Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

Resumo

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Resumo

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Introdução

condução do nervo eficiente no sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) requer a mielinização dos axónios por oligodendrócitos. Durante o desenvolvimento, oligodendrócitos surgem a partir de um conjunto de células progenitoras de oligodendrócito (OPCs) que estão pensados ​​para migrar das zonas do ventrículo do cérebro anterior e do tubo neural em desenvolvimento ^1. Depois de OPCs migração diferenciar em oligodendrócitos, maduros myelinating que não só facilitar a propagação do impulso eficiente, mas também fornecer axônios com suporte trófico ^2. O adulto CNS mantém uma população abundante de OPCs que estão dispersos em toda a matéria cinzenta e branca que compreende cerca de 5-8% de todas as células ^3. Após um insulto desmielinizante, OPCs migram para o local da lesão, proliferar, diferenciar e para substituir as bainhas de mielina perdidas ou danificadas em axónios expostas. No entanto, em algumas configurações de doença / lesão, este processo é encontrado para ser ineficiente ou pode falhar completamente ^4. Enquantodesmielinização crónica é pensado para aumentar a carga de doença, oligodendrogenesis eficiente e remielinização pode aliviar os sintomas ^5. Tem sido, portanto, de interesse para o estudo OPCs in vitro para determinar o efeito dos factores experimentais sobre oligodendrogenesis.

Visão sobre as diferentes fases de diferenciação de oligodendrócitos tem sido possível pela identificação de marcadores de células específicas do estágio. A auto-renovação de células progenitoras iniciais são definidas pela sua expressão de plaquetas derivadas de receptores de factor de crescimento alfa (PDGFRα), antigénio neuronal / glia 2 (NG2) e A2B5 ^6-8. Como OPCs iniciar o seu programa de diferenciação e retirar-se do ciclo celular, eles regular negativamente a expressão destes marcadores e começam a expressar proteínas indicativas de premyelinating incluindo oligodendrócitos cíclica-fosfodiesterase de nucleótidos 3'-(CNPase) e O4. Finalmente, a sua diferenciação em oligodendroc mais maduroytes é caracterizada pela expressão de proteínas associadas à mielina, incluindo a glicoproteína associada à mielina (MAG), proteína proteolipidica (PLP), e proteína básica de mielina (MBP). MBP é uma proteína de membrana periférica intracelular e um grande componente da bainha de mielina. Camundongos sem MBP desenvolver um fenótipo grave em que a mielinização do SNC é significativamente diminuir, levando a tremores, convulsões e morte precoce ^9,10. Este papel importante de MBP na mielinização tem levado ao seu uso como um marcador de diferenciação de oligodendrócitos in vitro e in vivo ^11.

Quantificação da MBP pode ser conseguido usando várias metodologias diferentes. A análise de Western blot e RT-PCR para permitir que a quantificação dos níveis de MBP sob diferentes regimes de tratamento. Imunocitoquímica é uma abordagem qualitativa comum que também pode ser quantitativa, quando são usados ​​métodos de microscopia baseado em câmera. Embora estes sistemas sejam fiáveis ​​e fundamentalo estudo da diferenciação de oligodendrócitos, cada um tem as suas próprias desvantagens que limitam a sua utilização na triagem de drogas. Em primeiro lugar, a quantidade de OPCs primárias que são necessários para RT-PCR e análise por Western blot reduz o número de variáveis ​​que podem ser examinados simultaneamente. Embora a exigência celular para imunocitoquímica é muito menor, um tempo considerável deve ser dedicado a cada experiência, se a quantificação é o objetivo. Numerosos imagens devem ser capturados e, em seguida quantificado para facilitar a análise experimental. Estas advertências tornam-se obstáculos importantes a considerar para estudos que requerem avaliação de alto rendimento. Descrevemos aqui um método que utiliza os aspectos fundamentais de tanto a imunocitoquímica e metodologias de Western blot para quantificação de mielina, enquanto reduz significativamente tanto o número de células necessário para completar o tempo e a análise quantitativa.

Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e Johns Hopkins School of Medicine.

1. Preparação de placas de ensaio, Soluções de ações e OPC Base de mídia

Nota: A base de OPC rato media (Sato) descritos aqui foi derivada de estudos publicados anteriormente ^12,13. formulações de meios alternativos também podem ser compatíveis com este procedimento.

1. Ressuspender poli-L-lisina (PLL) a uma concentração de 10 ug / ml em água desionizada estéril. Pipete 400 pi da PLL diluída para cada poço de uma parte inferior 24 do tecido bem prato preto de parede, claro grau de cultura.
2. Brasão placas de cultura de tecidos para 2 horas em um tecido C 37 ° incubadora de cultura ou durante a noite em um 4 ° C geladeira.
3. Aspirar PLL de pratos revestidos, pelo menos, 20 min antes do plaqueamento. Permitir que o restante PLL para secar a partir do poço, colocando placas de 24 poços, com a tampa parcialmente aberta numa cultura de tecidoscapuz. Verifique se os poços estão completamente secos antes do plaqueamento OPCs isoladas. As células não irá aderir ao plástico que tenha PLL líquido presente.
4. Preparar solução de N-acetil-L-cisteína (NAC) (1.000X): Dissolve-se 100 mg de N-acetil-L-cisteína (NAC) em 20 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
5. Prepare solução de hidrocortisona (1.000 vezes): Adicionar 1 ml de etanol para 1 mg de hidrocortisona e agite para dissolver. Adicionar 19 ml de DMEM, misturar a solução, alíquota e armazenar a -20 ° C. A adição de hidrocortisona aos meios de comunicação de base foi mostrado para melhorar a sobrevivência de células da glia ^14.
6. Preparar a solução da d-Biotina (5,000x): Dissolve-se 2,5 mg de d-biotina em 50 ml de PBS. Adicionar 1-2 x 5 gotas uL de NaOH 0,1 N para ajudar na dissolução. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
7. Preparar a solução da insulina (100x): Dissolver 25 mg de insulina em 50 mL de água de grau de cultura de tecidos. Adicionar 250 ul OF 1 N de HCl e misturar até que a solução é límpida. Esterilizar com um filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C durante até 6 semanas.
8. Preparar a solução estoque Sato (100x):
   1. Preparar a solução da progesterona (25 ug / ul): Dissolve-se 2,5 mg de progesterona em 100 ul de etanol.
   2. Preparar a solução de estoque de selenito de sódio (400 ng / ul): Dissolve-se 4 mg de selenito de sódio em 100 mL de 0,1 N NaOH. Adicionar 10 ml de DMEM e misturar.
   3. A 100 ml de DMEM, adicionar 1 g de apo-transf errina, 1 g de albumina de soro de bovino, e 160 mg de putrescina e misturar até dissolver completamente. Adicionar 25 ml de solução de estoque de progesterona, 1.000 ml de solução de estoque selenito de sódio, e misture. Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
9. Prepare OPC base de mídia: por 100 ml de DMEM (com 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamina, e 110 mg / l de piruvato de sódio), adiciona-se 100 ul de NAC, 100 ul de hidrocortisona, 20 ul d-Biotina, 1 ml insulina, 1 ml estoque Sato, 100 ul oligoelementos B,2 mL de B-27, suplemento (50x), e 1 ml de penicilina / estreptomicina (100x). Esterilizar com um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
10. Preparar a solução de estoque de PDGF-AA (1.000X): Dissolve-se 250 ug em 12,5 ml de PBS com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) para perfazer uma solução de 20 ug / ml. Alíquotas e armazenar a -80 ° C.
11. Prepare OPC proliferação meios: meios de base OPC suplementado com 20 ng / mL de PDGF-AA.
12. Prepare a mídia de diferenciação OPC: media de base OPC suplementadas com 45 Nm triiodotironina.
13. Preparar tampão de coluna: a 500 ml de PBS, adicionar 2,5 g de BSA e 2 ml de ácido etilenodiaminotetra-acético 0,5 M (EDTA) e ajustar o pH para 7,2. Esterilizar com um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.

2. Rat Dissection Cérebro

Nota: filhotes P5-P7 ratos são usados ​​neste protocolo. Cada córtex filhote de rato produz cerca de 1,5-2,0 x 10 células positivas ⁶ A2B5.

1. Esterilizar todo o equipamento de dissecção usando um 2506; C talão aquecida esterilizador.
2. Adicionar 15-20 mL de PBS (sem ^Ca 2+ e Mg ²⁺⁾ para tubos de 50 mL cónicos. Um tubo de 50 ml é suficiente para 3-4 córtices filhote de rato. Coloque 50 ml tubos cônicos no gelo. Use 50 ml tubos cônicos para segurar tecido do córtex cortado durante a dissecção.
3. Adicionar frio PBS a um 10 centímetros placa de Petri. Este prato vai ser utilizada para dissecação sob a luz do microscópio.
4. Sacrificar filhotes de ratos por decapitação com grandes tesouras cirúrgicas. Spray de cabeça com 70% de etanol.
5. Extrai-se a Whole Brain
   1. Com uma tesoura pequena cortar a pele abaixo da linha média e atrás das orelhas e retalhos de pele casca de volta. Cortar o crânio para baixo da linha média a partir do tronco cerebral e terminando no olhos. Ter cuidado para não cortar muito profundamente, a fim de preservar a estrutura do córtex subjacente.
   2. Faça dois cortes laterais inferior ao cerebelo através da inserção de pequenas tesouras cirúrgicas no forame magno. Faça um corte adicional entre os olhos, formigaerior para os bulbos olfatórios.
   3. Retire cuidadosamente cada metade do crânio de volta. Remover todo o cérebro e lugar no 10 centímetros placa de Petri com PBS frio.
6. Sob o microscópio de luz dissecção, remover os bulbos olfatórios e cerebelo com pinça cirúrgica finas.
7. Virar o cérebro de modo que a superfície ventral é visível ao microscópio óptico.
8. Usando fórceps finos rectas executar uma dissecção romba através da colocação dicas pinças fechadas entre o córtex e hipotálamo a uma profundidade de cerca de 2/3 do cérebro. Uma vez que uma pinça estão no lugar permitir que as extremidades para abrir. Repita para o outro hemisfério.
9. Provoque o córtex do hipotálamo e regiões do mesencéfalo.
10. Remover o hipotálamo, tálamo e mesencéfalo, segurando o mesencéfalo, na sua superfície posterior e de raspagem em direcção a extremidade anterior do cérebro. Cortar as ligações anteriores.
11. Remover o hipocampo por repicante-o para fora e, em seguida, cortando a sua ligação aocórtex usando pinça fina dissecação dobrados.
12. Remover striatum restante, a demolição-lo a partir do córtex subjacente num movimento exterior diagonal usando pinça fina dissecação dobrados.
13. Limpar qualquer vasos sanguíneos e meninges da superfície ventral do córtex.
14. Virar o cérebro de modo que a superfície dorsal é visível. Meninges e vasos sanguíneos deve ser aparente. meninges casca do córtex subjacente usando uma pinça de dissecção fina. Começar a descascar a partir do local de fixação bulbo olfativo.
15. Completar os passos 2,4-2,14 para um total de 3-4 filhotes de ratos.
16. Coloque 3-4 dissecados córtices filhote de rato em uma placa de Petri seca e cortar com uma lâmina de barbear esterilizada até 1 mm pedaços x 1 mm sejam alcançados. Recolha de tecido por lavagem prato com PBS de um tubo de 50 ml (passo 2), em seguida, colocar de volta no gelo.

3. enzimática e dissociação mecânica tecidual

Nota: Para esta etapa, um kit de dissociação neural baseada em papaína é recomendado. usando NeKit de dissociação ural (P), passos especiais que são óptimas para o isolamento de OPC são descritos.

1. Prepara-se o primeiro enzima de dissociação por diluição de enzima P com o tampão apropriado. O conteúdo de cada cónico de 50 ml (1 amostra) será ressuspensas com um total de 1.950 ul de mistura de enzimas. Coloque a mistura em um banho de enzima em 37 ° C durante 10 min.
   1 Amostra: 1.900 ul de tampão + 50 ul de enzima papaína
2. Girar todos os 50 ml tubos cônicos contendo 3-4 cubos córtices filhote de rato a 300 xg por 3 min.
3. Aspirar o sobrenadante e adicionar 1,950 ml de solução de enzima a cada tubo de amostra e separar o sedimento por inversão do tubo e agitação suave.
4. Incubar num tecido 37 ° C incubadora de cultura durante 15 minutos com rotação do tubo contínuo.
5. Durante os últimos 5 minutos da incubação, a preparação da segunda mistura de enzima A. Diluiu-se a enzima no seu tampão apropriado. vai ser adicionado um total de 30 ulpara cada 50 ml de tubos de amostra cónica.
   Amostra 1: 20 ul de tampão + 10 ul de enzima
6. Uma vez completada a incubação é adicionar 30 ul da segunda mistura de enzima a cada tubo e inverta para misturar.
7. Usando uma pipeta de Pasteur de vidro ligada a um controlador de pipeta, dissociar o tecido mecanicamente por pipetagem de 10-15 vezes ou até que os pedaços de tecido são reduzidos em tamanho e a solução tornou-se turva. Devolver a amostra de tecido a 37 ° C incubadora de cultura durante 15 minutos com rotação contínua.
8. Pipetar cada amostra de homogenato de tecido 10-15 vezes utilizando uma pipeta de 1 ml.
9. Pipetar cada amostra de homogenato de tecido 15-20 vezes utilizando uma pipeta de 200 uL
10. Retornar todas as amostras para o tecido C 37 ° incubadora de cultura durante 10 minutos com rotação contínua.
11. Adicionar 10 ml de PBS (com Ca ^{2+ e Mg 2+)} a cada amostra e filtrar o homogenato através de um filtro de poro de 40 colocado ao longo de um m 50l tubo. Lavar o filtro com um adicional de 1-2 ml de PBS.
12. Pool Todas as amostras de homogenato para um tubo cónico de 50 ml e adquirir uma contagem de células total.
13. Depois de realizar a contagem de células, dividir uniformemente o homogenato em tubos de 15 mL cónicos (um tubo para cada amostra). Centrifugar durante 10-12 min a 300 x g.

4. Anti-A2B5 Bead Aplicação, purificação em coluna e Galvanização

1. Efectuar cálculos para tampão de coluna e microesferas anti-A2B5. Adicionar tampão de 7 ul coluna para cada células 1 x 10 ^6. Adicionar 2 mL microesferas anti-A2B5 células por cada 1 x 10 ^6.
2. Combinar todas as amostras por ressuspensão das células num volume total de 10 ml de tampão de coluna e centrifugar a 300 xg durante 10-12 min.
3. Ressuspender o sedimento de células em uma quantidade apropriada de tampão de coluna, como calculado no passo 4.1. Se o sedimento é grande e solto, só adicionar aproximadamente metade do volume de tampão de coluna para manter o anticorpo a uma concentração adequada na resuspensão de células.
4. Incubar a suspensão de células durante 10 min a 4 ° C.
5. Adicionar microesferas anti-A2B5 (calculado no passo 4.1), inverter várias vezes e incuba-se a 4 ° C durante 30-60 min. Inverta suavemente o tubo várias vezes a cada 10 min. tempos de incubação mais longos podem aumentar os rendimentos de células, mas pode aumentar a ligação não específica.
6. Adicionam-se 5 volumes de tampão de coluna. Se as células são ressuspensas num volume de 1 ml, adicionam-se 5 ml de tampão de coluna, enquanto que, se as células são ressuspensas em 2 ml, adicionar 10 ml de tampão de coluna.
7. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.
8. Determinar quantas colunas LS serão necessários para a purificação. Uma coluna LS é suficiente para 15-20 x 10 ⁶ células totais.
9. Ressuspender o sedimento de células em 1,000 mL de tampão de coluna por coluna LS a ser utilizado.
10. Primeiro cada coluna LS por adição de 5 ml de tampão de coluna. Recolhe-se o fluxo através de um tubo de 50 ml. Uma vez que os bu colunaffer tenha passado completamente através da câmara superior, aplicam-se 1.000 mL da suspensão celular a cada coluna e permitir que as células a ser executado por meio de, por gravidade.
    Nota: Se a densidade de células é demasiado elevada, a coluna pode executar lenta.
11. Imediatamente após a suspensão de células foi passada através da coluna, adiciona-se lentamente 3 ml de tampão de coluna para cada coluna para lavar as células não ligadas. Se a lavagem se facilmente que atravessa a coluna (1 gota em cada 30-45 seg), lavar duas vezes com 3 ml de tampão de coluna.
12. Remover cada coluna e colocá-lo em um tubo cônico de 15 ml. Adicionar 5 ml de tampão de coluna e mergulhar o tampão através da coluna a uma taxa rápida utilizando o êmbolo de plástico que é fornecido com a coluna. Mergulhando vai desalojar as células ligadas liberando-os da coluna.
13. Aumentar a pureza executando a amostra através de uma segunda rodada de colunas LS. Use de um terço do número de colunas utilizadas durante a primeira passagem. Primeiro as colunas com 5 ml de tampão de coluna.Permitir que o tampão de coluna para passar através da câmara superior.
14. Uma vez que o volume de suspensão de células será muito maior, aplicar uniformemente 1.000 ul de suspensão celular a cada coluna e permitir que a suspensão passe através da câmara superior da coluna antes de reabastecer com um adicional de 1.000 mL.
15. Uma vez que a suspensão de células foi completamente aplicada à segunda volta das colunas, lavar 2-3 vezes com 3 ml de tampão de coluna.
16. Remover cada coluna e colocá-lo ao longo de um tubo de 15 ml estéril. Adicionar 5 ml de tampão de coluna e mergulhar o tampão usando o êmbolo de plástico que é fornecido com a coluna. Mergulhando vai desalojar as células ligadas liberando-os da coluna.
17. Centrifugar a suspensão de células a 300 xg durante 12-15 min. O sedimento compacto deve aparecer.
18. Ressuspender o sedimento celular em 5-10 ml de meio de proliferação OPC pré-aquecido (OPC meio básico suplementado com FCDP-AA 20 ng / ml).
19. Contar as células usando um hemocitômetro.
20. Placa as células. Dilui-se as células a 60.000 células / ml com meios proliferação OPC. Em cada preto, claro inferior 24 bem, pipeta 500 uL de células ao longo do lado do poço para se obter 30.000 células por poço. Misture as células agitando a placa horizontalmente usando uma figura oito movimento. Se realizar o ensaio em 48, 96, ou 384-se placas, adicionar 15.000, 7.500, ou 1.500 células por poço, respectivamente. Estes números podem ser ajustadas dependendo das especificações da placa individuais.
21. Prepare um prato separado para o dia 0 culturas de controlo da linha de base. Esta placa deve ser fixada com paraformaldeído a 4%, conforme descrito no capítulo 5.7, quando a diferenciação é iniciada no Dia 0.
22. Cultura das células em meios OPC proliferação a 37 ° C durante 3 dias, sem mudança de meio.

5. Indução de OPC Diferenciação e fixação com paraformaldeído a 4%

Nota: Ao testar o efeito de pequenas moléculas em oligodendrogenesis, nós rotineiramente dissolve drogas em dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar stocks 1000X, que podem então ser armazenadas a -80 ° C e diluídas directamente para o meio de SATO para obter uma concentração final de 0,1% de DMSO. Temos observado nenhuma alteração em ambos os OPC proliferação ou diferenciação utilizando esta concentração de DMSO (dados não mostrados).

1. Pré-aquecer media base de OPC para 37 ° C e descongelar os estoques de tratamento de drogas à temperatura ambiente. Ao realizar tratamentos em duplicata, prepare aproximadamente 1,25 ml de meio por grupo de tratamento em um tubo de 1,5 ml. Para amostras em triplicado, use 2 tubos capacidade ml de centrífuga para explicar folga.
2. Prepare as misturas principais de tratamento para poços replicados por diluição de stocks de tratamento diretamente em media base de OPC. Resumidamente vórtice ou misturar suavemente cada mastermix para assegurar uma distribuição homogénea do tratamento.
3. Preparar 45 nM de tri-iodotironina _(T3), como controlo positivo e do veículo adequado, como controlo negativo. Diluir T 10 mM _stock 31: 1.000 em 1 ml de meio de base e OPC depois dilui-se ainda mais na mistura principal tratamento para reduzir a concentração final de DMSO, se necessário.
4. Aspirar a mídia do poços de cultura de um grupo de tratamento de cada vez, de modo a evitar a secagem das células. Usar uma pipeta de 200 uL ponta na extremidade da pipeta de Pasteur de vidro para evitar raspar material preto a partir dos lados do poço e para a cultura.
5. Adiciona-se lentamente 500 ul de mastermix tratamento ao longo do lado do poço utilizando uma pipeta de 1 ml.
6. Incubar as culturas durante o período de tempo desejado, realizando uma troca de mídia completa com media de tratamento fresco a cada 2-3 dias. Rotineiramente observar um MBP 30-40% ⁺ cultura após 4 dias em media diferenciação.
7. No final do período de tratamento desejado, preparar fresco paraformaldeído a 4% (PFA) ou um lote congelado descongelar até à temperatura ambiente. CUIDADO: PFA é extremamente tóxico e tem de ser preparado de um exaustor de fumos.
8. Aspirar a mídia e adicionar lentamente 4001; L de PFA ao lado do poço para fixar as células. Incubar a placa durante 20 minutos à temperatura ambiente.
9. Aspirar o PFA e adiciona-se lentamente 500 ul de D-PBS estéril (com Ca ^{2+ e Mg 2+)} para o lado do poço para lavar as células. Repetir a lavagem um total de mais duas vezes. Não aspirar a lavagem final.
10. Envolva a placa em parafilme e armazenar a 4 ° C para posterior processamento ou para proceder directamente o próximo passo. As placas podem ser armazenadas durante várias semanas.

6. Imunocitoqu�ica e Quantificação da Proteína Básica de Mielina

Nota: Quando a execução de procedimentos de manuseamento de líquidos nas placas de 24 cavidades, recomenda-se trabalhar rapidamente, para evitar a secagem das células. Aqui, a utilização de um aspirador de vácuo multi-canal e pipeta de multi-canal são recomendados.

1. Traga a placa à temperatura ambiente, aspirar os poços, e adicionar 250 ul de D-PBS (com Ca ^{2+ e Mg 2+)} contendo 0,1% de Triton X-100 e 5%soro de cabra normal (NGS). Incubar a placa a temperatura ambiente durante 1 h com agitação suave orbital.
2. Preparar a solução de incubação por diluição primário monoclonal de ratinho anti-MBP de anticorpo de 1: 1000 e o anticorpo policlonal de coelho anti-Actina 1: 200 em D-PBS (com Ca ^{2+ e Mg 2+)} contendo 5% de NGS. Alternativamente, policlonal de coelho anti-Olig2 a 1: 1000 pode ser utilizado para normalização específica de oligodendrócitos em culturas gliais mistas. Preparar a solução primária suficiente para acomodar a 250 ul por poço.
3. Incubar anticorpos primários a 4 ° C durante a noite para 16-18 horas com agitação orbital suave.
4. Aspirar a solução de incubação primária e lavar as células 3 x 10 min com 500 ul de D-PBS (com Ca ^{2+ e Mg 2+)} à temperatura ambiente com agitação suave orbital.
5. Enquanto lavagem da placa, preparar a solução de incubação por diluição secundário anti-ratinho de 680 e anticorpos de coelho anti-800 1: 500 em D-PBS (com Ca ²⁺ e Mg ²⁺⁾ contendo 5% de NGS. Minimizar a exposição de luz ambiente ao preparar esta solução.
6. Aspirar a lavagem final e adicione 250 ml de solução de incubação secundário. Proteger a placa de luz e incubar-la à temperatura ambiente durante 1 h com agitação suave orbital.
7. Aspirar a solução de incubação secundária e lavar os poços 3 x 10 min com 500 ul de D-PBS (com Ca ^{2+ e Mg 2+)} à temperatura ambiente com agitação suave orbital.
8. Digitalizar a placa usando um sistema de imagem capaz de detectar 700 nm e 800 nm emissões de fluorescência. Como ponto de partida, defina o deslocamento para 3 e sensibilidades a 1,5 para MBP, 5.0 para a actina, e 3,5 para Olig2 focal. Ajuste os valores de sensibilidade, conforme necessário, para evitar a exposição excessiva do sinal.
9. Quantificar a extensão da oligodendrogenesis usando métodos baseados em software semi-automatizados.
   1. Usando o software, defina o modo de análise de placa para "24 Bem" e alinhar círculos em torno de tele perímetro exterior dos poços digitalizados. Ajuste o canal de normalização para "800" e exportar as intensidades totais e relativas de fluorescência para a 700 nm (MBP) e 800 nm canais (Olig2 / actina).
   2. Dividir a intensidade a 700 nm, por a intensidade a 800 nm para dar a expressão de MBP normalizada em unidades de fluorescência relativa. Calcule a média de medições repetidas e dimensionar a expressão para o Dia 0 controles + PDGF conforme necessário para a análise.

Resultados

OPCs A2B5-positivas são isoladas através de selecção celular positiva usando um sistema de separação coluna magnética. Antes do procedimento de isolamento, o cérebro inteiro é removido filhotes de ratos que estão entre P5 e P7. Uma vez que todo o cérebro é separado com sucesso a partir do crânio, as lâmpadas olfactivo e no cerebelo são removidos com pinças cirúrgicas finas (Figura 1A). A fim de isolar o tecido cortical cerebral do hipotálamo, tálamo e ...

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve um método rápido e fiável para o isolamento e quantificação de rato OPCs no oligodendrogenesis vitro em resposta a factores experimentais. Usando selecção positiva, altos rendimentos de OPCs viáveis ​​e puros são usados ​​diretamente para fins experimentais. Este método simplifica o isolamento, cultivo, e passos de diferenciação em um quadro de tempo de 1 semana, e as células fixas pode ser convenientemente armazenada a 4 ° C, durante várias ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor