cada columna y permitir que las células se ejecutan a través de por la gravedad.
    Nota: Si la densidad de células es demasiado alta, la columna puede funcionar lento.
11. Inmediatamente después de la suspensión de células se ha pasado a través de la columna, añadir lentamente 3 ml de tampón de columna para cada columna para lavar las células no unidas. Si el lavado se ejecuta con facilidad a través de la columna (1 gota por cada 30-45 segundos), se lava dos veces más con 3 ml de tampón de columna.
12. Retire cada columna y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 5 ml de tampón de columna y hundir el tampón a través de la columna a una velocidad rápida mediante el émbolo de plástico que se empaqueta con la columna. Hundimiento será desalojar las células unidas liberándolos de la columna.
13. Aumentar la pureza mediante la ejecución de la muestra a través de una segunda ronda de LS columnas. Utilice un tercio del número de columnas que se utilizan durante la primera pasada. Primer las columnas con 5 ml de tampón de columna.Dejar que el tampón de la columna pase a través de la cámara superior.
14. Dado que el volumen de suspensión celular será mucho mayor, aplicar uniformemente 1.000 l de suspensión celular a cada columna y permitir que la suspensión pase a través de la cámara superior de la columna antes de la reposición con un 1.000 l adicionales.
15. Una vez que la suspensión celular ha sido completamente aplicado a la segunda ronda de columnas, se lava 2-3 veces con 3 ml de tampón de columna.
16. Retire cada columna y se coloca sobre un tubo cónico estéril de 15 ml. Añadir 5 ml de tampón de columna y hundir el tampón utilizando el émbolo de plástico que se empaqueta con la columna. Hundimiento será desalojar las células unidas liberándolos de la columna.
17. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 12 a 15 min. El sedimento debería aparecer compacto.
18. Resuspender el sedimento celular en 5 a 10 ml de medio de proliferación OPC pre-calentado (medios de comunicación de base OPC suplementado con PDGF-AA 20 ng / ml).
19. Contar las células utilizando un hemocitómetro.
20. Placa de las células. Diluir las células a 60.000 células / ml con medios proliferación OPC. En cada negro, fondo claro de 24 pocillos, de pipeta 500 l de células a lo largo del lado del pozo para obtener 30.000 células por pocillo. Mezclar las células agitando la placa horizontalmente usando una figura de ocho movimientos. Si la realización del ensayo en 48, 96, o 384 pocillos, añadir 15.000, 7.500, o 1.500 células por pocillo, respectivamente. Estos números se pueden ajustar dependiendo de las especificaciones de la placa individuales.
21. Preparar una placa separada para el día 0 cultivos de control de línea de base. Esta placa de control debe ser fijado con paraformaldehído al 4% como se describe en la sección 5.7, cuando la diferenciación se inicia el día 0.
22. Cultivar las células en medios de proliferación OPC a 37 ° C durante 3 días sin cambio de medio.

5. La inducción de la diferenciación OPC y fijación con 4% de paraformaldehído

Nota: Cuando se prueba el efecto de las moléculas pequeñas en oligodendrogenesis, de manera rutinaria dissolve fármacos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para preparar stocks 1,000x que luego pueden ser almacenadas a -80 ° C y se diluye directamente en los medios de comunicación SATO para obtener una concentración final de 0,1% DMSO. Hemos observado ningún cambio en cualquiera de proliferación o diferenciación OPC usando esta concentración de DMSO (datos no mostrados).

1. Pre-calentar el medio de base de OPC a 37 ° C y descongelar las existencias de tratamiento de drogas a temperatura ambiente. Cuando la realización de tratamientos por duplicado, preparar aproximadamente 1,25 ml de medio por grupo de tratamiento en un tubo de 1,5 ml. Para muestras por triplicado, utilizar 2 tubos de centrífuga ml de capacidad para dar cuenta de holgura.
2. Preparar las mezclas de reacción de tratamiento para los pocillos replicados mediante la dilución de las existencias de tratamiento directamente en los medios de comunicación de base OPC. vórtice brevemente o mezclar suavemente cada mezcla maestra para asegurar la distribución homogénea del tratamiento.
3. Preparar 45 nM de triyodotironina (T ₃₎ como el control positivo y el vehículo apropiado como control negativo. Diluir T 10 mM _{3 stock}1: 1000 en 1 ml de medio de base de OPC y luego se diluye adicionalmente en la mezcla maestra tratamiento para reducir la concentración final de DMSO si fuera necesario.
4. Aspirar los medios de comunicación del grupo de un tratamiento pocillos de cultivo a la vez a fin de evitar el secado de las células. Utilice una punta de pipeta de 200 l en el extremo de la pipeta Pasteur de vidrio para evitar el raspado de material de negro de las paredes del pozo y en la cultura.
5. Añadir lentamente 500 l de mezcla maestra de tratamiento a lo largo del lado del pozo utilizando una pipeta de 1 ml.
6. Se incuban los cultivos durante el período de tiempo deseado, realizando un intercambio de medios completa con medios de tratamiento frescos cada 2-3 días. Nosotros habitualmente observamos un 30-40% MBP ⁺ después de 4 días de cultivo en medio de diferenciación.
7. Al final del período de tratamiento deseado, preparar fresco 4% de paraformaldehído (PFA) o descongelar una madre congelada a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: PFA es extremadamente tóxico y debe ser preparado en una campana de humos.
8. Aspirar los medios de comunicación y se añade lentamente 4001; l de PFA al lado del pozo para fijar las células. Incubar la placa durante 20 min a temperatura ambiente.
9. Aspirar el PFA y se añade lentamente a 500 l de D-PBS estéril (con ^Ca2 + y ^Mg2 +) al lado del pozo para lavar las células. Repetir el lavado de un total de dos veces más. No aspirar el lavado final.
10. Envolver la placa en parafilm y se almacena a 4 ° C para su posterior procesamiento o pasar directamente a la siguiente etapa. Las placas pueden almacenarse durante varias semanas.

6. La inmunocitoquímica y cuantificación de proteína básica de mielina

Nota: Al realizar los procedimientos de manipulación de líquidos en las placas de 24 pocillos, se recomienda trabajar con rapidez para evitar el secado de las células. En este caso, se recomienda el uso de un aspirador de vacío multicanal y una pipeta multicanal.

1. Llevar la placa a temperatura ambiente, aspirar los pocillos y añadir 250 l de D-PBS (con Ca y Mg ^{2+ 2+)} que contienen 0,1% de Triton X-100 y 5%suero de cabra normal (NGS). Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación orbital suave.
2. Preparar la solución de incubación primaria mediante la dilución de anticuerpo monoclonal de ratón anti-MBP anticuerpo 1: 1000 y el anticuerpo policlonal de conejo anti-actina 1: 200 en D-PBS (con Ca y Mg ^{2+ 2+)} que contiene 5% NGS. Alternativamente, policlonal de conejo anti-Olig2 a 1: 1000 se puede utilizar para los oligodendrocitos normalización específico en cultivos gliales mixtos. Preparar suficiente solución primaria para dar cabida a 250 l por pocillo.
3. Incubar anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche para 16-18 horas con agitación orbital suave.
4. Aspirar la solución de incubación primaria y se lavan las células 3 x 10 min con 500 l de D-PBS (con Ca y Mg ^{2+ 2+)} a temperatura ambiente con agitación orbital suave.
5. Mientras se lava la placa, preparar la solución de incubación secundaria diluyendo anti-ratón 680 y anti-anticuerpos de conejo 800 1: 500 en D-PBS (con Ca ²⁺ y Mg ²⁺⁾ que contiene 5% de NGS. Minimizar la exposición de luz ambiental en la preparación de esta solución.
6. Aspirar el lavado final y añadir 250 l de solución de incubación secundaria. Proteger a la placa de la luz y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación orbital suave.
7. Aspirar la solución de incubación secundaria y lavar los pocillos 3 x 10 min con 500 l de D-PBS (con Ca y Mg ^{2+ 2+)} a temperatura ambiente con agitación orbital suave.
8. Analiza la placa utilizando un sistema de imagen capaz de detectar 700 nm y 800 nm emisiones de fluorescencia. Como punto de partida, establecer el desplazamiento a 3 y sensibilidades a 1,5 para MBP, 5.0 para la actina, y 3.5 para Olig2 focal. Ajustar los valores de sensibilidad, según sea necesario para evitar la sobreexposición de la señal.
9. Cuantificar el grado de oligodendrogenesis usando métodos basados ​​en software semi-automatizados.
   1. Usando el software, configurar el modo de análisis de la placa de "24 Bueno" y alinear círculos alrededor de tél perímetro exterior de los pozos escaneados. Ajuste el canal de normalización a "800" y exportar las intensidades totales y relativas de fluorescencia de los 700 nm (MBP) y 800 nm (Olig2 / actina) canales.
   2. Dividir la intensidad a 700 nm por la intensidad a 800 nm para dar la expresión de MBP normalizada en unidades relativas de fluorescencia. Calcular el promedio de las mediciones de replicar y aumentar la expresión del Día 0 + PDGF controles según sea necesario para el análisis.

Resultados

OPC A2B5-positivas se aislaron mediante selección celular positiva utilizando un sistema de separación magnética de columna. Antes del procedimiento de aislamiento, todo el cerebro se elimina de crías de rata que se encuentran entre P5 y P7. Una vez que todo el cerebro se separa con éxito desde el cráneo, los bulbos olfatorios y el cerebelo se eliminan mediante unas pinzas quirúrgicas finas (Figura 1A). Con el fin de aislar el tejido cortical cerebral el hipotála...

Discusión

El protocolo que se presenta aquí describe un método rápido y fiable para el aislamiento de los OPC de rata y cuantificar en oligodendrogenesis vitro en respuesta a factores experimentales. Usando la selección positiva, altos rendimientos de los OPC viables y puros se utilizan directamente para fines experimentales. Este método simplifica el aislamiento, cultivo y etapas de diferenciación en un marco de tiempo 1 semana, y las células fijadas se puede almacenar convenientemente a 4 ° C durante v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor