הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Summary

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Abstract

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Introduction

הולכה עצבית יעילה במערכת העצבים המרכזית היונקת (CNS) דורשת מעטפת המיאלין של אקסונים על ידי oligodendrocytes. במהלך פיתוח, oligodendrocytes להתעורר מתוך מאגר של ובתאים oligodendrocyte (OPCs) כי הם חשבו להגר מאזורי חדרית של המוח קדמי בפיתוח עצבי צינור ^1. לאחר OPCs הגירה להתמיין oligodendrocytes בוגרת, myelinating כי לא רק להקל התפשטות הדחף יעיל, אלא גם לספק אקסונים עם תמיכה trophic ^2. המבוגר CNS שומרת אוכלוסיה שופעת של OPCs כי הם מפוזרים בכל רחבי החומר האפור-לבן המהוות כ 5-8% מכלל התאים ^3. בעקבות עלבון demyelinating, OPCs להגר באתר של פציעה, להתרבות, ולבדל להחליף נדני המיאלין אבודים או פגומים על אקסונים חשופים. עם זאת, בכמה הגדרות מחלה / פציעה, תהליך זה נמצא להיות יעיל או יכול להיכשל ⁴ לחלוטין. בשעה שdemyelination כרוני הוא חשב להוסיף את נטל המחלה, oligodendrogenesis ויצירת מיאלין יעיל עשוי להקל תסמינים ^5. בהתאם לכך, כבר היה עניין ללמוד OPCs במבחנה כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים הניסיונות על oligodendrogenesis.

תובנה השלבים השונים של בידול oligodendrocyte כבר מתאפשר על ידי זיהוי של סמני תאים ספציפיים הבמה. עצמית חידוש ובתאים מוקדם מוגדרים על ידי הביטוי שלהם של אלפא הקולטן לגורם הצמיחה נגזר טסיות (PDGFRα), עצביים / גליה אנטיגן 2 (NG2) ו A2B5 ^{6 - 8.} כפי OPCs ליזום תכנית הבידול שלהם לסגת מחזור התא, הם downregulate ביטוי של סמנים אלה ולהתחיל לבטא חלבונים מעידים premyelinating oligodendrocytes כולל המחזורי-נוקלאוטיד 3'-phosphodiesterase (CNPase) ו O4. לבסוף, הבידול שלהם לתוך oligodendroc בוגרת יותרytes מתאפיין ביטוי של חלבונים הקשורים המיאלין, כולל גליקופרוטאין הקשורים המיאלין (הפצ"ר), חלבון proteolipid (PLP), ואת חלבון המיאלין הבסיסי (MBP). MBP הוא חלבון קרום היקפי תאיים מרכיב עיקרי של מעטפת המיאלין. עכברים שחסר MBP לפתח פנוטיפ חמור שבו myelination CNS הוא ירד מוביל משמעותי רעידות, עוויתות ^9,10 מוות מוקדם. תפקיד חשוב זה של MBP ב myelination הוביל שימוש בו כסמן של בידול oligodendrocyte היא במבחנת in vivo ^11.

כימות של MBP יכולה להיות מושגת באמצעות מתודולוגיות שונות. RT-PCR וניתוח כתם המערבי לאפשר כימות של רמות MBP תחת משטרי טיפול שונים. Immunocytochemistry היא שיטה איכותית נפוצה שיכולה גם להיות כמותית כאשר גישות מיקרוסקופיה מבוסס מצלמה משמשות. למרות שמערכות אלה מהימנות יסודיש המחקר של בידול oligodendrocyte, הם כל החסרונות שלהם כי להגביל את השימוש שלהם ב ההקרנה סמים. ראשית, כמות OPCs העיקרית הדרושים RT-PCR וניתוח כתם המערבי מפחית את מספר משתנים שיכולים להיבחן בו זמנית. בעוד דרישת תא immunocytochemistry היא הרבה יותר נמוכה, זמן ניכר חייב להיות מוקדש כל ניסוי אם כימות היא מטרה. תמונות רבות חייבות להיות בשבי ואז לכמת כדי להקל על הניתוח הניסיון. אזהרות אלה הופכים מכשולים חשובים לשקול ללימודים הדורשים הערכת קצב העברת נתונים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה אשר מנצל היבטים בסיסיים משני immunocytochemistry ומתודולוגיות כתם המערבי כימות המיאלין, תוך הפחתה משמעותית של שניהם את מספר התאים הדרושים זמן להשלמת ניתוח כמותי.

Protocol

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) ואוניברסיטת ג'ונס הופקינס הספר לרפואה.

1. הכנת צלחות assay, פתרונות המניות, ו OPC Media Base

הערה: בסיס העכברוש OPC (סאטו) תקשורת המתוארת כאן כבר נגזרה מחקרים שפורסם בעבר ^12,13. ניסוחי מדיה אלטרנטיביים יכולים להיות גם תואמים עם הליך זה.

1. Resuspend-פולי- L- ליזין (PLL) לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים סטריליים deionized. פיפטה 400 μl של PLL בדילול לבאר כל צלחת תרבות כיתה שחורה קירות, ברורה תחתונה 24 גם רקמות.
2. תרבות מנות מעיל רקמה 2 שעות בתוך חממה תרבות 37 ° C רקמה או לילה במקרר 4 ° C..
3. לשאוב PLL מן המנות צופה לפחות 20 דקות לפני ציפוי. אפשר הנותרים PLL להתייבש מהבאר ידי הצבת 24 צלחות גם עם מכסה פתוחה חלקית תרבית רקמהמכסה מנוע. ודאו הבארות יבשות לחלוטין לפני ציפוי OPCs המבודד. תאים לא לדבוק פלסטיק, שיש לו בהווה PLL נוזלי.
4. הכן N -Acetyl-L-ציסטאין (NAC) פתרון המניות (1,000x): ממיסים 100 מ"ג N -Acetyl-L-ציסטאין (NAC) ב 20 מ"ל של מדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
5. הכן פתרון המניות הידרוקורטיזון (1,000x): הוסף 1 מ"ל של אתנול ל 1 מ"ג הידרוקורטיזון מערבולת לפזר. להוסיף 19 מ"ל של DMEM, לערבב את הפתרון, aliquot ולאחסן ב -20 ° C. התוספת של הידרוקורטיזון לתקשורת הבסיס הוכחה כדי לשפר את ההישרדות של תאי גליה ^14.
6. הכן פתרון מניות ד-ביוטין (5,000x): ממיסים 2.5 מ"ג ביוטין ד ב 50 מ"ל של PBS. להוסיף 1-2 x 5 טיפות μl של 0.1 N NaOH כדי לסייע בפירוק. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
7. כן פתרון מניות אינסולין (100x): ממסי 25 מ"ג אינסולין ב 50 מ"ל מי כיתה בתרבית רקמה. הוסף 250 μl of 1 N HCl ומערבבים עד פתרון ברור. לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שבועות.
8. כן פתרון מניות סאטו (100x):
   1. כן פתרון מניות פרוגסטרון (25 מיקרוגרם / μl): ממסי פרוגסטרון 2.5 מ"ג ב 100 μl של אתנול.
   2. כן פתרון מניות סלניט נתרן (400 ng / μl): ממסי סלניט נתרן 4 מ"ג ב 100 μl של 0.1 N NaOH. הוסף 10 מ"ל של DMEM ומערבבים.
   3. ל -100 מ"ל של DMEM, להוסיף 1 גרם של האדם apo-transferrin, 1 גרם של אלבומין בסרום שור, ו -160 מ"ג של פוטרסין ומערבבים לפזר באופן מלא. הוסף 25 μl של פתרון המניות פרוגסטרון, 1,000 μl של פתרון המניות סלניט נתרן, ומערבבים. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
9. הכן בסיס מדיה OPC: לכל 100 מ"ל של DMEM (עם 4.5 גר '/ ל D- גלוקוז, L- גלוטמין, ו -110 מ"ג / L פירובט נתרן), להוסיף 100 NAC μl, 100 הידרוקורטיזון μl, 20 μl ד-ביוטין, 1 מ"ל אינסולין, 1 מיליליטר מניות סאטו, 100 μl יסודות קורט B,2 מ"ל B-27 תוספת (50x), ו 1 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (100x). לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
10. הכן פתרון המניות PDGF-AA (1,000x): ממיסים 250 מיקרוגרם ב 12.5 מ"ל של PBS עם אלבומין 0.1% שור (BSA) לבצע פתרון 20 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot ולאחסן ב -80 ° C.
11. כן תקשורת התפשטות OPC: בסיס מדיה OPC בתוספת 20 ng / ml PDGF-AA.
12. כן תקשורת בידול OPC: בסיס מדיה OPC בתוספת 45 triiodothyronine ננומטר.
13. הכן טור הצפת: 500 מ"ל של PBS, להוסיף 2.5 גרם של BSA ו -2 מ"ל של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולהתאים את ה- pH ל -7.2. לעקר עם 0.22 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

2. מוח החולדה Dissection

הערה: גורי חולדה P5-P7 משמשים בפרוטוקול זה. כל קליפת גור עכברוש בתשואה של כ 1.5-2.0 x 10 ⁶ תאים חיוביים A2B5.

1. לעקר את כל הציוד לנתיחה באמצעות 2506; C מעקר חרוז מחומם.
2. להוסיף 15-20 מ"ל של PBS (ללא Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ 50 מ"ל צינורות חרוטי. שפופרת 50 מיליליטר חרוטים אחת מספיקה עבור הקורטקס עכברוש גור 3-4. מניח 50 מ"ל צינורות חרוטים על קרח. השתמש 50 מ"ל צינורות חרוטי להחזיק רקמות קליפה לקוביות במהלך לנתיחה.
3. הוסף קר PBS על צלחת 10 ס"מ פטרי. המנה זו תשמש לנתיחה תחת מיקרוסקופ האור.
4. להקריב גורי חולדה על ידי עריפת הראש עם מספרי כירורגיות גדולות. תרסיס ראש עם 70% אתנול.
5. חלץ את המוח כולו
   1. מספריים קטנים באמצעות לחתוך את העור לאורך קו האמצע ומאחורי האוזניים ואת שולי העור לקלף בחזרה. חותכים את הגולגולת לאורך קו ההפרדה החל גזע המוח ומסתיים העיניים. היזהר שלא לחתוך עמוק מדי כדי לשמר את המבנה של קליפה הבסיסית.
   2. לעשות שני חתכים לרוחב נחים המוחון ידי החדרת מספרי כירורגיות קטנות לתוך מגנום foramen. תן קיצוץ נוסף בין העיניים, נמלהerior כדי נורה חוש הריח.
   3. בזהירות לקלף כל מחצית של גולגולת אחורית. הסר את המוח ואת המקום כולו ב -10 ס"מ צלחת פטרי מלא PBS קר.
6. תחת מיקרוסקופ האור לנתיחה, להסיר את נורות המוח קטן חוש ריח עם מלקחי כירורגיות בסדר.
7. תהפכו את המוח כך את פני השטח הגחון גלוי תחת מיקרוסקופ אור.
8. בעזרת מלקחיים ישר בסדר לבצע דיסקציה קהה ידי הצבת טיפי מלקחיים סגורים שבין הקליפה וההיפותלמוס עד לעומק כ 2/3 של המוח. לאחר מלקחיים נמצאים במקום לאפשר את הקצוות כדי לפתוח. חזור על הפעולה עבור חצי הכדור השני.
9. להקניט את קליפת מההיפותלמוס ואזורי מוח תיכונים.
10. הסר את ההיפותלמוס, התלמוס, ו המוח התיכון ידי החזקת המוח התיכון על פני השטח האחורי שלה לקלף אותה לקראת סוף הקדמי של המוח. לנתק את הקשרים הקדמיים.
11. הסר את ההיפוקמפוס ידי פילינג זה כלפי חוץ ולאחר מכן ניתוק הקשר בינו לביןקליפה באמצעות מלקחיים דיסקציה מכופף.
12. סור בסטריאטום הנותרים ידי מבטל אותו מהקורטקס הבסיסי בתנועות אלכסוניות החוצה באמצעות מלקחיים דיסקציה מכופף.
13. נקה כל כלי דם ואת קרומי המוח מפני שטח הגחון של הקורטקס.
14. תהפוך את המוח כך את פני השטח הגבה גלוי. קרום המוח וכלי הדם צריך להיות ברור. קרומי המוח פיל מהקורטקס הבסיסית באמצעות מלקחיים דיסקציה בסדר. התחל קילוף מהמיקום מצורף פקעת ההרחה.
15. להשלמת שלבים 2.4-2.14 עבור סכום כולל של 3-4 גורי חולדה.
16. מניח 3-4 הקורטקס גור עכברוש גזור לתוך צלחת פטרי יבש וקוצץ עם סכין גילוח מעוקר עד 1 מ"מ x 1 מ"מ נתחי מושגות. אסוף רקמה על ידי שטיפת צלחת עם PBS מאחד 50 מיליליטר חרוטי צינור (שלב 2) ולאחר מכן למקם בחזרה על קרח.

3. אנזימתי ודיסוציאציה רקמות מכני

הערה: בשלב זה, ערכת דיסוציאציה עצבי מבוסס פפאין מומלצת. שימוש Neקיט דיסוציאציה אוראל (P), צעדים מיוחדים שהם אופטימליים בידוד OPC מתואר.

1. מכינים את אנזים דיסוציאציה הראשון על ידי דילול אנזים P עם המאגר המתאים. התכנים של כל חרוטי 50 מ"ל (1 מדגם) יהיה resuspended עם סך של 1,950 μl של תמהיל האנזים. מקום בתמהיל האנזים באמבט 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   לדוגמא 1: 1,900 μl של הצפת + 50 μl של אנזים פפאין
2. ספין כל 50 מ"ל צינורות חרוטים המכילים 3-4 הקורטקס גור עכברוש קצוץ ב XG 300 במשך 3 דקות.
3. לשאוב supernatant ולהוסיף 1,950 μl של פתרון אנזים על צינור אחד מדגם להתפרק את הכדור על ידי צינור היפוך ורועד בעדינות.
4. מדגירים את תרבות חממה 37 ° C רקמות במשך 15 דקות עם סיבוב צינור רציף.
5. במהלך 5 הדקות האחרונות של הדגירה, להכין את א תמהיל האנזים השני לדלל את האנזים במאגר הראוי לו. סך של 30 μl יתווסףעל צינור אחד מדגם 50 מיליליטר חרוטים.
   לדוגמא 1: 20 μl של הצפת + 10 μl של אנזים
6. לאחר הדגירה תושלם להוסיף 30 μl של תמהיל האנזים השני לצינור כל להפוך לערבב.
7. בעזרת פיפטה זכוכית פסטר מחוברת בקר פיפטה, לנתק את הרקמה באופן מכני על ידי pipetting 10-15 פעמים או עד פיסות הרקמה הם בגודל מופחת והפתרון הפך מעונן. החזר את המדגם אל האינקובטור תרבות C רקמה 37 מעלות במשך 15 דקות עם סיבוב רציף.
8. פיפטה מדגם homogenate רקמות 10-15 פעמים בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
9. פיפטה מדגם homogenate רקמות 15-20 פעמים בעזרת פיפטה μl 200
10. להחזיר את כל דגימות אל האינקובטור תרבות 37 ° C רקמה למשך 10 דקות עם סיבוב רציף.
11. הוסף 10 מ"ל של PBS (עם Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ מדגם ולסנן את homogenate דרך פילטר 40 מיקרומטר הנקבוביות ממוקם מעל 50 מ 'צינור l. יש לשטוף את המסנן עם 1-2 מ"ל נוספים של PBS.
12. פינה כל דגימות homogenate לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוטים לרכוש ספירה תאים הכוללת.
13. לאחר ביצוע ספירת תאים, לפצל את homogenate שווה לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל (1 צינור לכל מנוע מדגם). צנטריפוגה במשך 10-12 דקות ב g 300 x.

4. בקשת חרוז אנטי A2B5, טיהור טור, ו ציפוי

1. לבצע חישובים עבור חיץ העמודה microbeads אנטי A2B5. להוסיף 7 טור μl הצפת לכל 1 x 10 ^{6 תאים.} מוסיפים 2 microbeads μl אנטי A2B5 לכל 1 x 10 ^{6 תאים.}
2. לשלב את כל דגימות ידי resuspending התאים בנפח כולל של 10 מ"ל של חיץ צנטריפוגות טור ב XG 300 במשך 10-12 דקות.
3. Resuspend התא גלולה ב את הכמות המתאימה של חיץ טור כפי שחושב בשלב 4.1. אם הגלולה גדולה ומשוחררת, רק להוסיף כמחצית מהיקף חיץ טור לשמור על אנטיגוף בריכוז המתאים resuspension התא.
4. לדגור על השעיית התא למשך 10 דקות ב 4 °.
5. להוסיף microbeads אנטי A2B5 (המחושב בשלב 4.1), להפוך מספר פעמים לדגור על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. בעדינות להפוך את הצינור מספר פעמים כל 10 דקות. פעמי דגירה כבר עשויות להגדיל את תשואות תא, אך עלולות להגביר את הלא ספציפי מחייב.
6. הוסף 5 כרכים של חיץ טור. אם התאים הם resuspended בנפח של 1 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל של חיץ טור, ואילו אם התאים resuspended ב 2 מ"ל, להוסיף 10 מ"ל של חיץ טור.
7. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x.
8. ברר כמה LS עמודות יהיה צורך לטיהור. טור אחד LS מספיק 15-20 x 10 ⁶ תאים בסך הכל.
9. Resuspend התא גלולה ב 1,000 μl של חיץ טור לכל עמודה LS בשימוש.
10. ראש כל עמודה LS ידי הוספת 5 מ"ל של חיץ טור. אסוף את הזרימה דרך צינור חרוטי 50 מ"ל. לאחר bu העמודהffer עבר לחלוטין דרך החדר העליון, להחיל 1,000 μl של ההשעיה תא כל עמודה ולאפשר לתאים לרוץ דרך על ידי כוח הכבידה.
    הערה: אם צפיפות תא גבוה מדי, בעמודה יכולה לרוץ לאט.
11. מיד לאחר ההשעיה תא עבר דרך העמודה, לאט להוסיף 3 מ"ל של חיץ טור כל עמודה כדי לשטוף את התאים מאוגד. אם לשטוף פועל בקלות דרך העמודה (1 טיפה לכל 30-45 שניות), לשטוף פעמיים נוספות עם 3 מ"ל של חיץ טור.
12. הסר כל עמודה ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של חיץ טור לצלול למאגר דרך העמודה בקצב מהיר באמצעות הבוכנה פלסטיק שארוז עם הטור. צולל יהיה לסלק את התאים כבול משחררים אותם מהעמודה.
13. גדל טוהר על ידי הפעלת המדגם באמצעות סיבוב השני של עמודות LS. השתמש שליש את מספר עמודות השימוש במהלך המעבר הראשון. ראש העמודות עם 5 מ"ל של חיץ טור.אפשר למאגר העמודה לעבור דרך החדר העליון.
14. מאז נפח תא השעיה יהיה גדול הרבה, חל באופן שווה 1,000 μl של השעית תא כל עמודה ולאפשר ההשעיה לעבור דרך החדר העליון של עמודה לפני החידוש עם תוספת 1,000 μl.
15. לאחר ההשעיה תא יושם לחלוטין לסיבוב השני של עמודות, לשטוף 2-3 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ טור.
16. הסר כל עמודה ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי. הוסף 5 מ"ל של חיץ טור לצלול למאגר באמצעות הבוכנה פלסטיק שארוז עם הטור. צולל יהיה לסלק את התאים כבול משחררים אותם מהעמודה.
17. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300 12-15 דקות. הגלולה צריך להופיע קומפקטית.
18. Resuspend התא גלולה ב 5-10 מ"ל של התקשורת התפשטות OPC מחומם מראש (בסיס מדיה OPC בתוספת מ"ל / PDGF-AA 20 נ"ג).
19. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
20. פלייט תאים. לדלל את התאים ל -60,000 תאים / מ"ל ​​עם התקשורת התפשטות OPC. לתוך כל שחור, ברור התחתון 24 היטב, pipet 500 μl של תאים לאורך דופן הבאר להשיג 30,000 תאים לכל טוב. מערבבים את התאים על ידי רועדת את הצלחת אופקית באמצעות הספרה שמונה תנועה. אם ביצוע assay ב 48, 96, או 384 גם הצלחות, להוסיף 15,000, 7,500, או 1,500 תאים לכל טוב, בהתאמה. מספרים אלה עשויים להיות מותאמים בהתאם למפרטי צלחת פרט.
21. הכן צלחת נפרדת עבור תרבויות שליטת בסיס יום 0. צלחת מלאה זה אמור להיות קבוע עם paraformaldehyde 4% כמפורט בסעיף 5.7, כאשר ההבחנה היא יזמה ביום 0.
22. התרבות התאים מדיה התפשטות OPC על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים ללא שינוי התקשורת.

אינדוקציה 5. בידול OPC ו קיבוע עם 4% Paraformaldehyde

הערה: כאשר בודקים את ההשפעה של מולקולות קטנות על oligodendrogenesis, אנו שגרנו dissolvתרופות דואר ב sulfoxide דימתיל (DMSO) להכין 1,000x מניות שניתן לאחסן מכן ב -80 ° C ומדולל ישירות לתוך התקשורת SATO כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1% DMSO. ראינו שום שינוי או OPC התפשטות או בידול באמצעות ריכוז זה של DMSO (מידע לא מוצג).

1. התקשורת טרום חמים OPC בסיס ל -37 מעלות צלזיוס, להפשיר מניות טיפול תרופתי לטמפרטורת החדר. בעת ביצוע טיפולים בשני עותקים, להכין כ 1.25 מ"ל של התקשורת לכל קבוצת טיפול צינור 1.5 מ"ל. לקבלת דוגמיות בשלושה עותקים, השתמש צינורות צנטריפוגה קיבולת 2 מ"ל לתת דין וחשבון על רפוי.
2. הכן את תערובות מאסטר טיפול בארות לשכפל ידי דילול מניות טיפול ישירות לתוך בסיס מדיה OPC. מערבולת בקצרה או לערבב בעדינות כל mastermix כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של הטיפול.
3. כן 45 ננומטר triiodothyronine (T ₃₎ כמו שליטה החיובית הרכב המתאים כמו שליטה השלילית. לדלל 10 מ"מ T ₃ מניות1: 1,000 ב 1 מ"ל של בסיס מדיה OPC ולאחר מכן להמשיך לדלל בתמהיל מאסטר טיפול להפחתת הריכוז הסופי של DMSO במידת הצורך.
4. לשאוב את התקשורת מן בקבוצת טיפול אחת בארות התרבות בכל פעם כדי למנוע התייבשות תאים. השתמש טיפ pipet 200 μl על סוף pipet פסטר זכוכית כדי למנוע גירוד חומר שחור מן הצדדים של הבאר לתוך התרבות.
5. לאט לאט להוסיף 500 μl של mastermix טיפול לאורך דופן הבאר באמצעות pipet 1 מ"ל.
6. דגירת התרבויות עבור מסגרת הזמן הרצויה, ביצוע חילוף תקשורת מלאה עם תקשורת טיפול טריה כל 2-3 ימים. אנו שגרתי להתבונן MBP ⁺ תרבות 30-40% לאחר 4 ימים בתקשורת בידול.
7. בסוף תקופת הטיפול הרצוי, להכין paraformaldehyde 4% טרי (PFA) או להפשיר מלאי קפוא לטמפרטורת החדר. זהירות: PFA מאוד רעיל צריך להיות מוכן במנדף.
8. לשאוב התקשורת ולאט לאט מוסיפים 4001; l של PFA לצד הבאר כדי לתקן את התאים. הדגירה הצליח במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
9. לשאוב PFA ולאט לאט להוסיף 500 μl של D-PBS סטרילי (עם Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ לצד הבאר כדי לשטוף את התאים. חזור על לשטוף סך של פי שניים יותר. אין לשאוב לשטוף סופי.
10. לעטוף את הצלחת parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עיבוד מאוחר יותר או להמשיך ישירות לשלב הבא. צלחות יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות.

6. Immunocytochemistry וכימות של חלבון המיאלין הבסיסי

הערה: בעת ביצוע נהלי טיפול נוזל ב 24 הצלחות היטב, מומלץ לעבוד מהר כדי למנוע התייבשות התאים. כאן, שימוש aspirator ואקום רב ערוצית pipet רב ערוצית מומלץ.

1. תביאו את הצלחת בטמפרטורת החדר, לשאוב את הבארות, ולהוסיף 250 μl של D-PBS (עם Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ המכיל 0.1% Triton X-100 ו -5%עז בסרום נורמלי (NGS). דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד מסלולית עדין.
2. הכן את פתרון הדגירה העיקרית על ידי דילול חד שבטי עכבר אנטי MBP נוגדן 1: 1,000 ו הארנב polyclonal אנטי יקטין נוגדן 1: 200 ב D-PBS (עם Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ המכיל 5% NGS. לחלופין, הארנב polyclonal אנטי Olig2 ב 1: 1,000 ניתן להשתמש לנורמליזצית oligodendrocyte ספציפית בתרבויות גליה מעורבות. הכן מספיק פתרון עיקרי להכיל 250 μl לכל טוב.
3. דגירת נוגדנים עיקריים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במשך 16-18 שעות עם רעד מסלולית עדין.
4. לשאוב את הפתרון הדגירה העיקרי לשטוף את התאים 3 x 10 דקות עם 500 μl של D-PBS (עם Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ בטמפרטורת החדר עם רעד מסלולית עדין.
5. בעוד שטיפת הצלחת, להכין את פתרון דגירה משני על ידי דילול אנטי עכבר 680 ו-ארנב נגד 800 נוגדנים 1: 500 ב D-PBS (עם Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺⁾ המכיל 5% NGS. מזעור החשיפה אור הסביבה בעת הכנת פתרון זה.
6. לשאוב לשטוף סופי ולהוסיף 250 μl של פתרון דגירה משתיים. הגנו על צלחת מפני אור דגירה אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד מסלולית עדין.
7. לשאוב את הפתרון הדגירה משני ולשטוף בארות 3 x 10 דקות עם 500 μl של D-PBS (עם Ca ^{2 + ו} Mg ²⁺⁾ בטמפרטורת החדר עם רעד מסלולית עדין.
8. סרוק את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה מסוגלת לאתר 700 ננומטר ו 800 פליטת קרינת ננומטר. כנקודת מוצא, לקבוע את מוקדי לקזז 3 ורגישויות 1.5 עבור MBP, 5.0 עבור אקטין, ו -3.5 עבור Olig2. התאם את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי להימנע מחשיפת יתר אות.
9. לכמת את מידת oligodendrogenesis בשיטות אוטומטיות למחצה מבוססי תוכנה.
   1. השימוש בתוכנה, להגדיר את מצב ניתוח הצלחת "24 ובכן" וליישר במעגלים סביב tהוא ההיקף החיצוני של בארות סרק. הגדר את ערוץ נורמליזציה "800" ולייצא את עוצמות הקרינה מוחלטת ביחס עבור 700 ננומטר (MBP) ו -800 ננומטר (Olig2 / אקטין) ערוצים.
   2. מחלקים את עוצמת ב 700 ננומטר מעוצמת ב 800 ננומטר כדי לתת ביטוי MBP מנורמל ביחידות הקרינה היחסית. החישוב ממוצע של המדידות לשכפל ולהרחיב את הביטוי אל יום 0 + שולט PDGF לפי הצורך לניתוח.

תוצאות

OPCs A2B5 החיובי מבודדים באמצעות בחירת תא חיובית באמצעות מערכת הפרדת עמודה מגנטית. לפני תחילת ההליך בבידוד, המוח כולו יוסר גורי חולדה כי הם בין P5 ו P7. ברגע שהמוח כולו מנותק בהצלחה מהגולגולת, נורות המוח קטנת ההרחה מוסרות באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה מהירה ואמינה לבידוד OPCs עכברוש וכימות ב oligodendrogenesis במבחנה בתגובה לגורמים הניסיונות. באמצעות סלקציה חיובית, תשואות גבוהות של OPCs קיימא וטהור משמשים במישרין למטרות ניסויים. שיטה זו מייעלת את הבידוד, culturing, וצעדי הבידול לתוך מסגרת 1 ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor